專利名稱：以三七二醇組皂苷為有效成分的抗腫瘤藥物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體地，涉及以三七二醇組皂苷為有效成分的抗腫瘤
藥物，三七二醇組皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
三七，又名田七、人參三七，是五加科人參屬植物Panax notoginseng(Burk) F. H. Chen的根莖，是我國特產(chǎn)的珍貴藥材，主要產(chǎn)于云南、廣西等地。三七總皂苷是三七 的主要活性成分，藥理作用廣泛，如具有抗疲勞、提高耐缺氧能力、降血糖、活血化瘀、提高 機體免疫功能、清除自由基、抗炎、抗氧化等藥理作用。近年來對三七的進一步研究表明 三七總皂苷中可分為三七二醇組皂苷(PanaxadialS即onins， PDS))和三七三醇組皂苷 (Panaxtriol saponins, PTS)。到目前為止，有關三七二醇組皂苷(以三七二醇型皂苷Rbl 為主的從三七中分離提取出的有效部分)具有抑制腫瘤細胞生長的作用未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種以三七二醇組皂苷作為有效成分，并提供三七二醇組 皂苷在抗腫瘤藥物中的應用。 本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術方案得以實現(xiàn)的 三七二醇組皂苷作為有效成分抗腫瘤藥物，其特征是含有三七二醇組皂苷作為有 效成分，并含有常規(guī)藥用載體。 三七二醇組皂苷有效成分在制備抗腫瘤藥物中的應用。
三七二醇組皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應用。 本發(fā)明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物 組合物含有0. 1-99% ，優(yōu)選為0. 5-90%的本發(fā)明化合物，其余為藥物學上可接受的，對人 和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。 所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥 物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)注 射(靜注、肌注)和口服兩種形式給藥。


圖1是苔盼藍拒染法檢測PDS對Hela細胞生長的影響； 圖2是四噻唑藍(MTT)法測定PDS對Hela細胞生長的影響； 圖3是Western Blot檢測PDS降低Hela細胞中Trx蛋白表達水平； 圖4是Western Blot檢測PDS降低Hela細胞中CyclinDl蛋白表達水平。
具體實施例方式
下面描述本發(fā)明的具體實施方式
，但是本發(fā)明的內容不局限于此。本發(fā)明通過下列實施方式證明了三七二醇組皂苷能抑制腫瘤細胞的生長，但不僅限于這些實施例子。
實施例1 : 三七二醇組皂苷，用少量的匿S0溶解后，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成 注射液。 實施例2: 三七二醇組皂苷，用少量的匿SO溶解后，將其溶于無菌注射用水中，攪拌使溶解， 用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。
為了更好地理解本發(fā)明的實質，下面將用本發(fā)明的試驗例來說明本發(fā)明三七二醇
組皂苷的藥理作用結果，但不以此試驗例來限定本發(fā)明。
實驗例1 :
1、細胞 Hela細胞人宮頸癌細胞。
2、藥品及主要試劑 三七二醇組皂苷從昆明制藥集團股份有限公司獲得，一抗Anti-human Trx由日 本京都大學淀井溶司教授提供；一抗Anti-human CyclinDl購自Santa cruz ;Protein Marker,購自Fermentas公司；RPMI Medium 1640，購自Invitrogencorporation ;蛋白 質定量試劑盒(BCA法)，購自Beyotime公司;Chemiluminesentsubstrate，購自生物晶 美公司；PVDF膜，購自Millipore公司；TRIS Base,購自N0V0N公司；Acrylamide，購自 Solarbio公司；十二焼基硫酸納，購自xiamen sanlandchemicals company limited ;瓊月旨 糖、考馬斯亮藍R-250、 Aprotimin、 PMSF和NP_40，均購自Sanland-chem International InC ;TEMED，購自HUALVYUAN BIOTECHNOLOGY ;X射線膠片，購自中國樂凱膠片集團公司； 二抗affinity purified antibodyperoxidase labled goat anti-mouse lgG(H+L)HSA liquid conjugate禾口affinitypurified antibody peroxidase labled goat anti-rabbit lgG(H+L)HSA liquidconjugate，購自美國Kirkegaard & laboratories ;苔盼藍(Trypan Blue)，購自MP Biomedicals生物醫(yī)學公司；四噻唑藍(MTT)，購自美國Promega公司。
1、主要實驗儀器 BHC-1300II A/B3生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司生產(chǎn)；TS100生物倒置 相差顯微鏡，日本NIKON公司生產(chǎn)；C02培養(yǎng)箱，美國NBS公司生產(chǎn)；TS-1脫色搖床，金紜市 杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn)；電子分析天枰，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；旋渦混 合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；BYY-6C雙穩(wěn)定時電泳儀，北京六一儀器有 限公司生產(chǎn)；酶標儀，美國MD公司生產(chǎn)；J-25離心機，美國貝克曼公司生產(chǎn)；XJX-IIX射線 攝影暗匣，上海躍進醫(yī)用光學器械廠生產(chǎn)；血球計數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公 司；96孔板細胞培養(yǎng)板，BiousingBiotechnology有限公司生產(chǎn)。
實驗例2 : 苔盼藍拒染法測定Hela細胞的存活率
( — )Hela細胞株的培養(yǎng) Hela細胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培 養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。每2-3天更換培養(yǎng)基一次，細胞達約 70 % 80%融合時，傳代或用于實驗。
(二)Hela細胞的排板 用0. 25%的胰酶將貼壁的Hela細胞消化起來，1500rpm離心5min，除去胰酶。將 細胞均勻的排在直徑6cm的培養(yǎng)皿里，排板密度為IX 105cell/皿，排4板，在含有10%胎 牛血清、100U/mL青霉素和100ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95% 濕度下進行貼壁培養(yǎng)。(三)梯度濃度三七二醇組皂苷剌激 細胞培養(yǎng)過夜，換新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，將四板Hela細胞做好相應的標記，對照 組不加三七二醇組皂苷，實驗組分別用200、400、800iig/ml的濃度三七二醇組皂苷剌激， 24h后收細胞。(四)苔盼藍拒染法的活細胞計數(shù) 取5 iil的細胞懸液與5 ill 0. 4%的苔盼藍均勻混合，小心加到血球計數(shù)板的小 室里，在倒置顯微鏡下數(shù)活細胞的數(shù)目。
(五)細胞的存活率計算 存活率％ =加藥組細胞數(shù)/對照組細胞數(shù)X 100%
試驗例2 : 四噻唑藍(MTT)法測定Hela細胞的存活率
( — )Hela細胞株的培養(yǎng) Hela細胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培 養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。每2-3天更換培養(yǎng)基一次，細胞達約 70 % 80%融合時，傳代或用于實驗。
(二)Hela細胞的排板 用0. 25%的胰酶將貼壁的Hela細胞消化起來，1500rpm離心5min，除去胰酶。將 細胞均勻的排在96孔板中，排板密度為1X10、ell/孔，在含有10X胎牛血清、100U/mL青 霉素和100ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。(三)梯度濃度三七二醇組皂苷剌激 細胞培養(yǎng)過夜，換新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，對照組不加三七二醇組皂苷，實驗組分 別用200、400、800 ii g/ml的濃度三七二醇組皂苷剌激。各組設5個平行實驗。
(四)四噻唑藍(MTT)試驗 取出待測的96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10ul，繼續(xù)孵育4小時后， 3000rpm室溫下離心15min，小心去掉上清，每孔加入150ul 二甲基亞砜，小心混勻，用酶標 儀在波長570nm處測定吸光度值。
(五)細胞的存活率計算 存活率％ =加藥組A值/對照組A值X 100%
實驗例3: 三七二醇組皂苷降低Hela細胞中Trx和CyclinDl蛋白表達水平 [OO53]( — )細胞株培養(yǎng)和三七二醇組皂苷剌激處理 Hela細胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL鏈霉素的1640培養(yǎng) 基，于37°C、5% C02和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。每2_3天更換培養(yǎng)基一次，細胞達約
570 % 80%融合時，傳代或用于實驗。 將細胞接種于平板中，培養(yǎng)過夜后，三七二醇組組皂苷處理細胞。分組處理如下 對照組不加藥，實驗組分別加200ug/ml，400ug/ml，800ug/ml的三七二醇組皂苷。上述處 理后，置于37t:和5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，然后收集細胞，以提取蛋白1500rpm離 心5min收獲細胞，分別加入100ul細胞裂解液(150mM NaCl，O. 5% NP_40， 10mM Tris-HCl， pH 7.2，0.1mM PMSF，2ug/ml即rotinin， 200ug/ml NaN3)，充分混懸后于冰浴下放置裂解 50min(中間振蕩5 6次)，4。C下15000rpm離心15min，轉上清至新離心管中，-8(TC保存。
( 二 )免疫印跡
1.蛋白含量的測定 用BCA試劑盒測定將10ul標準品或待測樣本與200ulWR工作溶液混合，37。C孵 育30min，將反應管溫度冷卻至室溫。測定562nm光密度值，繪制標準曲線，并計算蛋白濃度。 2.蛋白免疫印跡(Western Blot) 總蛋白加樣量為6ug，與2X SDS凝膠加樣緩沖液混合后，95t:熱變性5min，用15% 的SDS-PAGE膠電泳分離后，將蛋白條帶用電轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶fC封閉過 夜；取出PVDF膜，用含0. 1 % Tween-20的TPBS沖洗后，加入1000倍稀釋的一抗室溫孵育 75min ;用含0. 1 % Tween-20的TPBS沖洗，加入5000倍稀釋的二抗室溫孵育75min ;用含 0. 1% Tween-20的TPBS沖洗，將PVDF膜浸入發(fā)光底物溶液中反應lmin， X射線膠片曝光。
結果表明三七二醇組皂苷能抑制Hela細胞的生長(圖l，圖2)，同時可以降低 Hela細胞中Trx和CyclinDl的蛋白表達水平(圖3，圖4)，這說明三七二醇組皂苷可用于 腫瘤的防治及治療。 硫氧還蛋白(thioredoxin， Trx)是一種普遍存在于原核生物和真核生物中的小 分子蛋白質，它與NAPDH和硫氧還蛋白還原酶組成細胞內主要的氧化還原系統(tǒng)。根據(jù)表達 部位的不同，硫氧還蛋白分為3類Trx-l、 Trx-2和spTrx。到目前為止，人類疾病中有關 Trx的研究大都集中在Trx-l。 TRX-1是生物體所必須的基因，如果選擇性地敲除小鼠的 Trx-l基因，小鼠則早期胚胎致死，不能存活(Matsui M. ， Oshima M. ， Oshima H. ， Takaku K. ， Maruyama T. ， Yodoi J. ， and Taketo M.M.Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mousethioredoxin gene. Dev. Biol. 1996，178 :179-185)。 Trx-l是細胞內一種有效的抗氧化劑，能保護細胞、減輕氧化應激所致的損傷。Trx-l能 抑制p38MAPK和凋亡信號調節(jié)激酶1相關的凋亡信號傳導途徑，增強細胞的抗凋亡能力 (Saito M. ， Nishitoh， H. ， Fujii， M. ， Takeda， K. ， Tobiume， K. ， Sawada， Y. ， Kawabata， M. ， Miyazono， K. ， and Ichijyo， H. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitorof apoptosis signal-regulating kinase(ASK)1. EMBO，1998，17 :2596-2606 ;Hashimoto S.， Matsumoto K. ， Gon Y. ， Furuichi S. ， Maruoka S. ， Takeshita I. ， Hirota K. ， Yodoi J.， and Horie T. Thioredoxin negatively regulates p38 MAPkinase activation and IL_6 production by tumor necrosis factor—alpha. Biochem. Biophys. Res. Comm皿.1999,258: 443-447.)。與對照組相比，三七二醇組皂苷能隨劑量的增加降低Hela細胞中Trx蛋白表達 水平，由于Trx具有抗凋亡，保護細胞的作用，因此三七二醇組皂苷有可能是通過降低Trx 的表達來抑制腫瘤細胞的生長。
Cyclin是20世紀80年代由Hunt等從研究卵母細胞首先發(fā)現(xiàn)的，之后在其它一些 物種中也發(fā)現(xiàn)和證實了 cyclin的存在，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的哺乳動物cyclin有14大類，它們可 分為Gl期cyclin和M期cyclin。 Cyclin的表達具有典型的周期性和時相特異性，CyclinDl 在細胞的增殖過程中起著重要作用，是G1期細胞增殖信號(Tashiro E，Tsuchiya A， Imoto M. Functions of cyclin Dlas an oncogene and regulationof cyclin Dl expression. Cancer Sci， 2007， 98 :629-635.)。很多腫瘤的發(fā)生與cyclinDl的過表達有關Chen CH， Shen J， Lee WJ， Chow SN. overexpression ofcyclin Dl and c—Myc gene products in human primary epithelial ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer, 2005，15 :878—883 ; Lantsov D， Meirmanov S， NakashimaM， Kondo H， Saenko V， Naruke Y， Namba H， Ito M， Abrosimov A， Lushnikov E， Sekine I， Yamashita Sh. Cyclin Dl over—expression in thyroid p即illarymicrocarcinoma :its association with tumour size and aberrant beta—cateninexpression. Histo—pathology，2005，47 :248—256 ;Mega S， Miyamoto M， EbiharaY， Takahashi R， Hase R， Li L， Shichinohe T， Kawarada Y， Uehara H， KanekoH， Hashimoto H， Murakami Y， Itoh T， Morikawa T， Kondo S.Cyclin Dl， E2Flexpression levels are associated with characteristics and prognosis ofesophageal squamous cell carcinoma. Dis Esophagus, 2005， 18 :109-113.)，它還調節(jié)視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb) 的磷酸化狀態(tài)(Diehl JA，Zindy F，Sherr CJ. Inhibition of cyclin Dl phosphorylation on threonine_286 prevents its r即iddegradation via the ubiquitin—proteasome pathway. Genes Dev， 1997， 11 :957-972.)。與對照組相比，三七二醇組皂苷能隨劑量的增加 降低Hela細胞中CyclinDl蛋白表達水平，由于CyclinDl是細胞周期Gl的調節(jié)蛋白，因此 三七二醇組皂苷有可能是通過降低CyclinDl的表達來抑制腫瘤細胞的生長。
權利要求
三七二醇組皂苷作為有效成分抗腫瘤藥物，其特征是含有三七二醇組皂苷作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體。
2. 三七二醇組皂苷有效成分在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，提供一種以三七二醇組皂苷為有效成分的抗腫瘤藥物，三七二醇組皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明公開了三七二醇組皂苷具有抗腫瘤活性，苔盼藍拒染法和四噻唑藍(MTT)法均表明，三七二醇組皂苷能抑制腫瘤細胞的生長；蛋白質免疫印跡法表明，三七二醇組皂苷可以降低腫瘤細胞中硫氧還蛋白和細胞周期素D1的表達水平。
文檔編號A61K36/258GK101744853SQ20091009509
公開日2010年6月23日 申請日期2009年10月26日 優(yōu)先權日2009年10月26日
發(fā)明者劉曉慧, 白潔 申請人:昆明理工大學