髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物組織工程技術(shù)，具體是一種髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人口老齡化和人們工作、生活方式的改變，椎間盤退行性疾病越來越多，尤其是椎間盤突出等導(dǎo)致的頸肩痛、腰腿痛十分常見，病情嚴(yán)重者常需手術(shù)治療，椎間盤部分切除是脊柱外科最常采用的手術(shù)方法，然而椎間盤切除后一直沒有理想的修復(fù)重建方法。隨著組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展，椎間盤組織工程為手術(shù)后椎間盤缺損的永久性修復(fù)帶來了可會K。
[0003]近年來，用于構(gòu)建組織工程椎間盤的支架材料研究較多。如取向性PCL支架，雖然結(jié)構(gòu)規(guī)則、孔隙均勻，但成分與天然椎間盤相差很大，生物相容性差；聚已酸內(nèi)酯蘋果酸三醇/脫鈣骨基質(zhì)明膠雙相纖維環(huán)支架，雙相支架的內(nèi)外層結(jié)合不牢、容易脫落，且生物相容性差；絲素蛋白支架雖然生物相容性較好，但成分差別很大且降解速率過慢。所以，目前國內(nèi)外無論是天然仿生材料還是人工合成材料都難以達(dá)到理想的效果。
[0004]脫細(xì)胞基質(zhì)去除了細(xì)胞和可溶性蛋白等引起免疫反應(yīng)的物質(zhì)，保留了組織的天然成分，具有良好的生物相容性，能夠?yàn)榻M織細(xì)胞生存提供相近的生存環(huán)境，脫細(xì)胞基質(zhì)作為一種理想的支架載體，已得到廣泛的應(yīng)用研究，其中豬脫細(xì)胞心瓣膜、豬脫細(xì)胞膀胱、異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)已被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。
[0005]完整脫細(xì)胞髓核基質(zhì)支架也有相關(guān)報道，但髓核呈膠凍狀易散開，不易獲得完整的脫細(xì)胞髓核支架，而且該脫細(xì)胞髓核支架力學(xué)性能和可塑性差，種子細(xì)胞不易均勻分布到支架內(nèi)，不能滿足椎間盤部分缺損的修復(fù)要求。來源于結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)的明膠海綿已經(jīng)上市并應(yīng)用于臨床椎間盤退變修復(fù)的研究，但明膠海綿力學(xué)性能不足，成分和椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)相比也有較大差別。軟骨組織與髓核組織的細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分都是II型膠原和蛋白多糖，兩者的細(xì)胞在形態(tài)和功能上也十分接近，均分泌II型膠原和蛋白多糖，有學(xué)者(伍耀宏，徐寶山，楊強(qiáng)，等.以骨基質(zhì)明膠及軟骨基質(zhì)構(gòu)建一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華骨科雜志，2013，33(2): 179-185.)以脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)為髓核相制備了一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架。另有學(xué)者在一項(xiàng)“纖維環(huán)與髓核一體化雙向支架及其構(gòu)建方法”的專利(申請?zhí)?201310000722.2)中，將脫細(xì)胞髓核基質(zhì)作為髓核相制備新型一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架，但該脫細(xì)胞髓核基質(zhì)制備方法存在脫細(xì)胞不易徹底，脫細(xì)胞周期長易變質(zhì)，獲得的髓核細(xì)胞外基質(zhì)懸液不易儲存、濃度不易調(diào)節(jié)的不足。而且一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架適用于全椎間盤置換修復(fù)，而臨床上多椎間盤部分缺損。目前尚沒有將脫細(xì)胞髓核基質(zhì)和脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)相混合制備支架的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有支架所存在的上述問題，而提供一種髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架及其制備方法。
[0007]—種髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架，所述支架是由凍干的脫細(xì)胞髓核基質(zhì)與凍干的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)按照1:10~10:1的比例混合溶解，凍干后通過物理、或化學(xué)或物理與化學(xué)聯(lián)合的方式交聯(lián)而成的三維多孔海綿狀結(jié)構(gòu)。
[0008]一種髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架的制備方法，包括以下步驟:
①脫細(xì)胞髓核基質(zhì)的制備
a.將椎間盤髓核組織在0~4°C下浸泡于含有蛋白酶抑制物的Tris-HCl緩沖液中振蕩8h?48h ；
b.粉碎，采用密度梯度離心法獲取直徑為100nm-5μ m的髓核基質(zhì)微絲；
c.放入含0.5-2% TritonX-1OO 和 0.35-1.0% 脫氧膽酸鈉的 Tris-HCl 緩沖液，0~4°C下振蕩12?72h ；
d.無菌超純水清洗，用含有DNaseI和RNase A的無菌PBS緩沖液振蕩消化8?48h ;
e.無菌超純水清洗，獲得脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲懸液，凍干，冷藏備用；
②脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)的制備
a.取骨關(guān)節(jié)面軟骨，浸泡于含蛋白酶抑制物的無菌PBS緩沖液中；
b.粉碎，密度梯度離心獲取直徑為100nm-5μπι左右的軟骨基質(zhì)微絲；
c.將軟骨基質(zhì)微絲放入含蛋白酶抑制物和0.5-2% TritonX-1OO的Tris-HCl緩沖液中，0~4°C下振蕩12?72h ；
d.無菌超純水清洗，用含DNaseI和RNase A的PBS緩沖液震蕩消化8?48h ;
e.無菌超純水清洗，獲得脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)微絲懸液，凍干，冷藏備用；
③支架的構(gòu)架和交聯(lián)
a.按質(zhì)量比為凍干的脫細(xì)胞髓核基質(zhì):脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)=1:10~10:1的比例稱取以上兩種物質(zhì)并溶于去離子水中，配成質(zhì)量體積比為0.6%~6%的乳懸液；
b.將上述乳懸液注入模具中，排出模具中的氣體；
c.放入-20~-80°C冷凍l~48h;再放入冷凍干燥機(jī)中，待其完全凍干；
d.將完全凍干的樣品在碳化二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液中交聯(lián)Ih?48h;或?qū)⑼耆珒龈傻臉悠吩诰┠崞饺芤褐薪宦?lián)lh~48h ;或?qū)⑼耆珒龈傻臉悠吩谌╊惢衔锶芤褐薪宦?lián)Ih?48h ;或?qū)⑼耆珒龈傻臉悠分糜谧贤饩€下交聯(lián)；或?qū)龈傻臉悠废冉?jīng)紫外線照射后采用化學(xué)試劑聯(lián)合交聯(lián)；
e.獲得的樣品進(jìn)行清洗，烘干，滅菌。
[0009]所述步驟①a、C、d和步驟②c、d中振蕩頻率為80~250r/min。
[0010]所述步驟①a中Tris-HCl的濃度為50mmol/L，pH7.5 ;步驟①a和②a、c中蛋白酶抑制物為苯甲基磺酰氟，濃度為0.020-0.050mmol/Lo
[0011]步驟①d和②d中DNase I和RNase A的濃度分別為0.72?50U/ml、0.72?I U/mlo
[0012]步驟③d中碳化二亞胺的濃度為0.001?I m/L，N-羥基琥珀酰亞胺的濃度為
0.001 ?I m/L。
[0013]步驟③d中京尼平溶液的濃度為1%~2%。
[0014]步驟③d中醛類化合物溶液的濃度為0.01%?2.5%。
[0015]步驟③d中紫外線波長為258nm，距離光源5?10cm，交聯(lián)時間15min?8h。
[0016]本發(fā)明獲得了如下的有益效果:
①本發(fā)明所采用的髓核、軟骨材料屬于天然生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性，軟骨材料的加入與使用克服了椎間盤髓核量少不易獲取的缺點(diǎn)，利于大批量生產(chǎn)。
[0017]②通過脫細(xì)胞系列處理去除抗原成分，避免發(fā)生免疫排斥反應(yīng)、傳播疾病。
[0018]③本發(fā)明將新鮮髓核或軟骨粉碎、離心、冷凍凍干便于脫細(xì)胞和儲存(4°C冷藏可達(dá)一年)，可稱重配制懸液，易于準(zhǔn)確的調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)微絲懸液的比例和濃度。
[0019]④通過調(diào)節(jié)混合細(xì)胞外基質(zhì)微絲懸液中兩者的比例、濃度及冷凍時的溫度、降溫速率等因素，控制多孔支架的成分和微結(jié)構(gòu)，制備出具有適宜成分、孔徑和孔隙率的三維多孔支架，操作簡便。
[0020]⑤通過控制交聯(lián)時間或交聯(lián)劑濃度，調(diào)節(jié)多孔支架的生物力學(xué)特性和降解速率，使組成結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能與椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)相似。
[0021]⑥本發(fā)明所述支架呈三維多孔海綿狀結(jié)構(gòu)，力學(xué)性能好，主要成分和人椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)相似，可為種子細(xì)胞提供一個適宜的生長環(huán)境，有利于種子細(xì)胞向椎間盤細(xì)胞方向分化。
[0022]⑦本發(fā)明所述支架制備工藝簡單、制備周期短、彈性好、可塑性好、可個體化制成與椎間盤缺損大小相符合的支架，符合臨床椎間盤部分缺損的修復(fù)要求，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架的外觀圖；
圖2是本發(fā)明HE染色無細(xì)胞及無細(xì)胞碎片殘留圖；
圖3是本發(fā)明未脫細(xì)胞髓核勻漿Hochest33258染色圖；
圖4是本發(fā)明正常軟骨基質(zhì)Hochest33258染色圖；
圖5是本發(fā)明髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架的Hochest33258染色圖；
圖6是本發(fā)明髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架的番紅O染色圖；
圖7是本發(fā)明髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架的甲苯胺藍(lán)染色圖；
圖8是本發(fā)明髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架光鏡下多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖；
圖9是本發(fā)明髓核-軟骨細(xì)胞外基質(zhì)支架掃描電鏡下多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖；
圖10是MTT檢測支架浸提液培養(yǎng)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖圖；
圖11是Live/Dead染色活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上的分布圖；
圖12是Live/Dead染色死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上的分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]現(xiàn)結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0025]1、脫細(xì)胞髓核基質(zhì)的制備
將新鮮的羊椎間盤髓核組織用生理鹽水沖洗干凈，浸泡于50mmol/L的Tris-HCl緩沖液(緩沖液PH7.5，內(nèi)含有0.035 mmol/L蛋白酶抑制物——苯甲基磺酰氟PMSF)，4°C下?lián)u床(北京市六一儀器廠，WD-9405B型水平搖床)振蕩Sh ;經(jīng)粉碎機(jī)(山東九陽股份有限公司，粉碎研磨機(jī))粉碎，采用密度梯度離心法獲取直徑為100nm-5 μ m左右的髓核基質(zhì)微絲；放入含0.6% TritonX-1OO和1.0%脫氧膽酸鈉的無菌