專利名稱：：一種靈芝生物堿類物質(zhì)指紋圖譜鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于食用菌及中藥材原材料生物堿類物質(zhì)品質(zhì)分析技術(shù)鑒定領(lǐng)域，具體涉及靈芝中的生物活性組分生物堿類物質(zhì)的一種高效液相色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法及分析鑒別方法。
背景技術(shù)：
：靈芝(GanodermaLucid咖)自古以來(lái)被譽(yù)為人類延年益壽的靈丹妙藥，滋補(bǔ)益氣的仙草。早在我國(guó)第一部本草學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中，就認(rèn)為它具有益心氣、安精魂、補(bǔ)肝益氣、堅(jiān)筋骨的作用。李時(shí)珍在《本草綱目》中也對(duì)靈芝的食療保健作用作了高度評(píng)價(jià)"赤芝又名丹芝，氣味苦平，無(wú)毒。主治胸中結(jié)，益心氣，補(bǔ)中，增智慧，不忘。久食輕身不老，延年神仙"。在近幾十年來(lái)，科學(xué)家通過(guò)各種研究，已從多方面證明靈芝具有很"靈"的祛病強(qiáng)身，扶正固本的保健作用。尤其對(duì)生物免疫與傳統(tǒng)治療腫瘤具有奇特的效果。近年來(lái)大量的化學(xué)和藥理分析表明靈芝具體有抗腫瘤、減輕癌癥或其他疾病引起的疼痛、增強(qiáng)免疫、延緩衰老、保肝解毒、治療高血壓、降血糖、鎮(zhèn)咳平喘、抗輻射和抗過(guò)敏等多種作用。尤其在抗腫瘤方面，國(guó)內(nèi)外許多著名的醫(yī)療研究機(jī)構(gòu)經(jīng)研究得出結(jié)論靈芝對(duì)胃癌、肺癌、惡性淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、腸癌、食道癌、白血病等多種腫瘤疾病有十分顯著的療效。靈芝之所以具有如此顯著的醫(yī)療保健效果，其中的活性物質(zhì)中，靈芝生物堿類(如二萜類、三萜類、嘌啉堿、未知生物堿等)是靈芝中一種重要的基礎(chǔ)藥效成分，其功效主要包括保肝；抗腫瘤；降血糖；抗HIV_1及HIV_1蛋白酶活性；抑制組胺釋放；抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；抑制膽固醇合成等作用。因此，靈芝生物堿類具有重要的醫(yī)藥保健價(jià)值，目前靈芝通過(guò)不同的加工方式已被開(kāi)發(fā)成多種保健品，靈芝生物堿類物質(zhì)是其中的一種產(chǎn)PIPRo目前國(guó)內(nèi)靈芝種屬有很多，如赤芝、黑芝、紫芝、韓芝、白芝等，其中以赤芝品種居多，由于靈芝栽培隨氣候條件、區(qū)域的差異、栽培方式、種屬不同，靈芝中生物活性組分生物堿類物質(zhì)有一定的差別，如何鑒別靈芝中所含的生物活性組分生物堿類物質(zhì)，對(duì)靈芝的品質(zhì)鑒別和科學(xué)評(píng)價(jià)具有價(jià)值杠桿的意義。目前，對(duì)不同靈芝種屬、同品種不同區(qū)域、同品種不同栽培方法的生物活性組分生物堿類物質(zhì)的鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)還沒(méi)有建立一個(gè)科學(xué)的評(píng)判方法，也沒(méi)有相關(guān)方面的方法報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了建立靈芝原材料生物堿類物質(zhì)的分析鑒別方法，對(duì)靈芝生物堿加工質(zhì)量控制、原材料真?zhèn)舞b別及生物堿類物質(zhì)的初步定性定量品質(zhì)分析提供了一種有效的方法，從而對(duì)靈芝的原材料品質(zhì)進(jìn)行科學(xué)的評(píng)價(jià)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種靈芝生物堿類物質(zhì)指紋圖譜鑒定方法，所述的方法包括以下步驟(a)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制取取產(chǎn)地各不相同的已知標(biāo)準(zhǔn)品種樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片510批次、每批次取相同質(zhì)量的生藥量分別進(jìn)行如下試驗(yàn)加入已知樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片2535倍質(zhì)量的乙醇回流提取，過(guò)濾除去濾渣后得到已知樣品提取液，已知樣品提取液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑，得已知樣品生物堿浸膏液，加甲醇定容得已知樣品溶液，控制所述的已知樣品溶液中生藥量含量為27克/100毫升，已知樣品溶液經(jīng)O.45iim有機(jī)濾膜過(guò)濾，得已知樣品供試品溶液，取已知樣品供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，得到已知樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖；所述高效液相色譜的條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以己腈、lvol%醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm;取各批次中高效液相色譜圖的共有吸收峰為特征色譜峰，圖中選擇歸一化峰面積大于1%的特征色譜峰作為指紋峰，得到靈芝生物堿類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；(b)待測(cè)樣品高效液相色譜圖制取取待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片，加入待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片2535倍質(zhì)量的乙醇回流提取，過(guò)濾除去濾渣后得到待測(cè)樣品提取液，待測(cè)樣品提取液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑，得待測(cè)樣品生物堿浸膏液，加甲醇定容得待測(cè)樣品溶液，控制所述的待測(cè)樣品溶液中生藥量含量與步驟(a)中已知樣品溶液的生藥量含量相同，待測(cè)樣品溶液經(jīng)0.45iim有機(jī)濾膜過(guò)濾，得待測(cè)樣品供試品溶液，取待測(cè)樣品供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，所述高效液相色譜的條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以己腈、lvol^醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，得到待測(cè)樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖；(c)將步驟(b)得到的待測(cè)樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖與步驟(a)得到的靈芝生物堿類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中的特征色譜峰對(duì)照，待測(cè)樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖具有靈芝生物堿類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中所有的特征色譜鋒，則待測(cè)樣品為標(biāo)準(zhǔn)品種。較為具體的，所述步驟(a)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制取中，每批次取相同質(zhì)量生藥量的已知標(biāo)準(zhǔn)品種樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片制得已知樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖的操作包括以下步驟(1)稱取已知樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片，加入95wt^乙醇，所述95wt^乙醇和已知樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片的質(zhì)量比為2535:1，優(yōu)選33:l，在微沸回流狀態(tài)下，提取12小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣后，得已知樣品提取液；(2)已知樣品提取液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑，得已知樣品生物堿浸膏液，加甲醇定容得已知樣品溶液，控制所述的已知樣品溶液中生藥量含量為27克/100毫升，已知樣品溶液經(jīng)0.45iim有機(jī)濾膜過(guò)濾，得已知樣品供試品溶液；(3)已知樣品供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，得已知樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖，所述色譜條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以己腈、lvol^醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，進(jìn)樣量10iiL，分析時(shí)間為40min，梯度洗脫程序?yàn)?8min，lOvol%的lvol^醋酸水溶液和90vol^的乙腈；810min，15vol^的lvol^醋酸水溶液和85vol^的乙腈；1015min，30vol^的lvol^醋酸水溶液和70vol^的乙腈；1520min，40vol%的lvol^醋酸水溶液和60vol^的乙腈；2030min，45vol^的lvol^醋酸水溶液和55vol^的乙腈；3040min，50vol^的lvol^醋酸水溶液和50vol^的乙腈。較為具體的，所述步驟(b)中待測(cè)樣品高效液相色譜圖制取的操作包括以下步驟(1)稱取待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片，加入95wt^乙醇，所述95wt^乙醇和待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片的質(zhì)量比為2535:1，優(yōu)選33:l，在微沸回流狀態(tài)下，提取12小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣后，得待測(cè)樣品提取液；(2)待測(cè)樣品提取液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑，得待測(cè)樣品生物堿浸膏液，加甲醇定容得待測(cè)樣品溶液，控制所述的待測(cè)樣品溶液中生藥量含量與步驟(a)中已知樣品溶液的生藥量含量相同，待測(cè)樣品溶液經(jīng)O.45ym有機(jī)濾膜過(guò)濾，得待測(cè)樣品供試品溶液；(3)待測(cè)樣品供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，得高效液相色譜圖，所述色譜條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以己腈、lvol^醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，進(jìn)樣量10yL，分析時(shí)間為40min，梯度洗脫程序?yàn)?8min，lOvol%的lvol%醋酸水溶液和90vol%的乙腈；810min，15vol^的lvol^醋酸水溶液和85vol^的乙腈；1015min，30vol%的lvol^醋酸水溶液和70vol^的乙腈；1520min，40vol^的lvol^醋酸水溶液和60vol^的乙腈；2030min，45vol^的lvol^醋酸水溶液和55vol^的乙腈；3040min，50vol%的lvol^醋酸水溶液和50vol^的乙腈。本發(fā)明所述已知樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片是將已知樣品靈芝子實(shí)體切片、干燥、粉碎至4080目得到。本發(fā)明所述待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片是將待測(cè)樣品靈芝子實(shí)體切片、干燥、粉碎至4080目得到。本發(fā)明所述的在微沸回流狀態(tài)下，提取12小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣后，得已知樣品提取液，優(yōu)選為在微沸回流狀態(tài)下，提取1小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣后，得已知樣品提取液；更優(yōu)選為采用微波輔助提取法，在功率為800W的微波條件下，微波輔助回流提取17min，過(guò)濾除去濾渣后，得已知樣品提取液。本發(fā)明所述的在微沸回流狀態(tài)下，提取12小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣后，得待測(cè)樣品提取液，優(yōu)選為在微沸回流狀態(tài)下，提取1小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣后，得待測(cè)樣品提取液；更優(yōu)選為采用微波輔助提取法，在功率為800W的微波條件下，微波輔助回流提取17min，過(guò)濾除去濾渣后，得待測(cè)樣品提取液。本發(fā)明可以對(duì)不同靈芝種屬、同品種不同產(chǎn)地、同品種不同栽培方式的生物活性組分生物堿類物質(zhì)進(jìn)行鑒別分析，可通過(guò)設(shè)定某一靈芝品種的生物堿色譜圖為參照?qǐng)D譜，通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的匹配和峰面積計(jì)算，自動(dòng)計(jì)算出不同產(chǎn)區(qū)赤靈芝樣品中共有峰組成及樣品的相似度，參照峰面積的大小和相似度的計(jì)算值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析即可比較科學(xué)地判別不同產(chǎn)區(qū)赤靈芝所含生物堿的品質(zhì)情況，從而初步鑒別不同類別的哪種品種更具有相似性和差異性，所含生物堿類的品質(zhì)更好。本發(fā)明優(yōu)選以微波輔助回流提取法進(jìn)行前處理，優(yōu)化了生物堿提取方法，采用C18柱，以己腈、lvol^醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行二元梯度洗脫對(duì)靈芝中生物堿類物質(zhì)的指紋圖譜分析鑒別具有快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、直觀、重現(xiàn)性好、針對(duì)性強(qiáng)、生物堿譜峰數(shù)目多、分離效果好及易于操作的優(yōu)點(diǎn)。運(yùn)用本發(fā)明方法對(duì)不同靈芝種屬、同品種不同產(chǎn)地、同品種不同栽培方式的生物活性組分生物堿類物質(zhì)的鑒別效果非常理想，對(duì)靈芝的生物活性組分生物堿類物質(zhì)的品質(zhì)鑒別首次提出了初步定性定量的科學(xué)依據(jù)。說(shuō)明書(shū)附圖附圖ll號(hào)品種赤靈芝樣品中生物堿類物質(zhì)的指紋圖譜附圖29種不同產(chǎn)區(qū)赤靈芝樣品的生物堿類物質(zhì)色譜峰對(duì)照指圖譜，取這9種高效液相色譜圖的共有吸收峰為特征色譜峰，圖中選擇歸一化峰面積大于1%的特征色譜峰作為指紋峰，得到赤靈芝生物堿類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。附圖35種不同種屬赤芝、韓芝、紫芝、黑芝、野生靈芝生物堿類物質(zhì)色譜峰對(duì)照指圖譜，赤表示赤芝、韓表示韓芝、紫表示紫芝、黑表示黑芝、野表示野生靈芝。具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例1建立靈芝中生物堿類物質(zhì)的指紋圖譜1.粉碎步驟將1號(hào)品種赤靈芝樣品實(shí)體切片、干燥、粉碎至40目左右，得靈芝干ci2.提取步驟稱取5g靈芝干品，以料液比l:33加入95wt^乙醇，在微沸回流狀態(tài)下，采用800W功率，微波回流提取17min，過(guò)濾除去濾渣后，得提取液。3.提取液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑，得生物堿浸膏液，加甲醇定容至100mL，得樣品溶液，樣品溶液中赤靈芝干品含量為5克/100毫升樣品溶液經(jīng)O.45Pm有機(jī)濾膜過(guò)濾，得供試品溶液；4.供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，得高效液相色譜圖。色譜條件為Watersl525高效液相色譜儀，二元泵，紫外檢測(cè)器，Bress軟件，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱C18(型號(hào):Sy騰try250X4.6mmI.D.5ym，美國(guó)Waters公司生產(chǎn))，以己腈、水(含1%醋酸v/v)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，進(jìn)樣量10iiL，分析時(shí)間為40分鐘，梯度洗脫程序?yàn)?8min，10vol^的lvol^醋酸水溶液和90vol^的乙腈；810min，15vol^的lvol^醋酸水溶液和85vol^的乙腈；1015min，30vol^的lvol^醋酸水溶液和70vol^的乙腈；1520min，40vol%的lvol^醋酸水溶液和60vol^的乙腈；2030min，45vol^的lvol^醋酸水溶液和55v01%的乙腈；3040min，50vol^的lvol^醋酸水溶液和50vol^的乙腈。5.指紋圖譜構(gòu)建在高效液相色譜圖中選擇歸一化峰面積大于1%的色譜峰作為指紋峰，最終選擇了38個(gè)指紋峰(占總峰面積的90%以上)作為靈芝單峰生物堿類分析圖譜，見(jiàn)圖l，圖中黑圓點(diǎn)所示即為指紋峰。這樣可定性判別赤靈芝樣品中存在靈芝生物堿的種類，同時(shí)根據(jù)歸一化面積計(jì)算法，大致判別在相應(yīng)的出峰保留時(shí)間段，哪種生物堿含量較高。實(shí)施例2不同產(chǎn)區(qū)赤靈芝生物堿初步定性定量比較鑒別分析采集9種不同產(chǎn)區(qū)赤靈芝樣品進(jìn)行生物堿類分析，實(shí)驗(yàn)條件和操作方法同實(shí)施例l，得到9種赤靈芝樣品生物堿類分析圖譜，然后采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，選取一種產(chǎn)區(qū)赤靈芝樣品作為參照譜峰(R)，并進(jìn)行色譜峰多點(diǎn)校正的方法，對(duì)8個(gè)樣品的色譜峰進(jìn)行匹配并自動(dòng)生成對(duì)照指圖譜，見(jiàn)附圖2，通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的匹配和峰面積計(jì)算，自動(dòng)計(jì)算出不同產(chǎn)區(qū)赤靈芝樣品中共有峰組成及樣品的相似度，分別見(jiàn)表1、表2。表1色譜峰峰面積及共有峰匹配分析數(shù)數(shù)據(jù)保留時(shí)間SIS2S3S4S5S6S7S8R共有峰數(shù)1.4920469.42700203.160257.59217.35143.4442.158259.08229.414206.24228.470000115.4042.333201.45332.05600000224.2194.71632.6641576.52298.3201882.21056.3926.531530.71086.31294.673.5371052.3865.414260.47631.50268.89218.51438.23311.83505.9083.750292.33342.329380.33365.44271.29319.38204.65387.19320.37812.639248.16200.18400222.1800083.817312.979443.71229.103207.50281.01277.57323.54357.94340.33307.59814.292229.89000233.110230.23204.45112.21416.29455.870214.4100238.14224.23226.07169.84516.717454.61000318.900214.280123.47317.461357.81202.328325.6900317.27221.19367.69224.00617.828561.75245.117392.43243.890388.3262.60430.23315.54718.158542.31241.559541.21313.94205.68639.38489.51642.99452.07819.2328.47251.271272.290398.67247.590296.24224.31619.386569.96212.4276.7200204.98257.51294.50227.01619.9021299.1790.1021360.3558.44510.301368.7652.801456.8999.60820.156784.99391.413713.78323.32366.75692.95526.62794.47574.2888<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注Sx為靈芝樣品種類表2色譜峰相似度計(jì)算值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通過(guò)上述表1數(shù)據(jù)分析，按歸一化峰面積大于1%計(jì)算，8種不同產(chǎn)區(qū)赤靈芝樣品，最多的生物堿指紋圖譜峰數(shù)可達(dá)42種，最少的僅為14種，這樣可容易的分辨不同產(chǎn)區(qū)赤靈芝樣品所含靈芝生物堿的種類的差異性。另外，還可以很容易的辨別靈芝生物堿類物質(zhì)的共有指紋圖譜特征峰數(shù)，上述8個(gè)靈芝樣品中，生物堿共有指紋圖譜特征峰數(shù)為6個(gè)，分別在保留時(shí)間3.537、3.750、12.979、18.158、19.902、20.156min。通過(guò)歸一化面積積分法計(jì)算，也可容易鑒別，在同一保留時(shí)間段，或?qū)灿刑卣鞣澹浔Ａ魰r(shí)間段，各樣品的峰面積相對(duì)對(duì)照峰峰面積大小，可判別各樣品生物堿含量的大小，也可通過(guò)各樣品的總峰面積的積分計(jì)算與對(duì)照品的總峰面積，判別各樣品生物堿含量的大小。此外，由上述表2數(shù)據(jù)分析，通過(guò)各樣品的色譜峰相似度計(jì)算，可知Sl，S2，S6，S7靈芝樣品有更多的相似性，其相似度達(dá)到0.916以上，S3的差異性最大，這樣對(duì)靈芝樣品的原料質(zhì)量控制，真?zhèn)舞b別具有科學(xué)意義的評(píng)價(jià)。實(shí)施例3采用不同種屬靈芝樣品進(jìn)行生物堿類定性分析采集5種不同種屬赤芝、韓芝、紫芝、黑芝、野生靈芝樣品各進(jìn)行生物堿類分析，取樣量、實(shí)驗(yàn)條件和操作方法同實(shí)施例l，得到5種靈芝樣品生物堿類分析圖譜，然后采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，選取赤靈芝樣品作為參照譜峰，并進(jìn)行色譜峰多點(diǎn)校正的方法，對(duì)5個(gè)樣品的色譜峰進(jìn)行匹配并自動(dòng)生成對(duì)照指圖譜，見(jiàn)附圖3，通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的匹配和峰面積計(jì)算，野生靈芝、黑芝、韓芝均較赤芝和紫芝有更高的生物堿類物質(zhì)含量。不同種屬的靈芝生物堿類物質(zhì)差異性較大，赤芝、韓芝和黑芝略為相似，相似度僅達(dá)0.806左右。只有赤芝指紋圖譜與赤靈芝生物堿類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜完全吻合。這樣對(duì)不同種屬的靈芝中的生物堿類物質(zhì)含量的高低可以很快地進(jìn)行定性判別。權(quán)利要求一種靈芝生物堿類物質(zhì)指紋圖譜鑒定方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟(a)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制取取產(chǎn)地各不相同的已知標(biāo)準(zhǔn)品種樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片5～10批次、每批次取相同質(zhì)量的生藥量分別進(jìn)行如下試驗(yàn)加入已知樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片25～35倍質(zhì)量的乙醇回流提取，過(guò)濾除去濾渣后得到已知樣品提取液，已知樣品提取液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑，得已知樣品生物堿浸膏液，加甲醇定容得已知樣品溶液，控制所述的已知樣品溶液中生藥量含量為2～7克/100毫升，已知樣品溶液經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，得已知樣品供試品溶液，取已知樣品供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，得到已知樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖；所述高效液相色譜的條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以己腈、1vol％醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；取各批次中高效液相色譜圖的共有吸收峰為特征色譜峰，圖中選擇歸一化峰面積大于1％的特征色譜峰作為指紋峰，得到靈芝生物堿類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；(b)待測(cè)樣品高效液相色譜圖制取取待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片，加入待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片25～35倍質(zhì)量的乙醇回流提取，過(guò)濾除去濾渣后得到待測(cè)樣品提取液，待測(cè)樣品提取液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑，得待測(cè)樣品生物堿浸膏液，加甲醇定容得待測(cè)樣品溶液，控制所述的待測(cè)樣品溶液中生藥量含量與步驟(a)中已知樣品溶液的生藥量含量相同，待測(cè)樣品溶液經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，得待測(cè)樣品供試品溶液，取待測(cè)樣品供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，所述高效液相色譜的條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以己腈、1vol％醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，得到待測(cè)樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖；(c)將步驟(b)得到的待測(cè)樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖與步驟(a)得到的靈芝生物堿類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中的特征色譜峰對(duì)照，待測(cè)樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖具有靈芝生物堿類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中所有的特征色譜鋒，則待測(cè)樣品為標(biāo)準(zhǔn)品種。2.如權(quán)利要求1所述的靈芝生物堿類物質(zhì)指紋圖譜鑒定方法，其特征在于所述的方法步驟(a)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制取中，每批次取相同質(zhì)量生藥量的已知標(biāo)準(zhǔn)品種樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片制得已知樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖的操作包括以下步驟(1)稱取已知樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片，加入95wt%乙醇，所述95wt%乙醇和已知樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片的質(zhì)量比為2535:1，在微沸回流狀態(tài)下，提取12小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣后，得已知樣品提取液；(2)已知樣品提取液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑，得已知樣品生物堿浸膏液，加甲醇定容得已知樣品溶液，控制所述的已知樣品溶液中生藥量含量為27克/100毫升，已知樣品溶液經(jīng)0.45iim有機(jī)濾膜過(guò)濾，得已知樣品供試品溶液；(3)已知樣品供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，得已知樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖，所述色譜條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以己腈、lvolX醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，進(jìn)樣量10yL，分析時(shí)間為40min，梯度洗脫程序?yàn)?8min，lOvol%的lvol^醋酸水溶液和90vol^的乙腈；810min，15vol^的lvol^醋酸水溶液和85vol^的乙腈；1015min，30vol^的lvol^醋酸水溶液和70vol^的乙腈；1520min，40vol^的lvol^醋酸水溶液和60vol^的乙腈；2030min，45vol^的lvol^醋酸水溶液和55vol^的乙腈；3040min，50vol^的lvol^醋酸水溶液和50vol^的乙腈。3.如權(quán)利要求1所述的靈芝生物堿類物質(zhì)指紋圖譜鑒定方法，其特征在于所述的方法步驟(b)中待測(cè)樣品高效液相色譜圖制取的操作包括以下步驟(1)稱取待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片，加入95wt%乙醇，所述95wt%乙醇和待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片的質(zhì)量比為2535:1，在微沸回流狀態(tài)下，提取12小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣后，得待測(cè)樣品提取液；(2)待測(cè)樣品提取液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑，得待測(cè)樣品生物堿浸膏液，加甲醇定容得待測(cè)樣品溶液，控制所述的待測(cè)樣品溶液中生藥量含量與步驟(a)中已知樣品溶液的生藥量含量相同，待測(cè)樣品溶液經(jīng)O.45ym有機(jī)濾膜過(guò)濾，得待測(cè)樣品供試品溶液；(3)待測(cè)樣品供試品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，得高效液相色譜圖，所述色譜條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以己腈、lvol^醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，進(jìn)樣量10iiL，分析時(shí)間為40min，梯度洗脫程序?yàn)?8min，10vol^的lvol^醋酸水溶液和90vol^的乙腈；810min，15vol^的lvol^醋酸水溶液和85vol^的乙腈；1015min，30vol%的lvol^醋酸水溶液和70vol^的乙腈；1520min，40vol^的lvol^醋酸水溶液和60vol^的乙腈；2030min，45vol^的lvol^醋酸水溶液和55vol^的乙腈；3040min，50vol%的lvol^醋酸水溶液和50vol^的乙腈。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中，所述提取為在微沸回流狀態(tài)下，提取1小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣后，得已知樣品提取液。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中，所述提取為在微沸回流狀態(tài)下，提取1小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣后，得待測(cè)樣品提取液。6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中，所述提取為功率為800W的微波條件下，微波回流提取17min，過(guò)濾除去濾渣后，得已知樣品提取液。7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中，所述提取為功率為800W的微波條件下，微波回流提取17min，過(guò)濾除去濾渣后，得待測(cè)樣品提取液。8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中，所述95wt^乙醇和已知樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片的質(zhì)量比為33:1。9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中，所述95wt^乙醇和待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片的質(zhì)量比為33:1。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種靈芝生物堿類物質(zhì)指紋圖譜鑒定方法，取產(chǎn)地各不相同的已知標(biāo)準(zhǔn)品種樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片5～10批次、每批次取相同質(zhì)量的生藥量分別制成供試品溶液，進(jìn)行高效液相色譜分析，取各批次中高效液相色譜圖的共有吸收峰為特征色譜峰，選擇歸一化峰面積大于1％的特征色譜峰作為指紋峰，得到靈芝生物堿類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；再取待測(cè)樣品干燥的靈芝子實(shí)體碎片，以相同方法得到的待測(cè)樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖，待測(cè)樣品靈芝生物堿類物質(zhì)高效液相色譜圖具有靈芝生物堿類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中所有的特征色譜鋒，則待測(cè)樣品為標(biāo)準(zhǔn)品種。運(yùn)用本發(fā)明方法可對(duì)不同靈芝種屬進(jìn)行鑒別。文檔編號(hào)A61P3/00GK101732364SQ20091015477公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2009年12月7日優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日發(fā)明者何晉浙,孫培龍,蕢霄蕓,邵平申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)