專利名稱：：喹唑啉生物堿及其在抗腫瘤方面的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新穎的喹唑啉生物堿類化合物，以及該類化合物在制備腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。生物堿是中草藥、生物及海洋生物中抗腫瘤的主要活性成分。已發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤活性的生物堿類主要有紫杉醇類生物堿、長春堿類苦參類生物堿、喜樹堿類、小檗堿、吳茱萸堿、粉防己堿、龍葵堿等。目前從自然界已經(jīng)分離得到的喹唑啉生物堿類化合物總共僅10個(gè)化合物(fumiquinazolinesAJ)，其中fumiquinazolinesAG生產(chǎn)于海水魚Pseudolabrusjaponicus腸道分離的煙曲霉，而fumiquinazolinesH禾PI生產(chǎn)于海洋被囊動(dòng)物Ecteinascidiaturbinata中分離的真菌Acremoniumsp.。喹唑啉生物堿類化合物從生源學(xué)的角度看，這些分子是由鄰氨基苯丙酸，色氨酸，丙氨酸衍生的三肽和四肽衍生物。文獻(xiàn)報(bào)道fumiquinazolinesAG對(duì)P388細(xì)胞具有中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性，H和I則具有弱的抗真菌活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一類新化學(xué)結(jié)構(gòu)的具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制等抗腫瘤活性的化合物，具體而言，是要提供一種喹唑啉生物堿類化合物。本發(fā)明的另一目的在于提供該類新化合物在制備腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。本發(fā)明首次從自然界微生物發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了一種新的喹唑啉生物堿類式I化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式I式I中，其中，&為氫、羥基、烴基、酰氧基、氨基或酰氨基；R2為氫、烴基。優(yōu)選的本發(fā)明化合物是&為羥基；R2為甲基的式I化合物。本發(fā)明式I化合物的制備方法是，通過發(fā)酵培養(yǎng)可生產(chǎn)喹唑啉生物堿類化合物的微生物，首先獲取含式I化合物的發(fā)酵產(chǎn)物，再利用相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員熟知的分離純化技
背景技術(shù)：
：術(shù)，如液液萃取、柱層析、高效液相等，純化制備并獲得式I化合物。本發(fā)明采用麗絲胺羅丹明B(sulforhodamineB，SRB)法、四氮唑鹽(MTT)還原法和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合顯微鏡下檢測細(xì)胞形態(tài)特征的方法，測試評(píng)價(jià)了本發(fā)明式I化合物對(duì)小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌BEL-7402細(xì)胞、小鼠白血病P388細(xì)胞、人白血病HL60細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷等作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，式I化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞可通過抑制細(xì)胞增殖、誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡或直接的殺傷等方式，顯示抑制腫瘤細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用，特別是對(duì)BEL-7402和P388細(xì)胞的增殖抑制作用較強(qiáng)。本發(fā)明的式I化合物與藥物可接受的各種載體、賦形劑或輔料配伍，可制成作腫瘤細(xì)胞殺傷劑等抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。在如下的實(shí)施例中所指的化合物I的化學(xué)結(jié)構(gòu)是式I化合物，其中&為羥基；R2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式I實(shí)施例化合物I的體外抗腫瘤活性測試l實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法被測樣品溶液的配制測試樣品為化合物I純品。精密稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測活性。細(xì)胞系及細(xì)胞的繼代培養(yǎng)采用人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌BEL-7402細(xì)胞、人白血病HL60細(xì)胞、小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞及小鼠白血病P388細(xì)胞等癌細(xì)胞系。各種細(xì)胞均用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32°C(tsFT210和P388細(xì)胞)或在37°C(A549、HL60及BEL-7402細(xì)胞)于通入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。細(xì)胞增殖抑制活性測試方法麗絲胺羅丹明B(SRB)法取對(duì)數(shù)生長期的人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌BEL-7402細(xì)胞或小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2X105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，每孔加入2微升不同濃度的樣品或空白溶液，32。C下培養(yǎng)17小時(shí)(tsFT210細(xì)胞)或37。C下培養(yǎng)24小時(shí)(A549或BEL—7402細(xì)為甲基胞)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細(xì)胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷有無細(xì)胞周期抑制，細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，繼而在4°C、3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，吸去上清。每孔細(xì)胞中加入20%三氯醋酸50微升，置于4t:固定1小時(shí)，用水沖洗5次并空氣干燥。每孔加入0.4%SRB的醋酸溶液50微升并在室溫靜置30分鐘。用1%醋酸水清洗4次，除去未結(jié)合的游離SRB染料。每孔加入150微升Tris緩沖液(10mmo1/L，pH10.5)溶解蛋白結(jié)合染料并利用MD公司產(chǎn)SPECTRAMAXPlus型酶標(biāo)儀測定每孔在520nm處的光密度(OD)值。在同一塊96孔板中樣品的每個(gè)濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對(duì)照和無細(xì)胞調(diào)零孔(如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細(xì)胞調(diào)零)。各孔OD值先做相應(yīng)無細(xì)胞調(diào)零，再取三孔平均OD值按IRX二(0D站對(duì)照-0D樣。。。)/0D空自對(duì)照X100X式計(jì)算每個(gè)濃度下的細(xì)胞增殖抑制率(IR%)。四氮唑鹽(MTT)法取對(duì)數(shù)生長期的人白血病HL60細(xì)胞和小鼠白血病P388細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至每毫升2X105個(gè)細(xì)胞，按每孔200微升接種干96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37t:通入5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。每孔加樣品液或空白液各2微升，培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理鹽水溶液)10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，37°C、2000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，吸去上清。每孔加入匿SO各100微升，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結(jié)晶完全溶解后，利用MD公司產(chǎn)SPECTRAMAXPlus型酶標(biāo)儀測定每孔在570nm處的吸光值(OD值)。在同一塊96孔板中樣品的每個(gè)濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對(duì)照和無細(xì)胞調(diào)零孔(如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細(xì)胞調(diào)零)。各孔OD值先做相應(yīng)無細(xì)胞調(diào)零，再取三孔平均OD值按IR%=(OD空自對(duì)照-OD樣。。。)/0D空自對(duì)照X100X式計(jì)算每個(gè)濃度下的細(xì)胞增殖抑制率(IR%)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果化合物I對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制活性在SRB法測試中，化合物I在100iig/mL，10yg/mL和1yg/mL的濃度下，處理17小時(shí)，對(duì)小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞增殖的抑制率分別為18.8%，18.6%和16.9%。在SRB法或MTT法測試中，不同濃度的化合物I對(duì)人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌BEL-7402細(xì)胞、人白血病HL60細(xì)胞和小鼠白血病P388細(xì)胞的增殖抑制結(jié)果見表1。表1不同濃度的化合物I對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果在光學(xué)倒置顯微鏡下觀測到，經(jīng)高濃度的化合物I處理后，各種癌細(xì)胞呈不同程度的典型的壞死性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，表明化合物I在高濃度時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞具有一定的直接殺傷性細(xì)胞毒活性。3結(jié)論化合物I對(duì)多種人癌細(xì)胞及哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞具有直接殺傷作用和對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，特別是對(duì)BEL-7402和P388細(xì)胞的增殖抑制作用較強(qiáng)。這些結(jié)果表明化合物I可制成腫瘤細(xì)胞殺傷劑等抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。權(quán)利要求式I化合物，其特征在于，R1為氫、羥基、烴基、酰氧基、氨基或酰氨基；R2為氫、烴基。式IF2009101725178C0000011.tif2.權(quán)利要求1所述的式I化合物，其特征在于其中&為羥基；R2為甲基。3.權(quán)利要求1所述的式I化合物I，其特征在于在制備腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑中的用途。4.權(quán)利要求1所述的式I化合物，其特征在于在制備抗腫瘤藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及新穎的喹唑啉生物堿類化合物及其在抗腫瘤方面的用途。本發(fā)明采用新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)的喹唑啉生物堿類化合物作為腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。本發(fā)明的喹唑啉生物堿類化合物對(duì)多種人癌細(xì)胞及哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞具有直接殺傷作用和對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，特別是對(duì)BEL-7402和P388細(xì)胞的增殖抑制作用較強(qiáng)。文檔編號(hào)A61K31/517GK101709061SQ20091017251公開日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年11月9日優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日發(fā)明者劉睿,張敏,趙文英,韓小賢申請(qǐng)人:河南工業(yè)大學(xué)