專利名稱：一種香菇多糖殼聚糖納米粒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物納米制劑領域，具體涉及一種香菇多糖殼聚糖納米粒及其制備方法。
背景技術：
多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，其種類繁多，結構復雜，廣泛分布于動植 物中。目前對多糖的理化性質以及生物學功能的研究較多，近年來亦有研究人員對不同來 源多糖的潛在功能進行了進一步研究與開發(fā)，使得多糖在醫(yī)藥領域的應用廣受關注。
目前多糖的一個重要的應用領域在于抗腫瘤，通過研究發(fā)現(xiàn)多糖抗腫瘤多表現(xiàn) 為一方面，通過調節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用，如調節(jié)免疫器官，影響巨噬細胞，T淋巴 細胞(Thymus d印endent lymphocyte,胸腺依賴性淋巴細胞)、B淋巴細胞(Bone marrow d印endent lymphocyte,骨髓依賴性淋巴細胞)及NK細胞(natural killer cell,自然殺 傷細胞)，激活補體系統(tǒng)等；另一方面集中在通過直接作用抑制腫瘤細胞，其機制為引起細 胞凋亡，抑制致腫瘤物激活酶，激活解毒酶，影響膜蛋白及腫瘤細胞附著，影響信號轉導等 方面。 香菇多糖作為一種免疫增強劑具有免疫調節(jié)作用，能增強NK細胞、T細胞功能，以 及誘導干擾素血中濃度增高，具有抗腫瘤、抗病毒等作用。用于治療惡性腫瘤和慢性乙肝等 病毒性疾病，在與手術、放療、化療等相結合的輔助治療中，已經(jīng)取得很好的療效。但現(xiàn)有的 多糖藥物制劑往往存在諸如穩(wěn)定性差、生物利用度不高以及對某些細胞穿透能力不強等缺 點，近年來研究人員開始將微粒制劑應用于多糖類藥物制劑的研究與開發(fā)，以克服多糖普 通制劑的缺點。目前，關于攜載多糖的微粒制劑如脂質體、微囊、微球等制備方法和質量評 價的研究，已成為多糖新型給藥系統(tǒng)研究的一個重要方向，但尚未有關于香菇多糖納米粒 的報道。 作為藥物傳遞與控釋的載體，納米粒具有緩釋性、靶向性、穩(wěn)定性等優(yōu)點，而且可 減少藥物使用劑量，減輕或避免其不良反應。同樣針對某些多糖類藥物普通制劑的靶向性、 緩釋性等的缺陷，對多糖藥物納米制劑進行研究與開發(fā)意義重大。盡管納米粒在許多化學 藥物中得到了應用，但由于香菇多糖的水溶性、大分子等一些自身的不利于包封的性質，目 前尚無有關包載香菇多糖作為抗腫瘤治療藥物的納米粒的研究報道。 申請?zhí)枮?00510018524. 4的中國專利中公開了一種用作藥物載體的殼聚糖季銨 鹽納米粒子及其制備方法和用途。殼聚糖季銨鹽納米粒子由殼聚糖季銨鹽和三聚磷酸鈉 交聯(lián)生成，粒徑為100nm 500nm。其制備方法是將殼聚糖季銨鹽溶解于蒸餾水中，在室溫 攪拌條件下加入三聚磷酸鈉溶液，交聯(lián)成納米粒子，高速離心分離，冷凍干燥，獲得殼聚糖 季銨鹽納米粒子。這種在中性條件下制備的新型納米粒子，可避免有機溶劑的副作用，所需 能量要比溶劑蒸發(fā)等普通制備方法大為降低，尤其適合用于包封敏感大分子如蛋白質類藥 物。以牛血清蛋白為模型藥，BSA的包封率可達90X，緩釋達六天以上。但該種納米粒子不 適用于攜載香菇多糖。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種香菇多糖殼聚糖納米粒，用于彌補現(xiàn)有香菇多糖納米制劑的空白，其采用殼聚糖和三聚磷酸鈉為載體材料，通過離子凝膠化法攜載香菇多糖成功制備獲得穩(wěn)定性高、包封率好的納米粒，克服了目前香菇多糖由于其具有水溶性、大分子等一些自身的不利于包封的性質而難于制備納米制劑的難題。 本發(fā)明還提供了一種香菇多糖殼聚糖納米粒的制備方法，操作簡單、安全、有效，符合環(huán)保要求。 —種香菇多糖殼聚糖納米粒，由如下重量份的原料藥和載體材料制成殼聚糖150份 250份、三聚磷酸鈉(簡稱STPP) 30份 70份和香菇多糖0. 6份 1. 5份。
進一步優(yōu)選由如下重量份的原料藥和載體材料制成殼聚糖200份 250份、三聚磷酸鈉30份 45份和香菇多糖0. 6份 1. 5份。 所述的殼聚糖(簡稱CS)是自然界中廣泛存在的陽離子聚合物，具有較好的生物相容性和生物降解性，來源廣泛，通過不同合成方法可以得到不同分子量和脫乙酰度的殼聚糖，可用于制備不同粒徑和不同香菇多糖濃度的納米粒。本發(fā)明優(yōu)選使用較為普遍的分子量為10kDa 100kDa的殼聚糖。 殼聚糖的分子量過大會造成殼聚糖和香菇多糖分子量接近，會影響后續(xù)檢測時用
離子交換法測定香菇多糖的含量，為香菇多糖殼聚糖納米粒的質量監(jiān)控帶來一定難度。 所述的殼聚糖的脫乙酰度優(yōu)選為90% 95%，因為殼聚糖的脫乙酰度過低會影
響殼聚糖質子化氨基離子的量，進而對納米粒的形成有一定影響，使形成的納米粒量過少。 所述的脫乙酰度通常用堿量法來測定，其原理是用過量的稀酸與一定量的待測殼
聚糖反應，然后用標準NaOH溶液滴定過量的酸來測量殼聚糖中自由氨基的質量百分含量
(a)，從而計算殼聚糖的脫乙酰度(即DD值)，其計算公式為DD= (a + 0. 0994) X 100%。 經(jīng)檢測，所述的香燕多糖殼聚糖納米粒的粒徑為lOOnm 500nm。 所述的香菇多糖殼聚糖納米粒的zeta電位為0 20mv。 所述的香菇多糖殼聚糖納米粒的制備方法，包括步驟 (1)將殼聚糖在醋酸或醋酸水溶液中溶脹配制成殼聚糖溶液； (2)將香菇多糖熱溶于水中配制成香菇多糖溶液； (3)先將香菇多糖溶液加入殼聚糖溶液中，調節(jié)殼聚糖溶液的pH值為4 6，再緩慢滴加三聚磷酸鈉水溶液，攪拌均勻后離心，收集沉淀，把沉淀復溶、過濾，濾液冷凍干燥，即制得香菇多糖殼聚糖納米粒。 適當?shù)卣{整殼聚糖溶液濃度或三聚磷酸鈉水溶液濃度對納米粒的制備影響不大，
但是若殼聚糖濃度過高，或三聚磷酸鈉濃度過高則會使帶負電荷的磷酸根離子與殼聚糖上
帶正電荷的質子化氨基發(fā)生分子間和分子內交聯(lián)時由于離子局部濃度過高，導致所制備的
納米粒粒徑過大，并且也可能造成所制備的納米粒濃度過高，納米粒子之間容易聚集，影響
納米粒的穩(wěn)定性。因此需要控制殼聚糖陽離子和磷酸根離子的用量。
為了得到粒徑合適，穩(wěn)定性更好的香菇多糖殼聚糖納米粒，優(yōu)選 步驟(1)中，殼聚糖溶液中殼聚糖的濃度為1. 5g/L 2. 5g/L。 為了便于步驟(3)中進行pH的調節(jié)，節(jié)約試劑，優(yōu)選質量百分濃度為0.5X
42.5%的醋酸水溶液。 步驟(2)中，香菇多糖溶液的濃度為60ii g/ml 150ii g/ml。 步驟(3)中，三聚磷酸鈉水溶液的質量百分濃度為0. 1% 1%。 沉淀復溶所用的溶劑采用常用的實驗用水(如雙蒸水)即可。 pH調節(jié)選用本領域常用的堿性試劑即可，如氫氧化鈉、氫氧化鉀等，使殼聚糖溶液
的pH值為4 6，在該pH范圍內，殼聚糖的氨基質子化程度較高，利于殼聚糖和三聚磷酸鈉
通過陰陽離子靜電作用自發(fā)形成載藥納米粒。殼聚糖納米粒作為一種納米水凝膠體系，具
有一定的溶脹度，而pH的變化可促進或抑制氨基解離而改變凝膠體系的電性和溶脹行為。
而隨著溶液pH升高，氨基離解程度降低，zeta電位降低使納米粒子穩(wěn)定性變差。 本發(fā)明先將香菇多糖加入到殼聚糖溶液中再制備成納米粒，可以形成較穩(wěn)定的納米粒。 —、香菇多糖殼聚糖納米粒的形態(tài)觀察 取適量香菇多糖納米粒加適量的雙蒸水稀釋后，加至專用銅網(wǎng)上，用質量百分濃度為0. 2%的磷鎢酸水溶液染色，在透射電子顯微鏡下觀察粒子的大小和形態(tài)，見圖1。
從圖1可看出，本發(fā)明香菇多糖納米粒粒子的大小均勻，形態(tài)相似，分布均勻。
二、香燕多糖殼聚糖納米粒的粒徑和電位測定 —定量香菇多糖納米粒，用PBS緩沖液(即吐溫-20的質量百分濃度為0. 05%、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液)稀釋至香菇多糖納米粒的質量百分濃度為0. 01% 0. 1%，利用激光粒度測定儀和電位測定儀分別測定納米粒的粒徑和電位，觀察納米粒的粒徑分布和電位，見表1和圖2。 從表1和圖2可看出，本發(fā)明香菇多糖殼聚糖納米粒的粒徑隨殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比的增加而逐漸減小，當殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比約為5. 5時，納米粒的粒徑小于220nm，納米粒的電位隨殼聚糖與三聚磷酸鈉質量比的增加而逐漸增大，一般小于22mv。
三、香菇多糖殼聚糖納米粒穩(wěn)定性考察 取適量香菇多糖殼聚糖納米粒用激光粒徑測定儀測定納米粒的粒徑，兩周后取同一批香菇多糖殼聚糖納米粒，用同樣方法測定粒徑，發(fā)現(xiàn)粒徑大小接近，幾乎無差異，表明本發(fā)明的香菇多糖殼聚糖納米粒穩(wěn)定性良好。
四、香燕多糖殼聚糖納米粒包封率和載藥量測定 由于香菇多糖和納米粒材料殼聚糖難于分離，且材料對香菇多糖吸光度的測量值影響很大，因此用普通紫外分光光度法難以測定。通過文獻查閱(Bao XF等人，Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganodermalucidum. Phytochemistry 2002 ;59(2) :175-181 ;Ch_eong J等人，Characterization ofan alkali—extracted peptidoglycan from Korean Ganoderma lucidum， Arch PharmRes 1999,22(5) :515-519 ;He Y等人，Chemical studies on immunologically activepolysaccharides of Ganoder_ma lucidum(Leyss. ex Fr. )Karst，中國中藥雜志1992，17(4) :226-228.)香菇多糖可以用二乙胺基乙基纖維素(DEAE-纖維素)陰離子交換層析法測定其含量，只要調整Tris-NaCl緩沖液的濃度，可以使香菇多糖與納米粒載體材料殼聚糖、三聚磷酸鈉在不同緩沖液濃度下出峰，達到分離檢測藥物與材料的目的。
離子交換層析由離子交換柱、恒流泵、核酸蛋白監(jiān)測儀、繪圖儀組成。實驗發(fā)現(xiàn)香菇多糖可以在緩沖液濃度為lmol/L時出峰，而納米粒材料CS和STPP分別在緩沖液濃度為
0.2mol/L、0.4mol/L時就被洗脫。 一般情況下，DEAE-纖維素用于分離酸性蛋白，而羥甲基
纖維素(CM纖維素)用于分離堿性蛋白質?？紤]到香菇多糖殼聚糖納米粒制備過程中的pH
為5左右，因此本實驗采用DEAE-纖維素交換劑，采用連續(xù)洗脫法洗脫要層析的樣品，從而
達到分離的效果。 1、標準曲線制備 用0. 2mol/L的Tris-NaCl緩沖液(市售產(chǎn)品)配制香菇多糖濃度為6mg/100mL、8mg/100mL、10mg/100mL、12mg/100mL， 15mg/100mL的香燕多糖溶液，Tris-NaCl緩沖液濃度配制三組0. 2mol/L、0. 4mol/L、1. 0mol/L。待離子交換柱平衡后，取10ml待測液上樣測量，橫流泵流速控制在5mL/min，分別用上述三種濃度的Tris-NaCl緩沖液洗脫柱體。
數(shù)據(jù)處理由于測繪儀出峰非常小，如果直接測量其峰面積，那會導致實驗誤差相當大。但是峰面積下紙張的質量與面積成正比，故實驗時把測繪儀繪制的峰小心剪下，用萬分之一天平稱量，記錄，以峰面積質量代替其面積。
2、香菇多糖含量測定 取冷凍干燥后的香菇多糖殼聚糖納米粒，用0. 2mol/L的Tris-NaCl緩沖液復溶，配置成濃度為20mg/100mL，經(jīng)超聲破壞后進樣10mL，用0. 2mol/L、0. 4mol/L、1. 0mol/L的Tris-NaCl緩沖液逐個過柱。 數(shù)據(jù)處理把測繪儀繪制的峰小心剪下，用萬分之一天平稱量，記錄。
3、計算包封率和載藥量 包封率=被包裹藥物質量+總投藥量X 100% ;
載藥量=被包裹藥物質量+納米制劑總質量X 100% ;
計算結果見表l。 表1不同質量比殼聚糖/STPP制備的香菇多糖殼聚糖納米粒的理化性質評價(n
=3，n代表測試次數(shù))
殼聚糖與STPP的質 量比粒徑，nm包封率，％載藥量，％
5227±926. 10±1. 442. 90±2. 1
5. 5217±624. 70±0. 341. 50±1. 7
6. 25205±1424. 30±0. 941. 25±1. 2 從表l看出，本發(fā)明不同質量比殼聚糖/STPP制備的香菇多糖殼聚糖納米粒的粒徑小，包封率可達24%以上，載藥量也可達41%以上。
五、香菇多糖殼聚糖納米粒的細胞毒性實驗 將HeLa細胞，H印G2細胞，A549細胞分別按照1 X 104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)至細胞完全貼壁，融合度為60% 80%。用PBS緩沖液洗滌后按180 ii L/孔加入RPMI1640培養(yǎng)液，并加入20 ii L不同濃度的香菇多糖殼聚糖納米粒溶液，空白對照組加入20 ii L空白納米粒(即未添加香菇多糖的殼聚糖納米粒)，繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后每孔加入20 ii L濃度為5mg/mlL的MTT (四甲基偶氮唑鹽)-PBS緩沖溶液，4h后吸去培養(yǎng)液，加入 150 ii L 二甲基亞砜(DMSO)每孔，振搖10min，在酶標儀上，于570nm測定A值，每組測定3 次，求平均值，結果見圖3、圖4和圖5。按以下公式計算細胞抑制率 細胞抑制率(％)=(空白對照組八值_實驗組八值)+空白對照組A值X100%
結果表明本發(fā)明香菇多糖殼聚糖納米粒的細胞毒性遠大于空白納米粒和香菇多 糖溶液，且本發(fā)明香菇多糖殼聚糖納米粒與同濃度下各組結果相比具有顯著性差異(*表 示P < 0. 05)，與空白納米粒相比具有顯著性差異(#表示P < 0. 05)。
六、香菇多糖殼聚糖納米粒促進小鼠脾細胞增殖實驗
1、小鼠脾細胞的制備 試驗選取5 7周小鼠，實驗時脫頸處死小鼠，置質量百分濃度75%乙醇中浸泡消 毒5min。無菌分離脾臟，用Hanks液沖洗以去除結締組織和血液。用無菌注射器芯擠壓脾 臟，過200目網(wǎng)，加入脾臟體積2倍量的RPMI-1640培養(yǎng)液，制成脾細胞懸液。于脾細胞懸 液中加入pH7. 2、0. Olmol/L的Tris_NH4Cl，去除紅細胞。37。C溫育10min，除去貼壁細胞， 以1000r/min速度離心10min，棄上清。用含10% (質量百分濃度)小牛血清的RPMI-1640 重懸沉淀，吹打混勻。
2、脾細胞計數(shù) 取上述懸液100 ii L，稀釋10倍，用計數(shù)板計數(shù)(細胞存活率高于95% )。根據(jù)計 數(shù)結果，用含10% (質量百分濃度)小牛血清的RPMI-1640調整細胞濃度為1Xl(f個細胞 3、納米粒促進小鼠脾細胞增殖實驗 取96孔板，每孔加入180 ii L的小鼠脾細胞懸液；過夜培養(yǎng)至細胞完全貼壁，融合 度為60% 80% 。 PBS緩沖液洗滌后加入RPMI培養(yǎng)液180 y 1L/孔，并加入20 y L不同濃 度的香菇多糖納米粒，空白對照組加入20iiL空白納米粒(即未添加香菇多糖的殼聚糖納 米粒)，繼續(xù)培養(yǎng)48h。每孔加入20 ii LMTT (5mg/ml) ， 4h后吸去培養(yǎng)液，加入150 y LDMSO每 孔，振搖10min，在酶標儀上，于570nm測定A值，每組測定3次，求平均值，結果見圖6。按 以下公式計算細胞促生長率促生長率(％)=(實驗組八值-空白對照組八值)+空白對照組A值X100%
結果表明香菇多糖殼聚糖納米粒促小鼠脾細胞生長率遠大于空白納米粒和香菇 多糖溶液組，且本發(fā)明香菇多糖殼聚糖納米粒與同濃度下各組結果相比具有顯著性差異(* 表示P < 0. 05)，與空白納米粒相比具有顯著性差異(#表示P < 0. 05)。
本發(fā)明具有如下有益效果 本發(fā)明香菇多糖殼聚糖納米粒采用CS與STPP為載體，通過CS與STPP的陰陽離 子靜電作用自發(fā)形成載藥納米粒，結合離子凝膠化法攜載水溶性、大分子的香菇多糖成功 制備獲得穩(wěn)定性高、包封率好和載藥量高的香菇多糖殼聚糖納米粒。通過對該納米粒的抗 腫瘤作用和免疫增強作用進行考察，發(fā)現(xiàn)與香菇多糖溶液相比，香菇多糖殼聚糖納米粒對 HeLa、 H印G2、 A549等腫瘤細胞的殺傷能力顯著增強，并且對小鼠脾細胞的增殖產(chǎn)生了明顯 的促進作用。表明本發(fā)明香菇多糖納米制劑具有良好的抗腫瘤作用和免疫增強作用，較香 菇多糖溶液的抗腫瘤效果更強，穩(wěn)定性更高。 本發(fā)明的制備方法中先將香菇多糖加入到殼聚糖溶液中再制備成納米粒，可以形成更穩(wěn)定的納米粒，且操作簡單、安全、有效，符合環(huán)保要求，適于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明香菇多糖殼聚糖納米粒的透射電鏡圖； 圖2為CS與STPP不同質量比的香菇多糖殼聚糖納米粒的粒徑分布和電位分布 圖； 圖3為不同濃度香菇多糖殼聚糖納米粒對HeLa細胞的抑制率； 圖4為不同濃度香菇多糖殼聚糖納米粒對H印G2細胞的抑制率； 圖5為不同濃度香菇多糖殼聚糖納米粒對A549細胞的抑制率； 圖6為不同濃度香菇多糖殼聚糖納米粒對小鼠脾淋巴細胞的促生長率； 其中，圖3 圖6中，CS-GLP-NP代表本發(fā)明的香菇多糖殼聚糖納米粒；GLP代表香
菇多糖溶液；NP代表空白納米粒。
具體實施方式

實施例1 (1)將分子量為50kDa、脫乙酰度為95%的殼聚糖250mg溶于質量百分濃度為1% 的醋酸水溶液中，室溫磁力攪拌10min，攪拌速度為70r/min，使殼聚糖在醋酸環(huán)境下溶脹， 配制成殼聚糖濃度為1. 5g/L的殼聚糖溶液； (2)將6mg的香菇多糖熱溶于100ml水中配制成濃度為60 y g/mL的香菇多糖溶 液； (3)精確量取10ml香菇多糖溶液加入上述殼聚糖溶液，用質量百分濃度為1 %的 NaOH水溶液調節(jié)使殼聚糖溶液的pH值為5，再緩慢滴加4. 5ml質量百分濃度為1 %的三聚 磷酸鈉水溶液(三聚磷酸鈉重量為45mg)，使三聚磷酸鈉與殼聚糖通過陰陽離子靜電作用 自發(fā)形成載藥納米粒。然后再磁力攪拌60min，使納米粒穩(wěn)定后離心，收集沉淀，把沉淀用雙 蒸水復溶，過450nm的濾膜，除去多余的殼聚糖凝集物，濾液冷凍干燥，即制得香菇多糖殼 聚糖納米粒。
實施例2 (1)將分子量為10kDa、脫乙酰度為90 %的殼聚糖250mg溶于質量百分濃度為 0. 5%的醋酸水溶液中，室溫磁力攪拌10min，攪拌速度為70r/min，使殼聚糖在醋酸環(huán)境下 溶脹，配制成殼聚糖濃度為2g/L的殼聚糖溶液； (2)將6mg的香菇多糖熱溶于100ml水中配制成濃度為60 y g/mL的香菇多糖溶 液； (3)精確量取10ml香菇多糖溶液加入上述殼聚糖溶液，用質量百分濃度為1 %的 NaOH水溶液調節(jié)使殼聚糖溶液的pH值為5，再緩慢滴加4. 5ml質量百分濃度為1 %的三聚 磷酸鈉水溶液(三聚磷酸鈉重量為45mg)，使三聚磷酸鈉與殼聚糖通過陰陽離子靜電作用 自發(fā)形成載藥納米粒。然后再磁力攪拌60min，使納米粒穩(wěn)定后離心，收集沉淀，把沉淀用雙 蒸水復溶，過450nm的濾膜，除去多余的殼聚糖凝集物，濾液冷凍干燥，即制得香菇多糖殼 聚糖納米粒。
實施例3
(1)將分子量為50kDa、脫乙酰度為90 %的殼聚糖250mg溶于質量百分濃度為 2. 5%的醋酸水溶液中，室溫磁力攪拌lOmin，攪拌速度為70r/min，使殼聚糖在醋酸環(huán)境下 溶脹，配制成殼聚糖濃度為2. 5g/L的殼聚糖溶液； (2)將6mg的香菇多糖熱溶于100ml水中配制成濃度為60 y g/mL的香菇多糖溶 液； (3)精確量取10ml香菇多糖溶液加入殼聚糖溶液，用質量百分濃度為1 %的NaOH 水溶液調節(jié)使殼聚糖溶液的pH值為5，再緩慢滴加4. 5ml質量百分濃度為1%的三聚磷酸 鈉水溶液(三聚磷酸鈉重量為45mg)，使三聚磷酸鈉與殼聚糖通過陰陽離子靜電作用自發(fā) 形成載藥納米粒。然后再磁力攪拌60min，使納米粒穩(wěn)定后離心，收集沉淀，把沉淀用雙蒸水 復溶，過450nm的濾膜，除去多余的殼聚糖凝集物，濾液冷凍干燥，即制得香菇多糖殼聚糖 納米粒。 實施例4 (1)將分子量為100kDa、脫乙酰度為95%的殼聚糖250mg溶于質量百分濃度為 1%的醋酸水溶液中，室溫磁力攪拌10min，攪拌速度為70r/min，使殼聚糖在醋酸環(huán)境下溶 脹，配制成殼聚糖濃度為2. 5g/L的殼聚糖溶液； (2)將6mg的香菇多糖熱溶于100ml水中配制成濃度為60 y g/mL的香菇多糖溶 液； (3)精確量取10ml香菇多糖溶液加入殼聚糖溶液，用質量百分濃度為1 %的NaOH
水溶液調節(jié)使殼聚糖溶液的pH值為5，再緩慢滴加4. 5ml質量百分濃度為0. 1%的三聚磷
酸鈉水溶液(三聚磷酸鈉重量為45mg)，使三聚磷酸鈉與殼聚糖通過陰陽離子靜電作用自
發(fā)形成載藥納米粒。然后再磁力攪拌60min，使納米粒穩(wěn)定后離心，收集沉淀，把沉淀用雙蒸
水復溶，過450nm的濾膜，除去多余的殼聚糖凝集物，濾液冷凍干燥，即制得香菇多糖殼聚
糖納米粒。 實施例5 (1)將分子量為100kDa、脫乙酰度為90%的殼聚糖250mg溶于質量百分濃度為 1%的醋酸水溶液中，室溫磁力攪拌10min，攪拌速度為70r/min，使殼聚糖在醋酸環(huán)境下溶 脹，配制成殼聚糖濃度為2. 5g/L的殼聚糖溶液； (2)將10mg的香菇多糖熱溶于100ml水中配制成濃度為100 y g/mL的香菇多糖溶 液； (3)精確量取10ml香菇多糖溶液加入殼聚糖溶液，用質量百分濃度為1 %的NaOH 水溶液調節(jié)使殼聚糖溶液的pH值為5，再緩慢滴加45ml質量百分濃度為0. 1 %的三聚磷酸 鈉水溶液(三聚磷酸鈉重量為45mg)，使三聚磷酸鈉與殼聚糖通過陰陽離子靜電作用自發(fā) 形成載藥納米粒。然后再磁力攪拌60min，使納米粒穩(wěn)定后離心，收集沉淀，把沉淀用雙蒸水 復溶，過450nm的濾膜，除去多余的殼聚糖凝集物，濾液冷凍干燥，即制得香菇多糖殼聚糖 納米粒。 實施例6 (1)將分子量為100kDa、脫乙酰度為95%的殼聚糖250mg溶于質量百分濃度為 1%的醋酸水溶液中，室溫磁力攪拌10min，攪拌速度為70r/min，使殼聚糖在醋酸環(huán)境下溶 脹，配制成殼聚糖濃度為2. 5g/L的殼聚糖溶液；
(2)將15mg的香菇多糖熱溶于100ml水中配制成濃度為150 y g/mL的香菇多糖溶 液； (3)精確量取10ml香菇多糖溶液加入上述殼聚糖溶液中，用質量百分濃度為1% 的NaOH水溶液調節(jié)使殼聚糖溶液的pH值為4，再緩慢滴加10ml質量百分濃度為0. 5%的 三聚磷酸鈉水溶液(三聚磷酸鈉重量為50mg)，使三聚磷酸鈉與殼聚糖通過陰陽離子靜電 作用自發(fā)形成載藥納米粒。然后再磁力攪拌60min，使納米粒穩(wěn)定后離心，收集沉淀，把沉淀 用雙蒸水復溶，過450nm的濾膜，除去多余的殼聚糖凝集物，濾液冷凍干燥，即制得香菇多 糖殼聚糖納米粒。
實施例7 (1)將分子量為100kDa、脫乙酰度為90%的殼聚糖200mg溶于質量百分濃度為 1%的醋酸水溶液中，室溫磁力攪拌10min，攪拌速度為70r/min，使殼聚糖在醋酸環(huán)境下溶 脹，配制成殼聚糖濃度為2. 5g/L的殼聚糖溶液； (2)將10mg的香菇多糖熱溶于100ml水中配制成濃度為150 y g/mL的香菇多糖溶 液； (3)精確量取10ml香菇多糖溶液加入上述殼聚糖溶液中，用質量百分濃度為1% 的NaOH水溶液調節(jié)使殼聚糖溶液的pH值為6，再緩慢滴加3ml質量百分濃度為1 %的三聚 磷酸鈉水溶液(三聚磷酸鈉重量為30mg)，使三聚磷酸鈉與殼聚糖通過陰陽離子靜電作用 自發(fā)形成載藥納米粒。然后再磁力攪拌60min，使納米粒穩(wěn)定后離心，收集沉淀，把沉淀用雙 蒸水復溶，過450nm的濾膜，除去多余的殼聚糖凝集物，濾液冷凍干燥，即制得香菇多糖殼 聚糖納米粒。
實施例8 (1)將分子量為100kDa、脫乙酰度為95%的殼聚糖150mg溶于質量百分濃度為 1%的醋酸水溶液中，室溫磁力攪拌10min，攪拌速度為70r/min，使殼聚糖在醋酸環(huán)境下溶 脹，配制成殼聚糖濃度為2. 5g/L的殼聚糖溶液； (2)將15mg的香菇多糖熱溶于100ml水中配制成濃度為150 y g/mL的香菇多糖溶 液； (3)精確量取10ml香菇多糖溶液加入上述殼聚糖溶液中，用質量百分濃度為1% 的NaOH水溶液調節(jié)使殼聚糖溶液的pH值為4，再緩慢滴加14ml質量百分濃度為0. 5%的 三聚磷酸鈉水溶液(三聚磷酸鈉重量為70mg)，使三聚磷酸鈉與殼聚糖通過陰陽離子靜電 作用自發(fā)形成載藥納米粒。然后再磁力攪拌60min，使納米粒穩(wěn)定后離心，收集沉淀，把沉淀 用雙蒸水復溶，過450nm的濾膜，除去多余的殼聚糖凝集物，濾液冷凍干燥，即制得香菇多 糖殼聚糖納米粒。 對實施例1 8的香菇多糖殼聚糖納米粒進行檢測，結果表明實施例1 7的香 菇多糖殼聚糖納米粒的粒徑均在100nm 230nm，實施例8的香菇多糖殼聚糖納米粒的粒 徑為400nm 500nm，實施例1 8的香燕多糖殼聚糖納米粒穩(wěn)定性好，包封率均在24% 30% ，載藥量均在41 % 50% ，對HeLa、H印G2、A549等腫瘤細胞的殺傷能力顯著增強，并且 對小鼠脾細胞的增殖產(chǎn)生了明顯的促進作用。
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權利要求
一種香菇多糖殼聚糖納米粒，其特征在于，由如下重量份的原料藥和載體材料制成殼聚糖150份～250份、三聚磷酸鈉30份～70份和香菇多糖0.6份～1.5份。
2. 根據(jù)權利要求1所述的香菇多糖殼聚糖納米粒，其特征在于，由如下重量份的原料 藥和載體材料制成殼聚糖200份 250份、三聚磷酸鈉30份 45份和香菇多糖0. 6份 1.5份。
3. 根據(jù)權利要求1所述的香菇多糖殼聚糖納米粒，其特征在于，所述的殼聚糖的分子 量為10kDa 100kDa。
4. 根據(jù)權利要求1所述的香菇多糖殼聚糖納米粒，其特征在于，所述的殼聚糖的脫乙 酰度為90% 95%。
5. 根據(jù)權利要求1所述的香菇多糖殼聚糖納米粒，其特征在于，所述的香菇多糖殼聚 糖納米粒的粒徑為100nm 500nm， zeta電位為0 20mv。
6. 根據(jù)權利要求1 5任一項所述的香菇多糖殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于， 包括步驟(1) 將殼聚糖在醋酸或醋酸水溶液中溶脹配制成殼聚糖溶液；(2) 將香菇多糖熱溶于水中配制成香菇多糖溶液；(3) 先將香菇多糖溶液加入殼聚糖溶液中，調節(jié)殼聚糖溶液的pH值為4 6，再緩慢滴 加三聚磷酸鈉水溶液，攪拌均勻后離心，收集沉淀，把沉淀復溶、過濾，濾液冷凍干燥，即制 得香菇多糖殼聚糖納米粒。
7. 根據(jù)權利要求6所述的香菇多糖殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于，步驟(1) 中，所述的殼聚糖溶液中殼聚糖的濃度為1. 5g/L 2. 5g/L。
8. 根據(jù)權利要求6所述的香菇多糖殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于，步驟(1) 中，所述的醋酸水溶液的質量百分濃度為0. 5% 2. 5%。
9. 根據(jù)權利要求6所述的香菇多糖殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中，所述的香菇多糖溶液的濃度為60ii g/ml 150ii g/ml。
10. 根據(jù)權利要求6所述的香菇多糖殼聚糖納米粒的制備方法，其特征在于，步驟(3) 中，所述的三聚磷酸鈉水溶液的質量百分濃度為0. 1% 1%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種香菇多糖殼聚糖納米粒及其制備方法，該香菇多糖殼聚糖納米粒由如下重量份的原料藥和載體材料制成殼聚糖150份～250份、三聚磷酸鈉30份～70份和香菇多糖0.6份～1.5份。采用殼聚糖為載體，通過殼聚糖與三聚磷酸鈉的陰陽離子靜電作用自發(fā)形成載藥納米粒，結合離子凝膠化法和復乳溶劑揮發(fā)法攜載水溶性、大分子的香菇多糖成功制備獲得穩(wěn)定性高、包封率好和載藥量高的香菇多糖殼聚糖納米粒，且具有良好的抗腫瘤作用和免疫增強作用，較香菇多糖溶液的抗腫瘤效果更強，穩(wěn)定性更高。其制備方法操作簡單、安全、有效，符合環(huán)保要求，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61P1/16GK101732256SQ200910154959
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月7日 優(yōu)先權日2009年12月7日
發(fā)明者李旎, 高建青 申請人:浙江大學