專利名稱：人源化中和性抗流感ns1基因工程抗體制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人源化單克隆抗體的制備方法與用途，具體涉及一種人源化抗流感病毒NS1蛋白中和性抗體的制備方法與用途。
背景技術(shù)：
甲型流感是甲型流感病毒引起的一種急性、人畜共患呼吸道傳染性疾病。它的傳染性極強(qiáng)，極易造成世界范圍內(nèi)的大流行。歷史上流感的大流行曾經(jīng)奪去許多人的生命，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的公告，全球每年流感病例為6億 12億例，死亡50萬 100萬人，其中重癥流感病例300萬 500萬例，重癥流感的病死率為8% 10%。 2009年在墨西哥暴發(fā)并迅速在全球蔓延的人感染甲型(H1N1)流感疫情目前已造成近IO萬人感染，上千人死亡，引發(fā)全球恐慌。目前仍無特效的治療流感的方法。又由于其抗原變異性強(qiáng)，宿主范圍廣，各亞型間幾乎沒有交叉保護(hù)性，使得流感難以控制和頻繁爆發(fā)。而作為一類新型特異性抗病毒感染的生物工程制劑 一 中和性抗體，在抗感染治療及緊急被動(dòng)免疫預(yù)防方面一直扮演著重要的角色。因此，研制一種針對(duì)流感病毒的廣譜中和效應(yīng)的抗體用于緊急預(yù)防和治療是十分必要和可行的。 甲型H1N1病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒屬(Influenza virus A)，其遺傳物質(zhì)為RNA。甲型H1N1流感病毒攜帶有H1N1亞型豬流感病毒毒株，包含有禽流感、豬流感和人流感三種流感病毒的核糖核酸基因片斷，同時(shí)擁有亞洲豬流感和非洲豬流感病毒特征。典型病毒顆粒呈球狀，直徑為80nm 120nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA和M2蛋白。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼，呈螺旋狀對(duì)稱，直徑為10nm。豬流感病毒為單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組約為13. 6kb，由大小不等的8個(gè)獨(dú)立片段組成。共編碼10個(gè)多肽，其中節(jié)段1編碼PB2蛋白，節(jié)段2編碼PB1蛋白，節(jié)段3編碼PA蛋白，節(jié)段4編碼血凝素(HA)，節(jié)段5編碼核蛋白(NP)，節(jié)段6編碼神經(jīng)氨酸酶(NA)，節(jié)段7編碼基質(zhì)蛋白1和2(Ml/2)，節(jié)段8編碼非結(jié)構(gòu)蛋白1和2(NS1/2)。在8個(gè)基因片段中最短的是NS1基因。由于HA和NA分子容易發(fā)生抗原漂移或突變(每年每核苷突變率為10—"，其抗原性表現(xiàn)出很大的變異，而且A型流感病毒亞型眾多，各亞型誘導(dǎo)的抗體不能相互交叉保護(hù)。 而NS1蛋白是流感病毒NS1基因編碼的一種小分子、非結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白，可以編碼202-237氨基酸，能與特定RNA序列結(jié)合，然后對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后行為進(jìn)行調(diào)節(jié)，是一個(gè)具有多種活性的調(diào)控因子。NS1蛋白只在病毒感染的細(xì)胞中合成，并未被包裝進(jìn)病毒顆粒。在病毒感染早期即有大量NS1蛋白表達(dá)，其在細(xì)胞漿合成后很快轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，并積聚在病毒感染早期的胞核內(nèi)，在感染后期則聚積于核仁中，形成致密的晶體樣包涵體，提示NS1蛋白在病毒復(fù)制及早期抵抗機(jī)體的抗病毒免疫過程中具有重要作用。反向遺傳系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 NS1蛋白在保護(hù)流感病毒抵抗細(xì)胞IFN反應(yīng)中的重要作用，當(dāng)缺乏NS1基因時(shí)，重組病毒A/PR/8/34(HlNl)僅能在細(xì)胞IFN反應(yīng)缺陷時(shí)復(fù)制。研究表明，非結(jié)構(gòu)蛋白及其抗體可以作為病毒感染機(jī)體的一個(gè)重要標(biāo)記。
絕大多數(shù)甲型流感病毒NS1蛋白具有兩個(gè)比較重要的功能區(qū)A區(qū)和B區(qū)。A區(qū)為氨基端的RNA結(jié)合區(qū)，NS1蛋白可通過此區(qū)與不同種類的RNA包括dsRNA相結(jié)合；B區(qū)為分子羧基端的效應(yīng)區(qū)，此區(qū)可與宿主細(xì)胞核蛋白相互作用，抑制宿主細(xì)胞核mRNA的運(yùn)輸。通過這兩種途徑，NS1蛋白可拮抗IFN-a /|3 ，抑制細(xì)胞mRNA前體加工和mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)病毒mRNA翻譯，增強(qiáng)病毒復(fù)制等。因此，拮抗NS1蛋白的功能對(duì)于抑制甲型流感病毒復(fù)制和限制病毒傳播至關(guān)重要。 隨著抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)，抗體工程進(jìn)入嶄新的發(fā)展階段。通過基因重組技術(shù)將抗體分子在基因水平上重組、表達(dá)、純化，可獲得多種多樣的特異性的人源化抗體，為將來可能的臨床診斷、預(yù)防和治療提供可行性的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過運(yùn)用基因工程技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù)，直接從人抗體基因庫中篩選能與甲型流感病毒NS1抗原特異性結(jié)合的抗體，獲得其抗體基因并表達(dá)，用作臨床抗甲型病毒藥物評(píng)價(jià)和甲型病毒治療。 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的NS1蛋白只在病毒感染的細(xì)胞中合成，并未被包裝進(jìn)病毒顆粒。在病毒感染早期即有大量NS1蛋白表達(dá)，其在細(xì)胞漿合成后很快轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，并積聚在病毒感染早期的胞核內(nèi)，在感染后期則聚積于核仁中，形成致密的晶體樣包涵體，提示NS1蛋白在病毒復(fù)制及早期抵抗機(jī)體的抗病毒免疫過程中具有重要作用。反向遺傳系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 NS1蛋白在保護(hù)流感病毒抵抗細(xì)胞IFN反應(yīng)中的重要作用，當(dāng)缺乏NS1基因時(shí)，重組病毒A/PR/8/34(HlNl)僅能在細(xì)胞IFN反應(yīng)缺陷時(shí)復(fù)制。本發(fā)明采用NS1蛋白及其抗體
可以作為病毒感染機(jī)體的一個(gè)重要標(biāo)記這一特性，通過運(yùn)用基因工程技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù)，直接從人抗體基因庫中篩選能與甲型流感病毒NS1抗原特異性結(jié)合的抗體，獲得
其抗體基因并表達(dá)，用作臨床抗甲型病毒藥物評(píng)價(jià)和甲型病毒治療。
本發(fā)明的積極效果 —、提供一種新型的流感病毒及其藥物評(píng)價(jià)檢測(cè)方法。 二、提供一種可針對(duì)幼兒和老人等不適宜接種流感疫苗的人群進(jìn)行流感病毒感染后的治療。
具體實(shí)施方案 以下的優(yōu)先實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。
利用基因工程技術(shù)克隆人甲型流感病毒H1N1亞型NS1基因，在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)NS1蛋白，通過提取、純化獲得純度較高的NS1蛋白。用NS1蛋白做抗原對(duì)噬菌體抗體庫進(jìn)行富集篩選，并在E. coli中進(jìn)行分泌表達(dá)。通過ELISA、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定抗體對(duì)人甲型H1N1流感病毒特異性結(jié)合的功能活性，并進(jìn)行序列測(cè)定。然后將陽性克隆的輕鏈和重鏈Fd段基因，分別克隆入全抗體表達(dá)載體Pac-L-Fc，轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)。用ELISA、 IFA、 Western Blot和流式細(xì)胞儀對(duì)所獲人源單抗的功能特性進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例1 :抗原制備 利用基因工程技術(shù)將流感病毒NS1基因重組至表達(dá)載體pTXB l轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coliBL21 (DE3)，挑取LB (Amp+)瓊脂平板上的單菌落，接種于5ml LB (Amp+)培養(yǎng)基，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，次日按l : 100的比例轉(zhuǎn)種，擴(kuò)大培養(yǎng)至A600 二0. 5 0. 7時(shí)，加入終濃度為1. 0mmol/LIPTG，37。C表達(dá)6小時(shí)用50ml Columnbuffer平衡幾丁質(zhì)親和柱，取超聲破菌的上清液上樣，用80ml Column buffer去除雜蛋白，再用用30ml 30mmol/L DTT[使用前切割緩沖液(20mmol/LTris-HCl 500mmol/L NaCl，O. lmmol/L EDTA pH 8.0)稀釋]慢速?zèng)_洗柱子，關(guān)閉出樣口，4t:切割過夜。次日用不含DTT的30ml切割緩沖液沖洗，收集目的蛋白
峰，將所獲得的目的蛋白溶液置于透析袋內(nèi)，在磁力攪拌器的作用下，以蒸餾水為透析液透析48h，用蔗糖覆蓋透析袋以濃縮蛋白采用Bradford法對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行定量，并檢
測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量。 實(shí)施例2 :噬菌體抗體庫的生物篩選 以100g/ml的NS1抗原溶液150 ii 1 (溶于0. lmol/L pH 8. 6的NaHC03)包被96孔酶標(biāo)板，4t:孵育過夜。棄包被液，加滿1% BSA封阻液，4t:作用2h。用TBS緩沖液快速洗板6次。用lOOiil的TBST[Tris-HCl緩沖液+0. 1% (V/V) Tween-20]緩沖液稀釋2X1011pfu的噬菌體，然后加到已包被好的孔中，室溫溫和搖動(dòng)60min。 TBST緩沖液洗板10次，然后加入0. 2mol/LGlycine-HCl (pH2. 2)洗脫15min，再用lmmol/L Tris-HCl 15 ii 1 (pH 9. 1)中和上述洗脫液，即第1輪特異性結(jié)合噬菌體。把第1輪篩選物進(jìn)行擴(kuò)增和純化，然后依次進(jìn)行第2次和第3次親和篩選。每次加入的噬菌體量都為2X 10"pfu，第2、3輪篩選包被的抗原量分別為10、 1 y g/ml， TBST中Tween-20的濃度增至0. 5% (V/V)，其余步驟與第一輪篩選相同。 實(shí)施例3 :特異性噬菌體的擴(kuò)增和純化 接種E. coliER2738單菌落于20ml LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期。加入未擴(kuò)增洗脫物。37。C劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)4. 5h。然后4°C， 10000Xg離心10min。取上清10000Xg離心。將上清的上部80%轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6PEG/NaCl。噬菌體4。C沉淀過夜。4°C，10000Xg離心15min。棄上清再短暫離心。沉淀物重懸于lml TBS中，4"離心5min使殘余細(xì)胞沉淀。取上清，用1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育60min。 4。C 10000Xg離心10min，棄上清。沉淀物重懸于200ii1 TBS， 0. 02% NaN3中。10000 X g離心lmin，取上清，此即為擴(kuò)增后的洗脫物。 實(shí)施例4 :噬菌體滴度的測(cè)定和挑取藍(lán)色噬菌斑 接種ER2738單菌落于10mlLB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。分成200 y 1等份于微量離心管中，每管加入10iU不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫溫育3min。將感染細(xì)胞加入45t:預(yù)溫的上層瓊脂培養(yǎng)管中，每次管，快速混勻，立即傾注于37t:預(yù)溫的LB/IPTG/X-gal平板上，37t:培養(yǎng)過夜。次日計(jì)算噬菌體滴度。從第3輪篩選后的洗脫產(chǎn)物測(cè)定滴度后，用滅菌牙簽在總量不到100個(gè)噬菌斑的平板上隨機(jī)挑選20個(gè)藍(lán)色噬菌斑，分別置lml接種了處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期的E. coli ER2738的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增和純化并測(cè)定滴度。 實(shí)施例5 :ELISA鑒定特異性結(jié)合的陽性噬菌體克隆 用100 ii 1 100 ii g/ml的NS1抗原(溶于0. lmol/LpH 8. 6NaHC03中)包被ELISA板，fC包被過夜。棄包被液，滿1 % BSA封阻液，4t:作用lh。 TBST洗板6次，加入TBST系列稀釋的擴(kuò)增噬菌體，100 ii 1/孔。室溫震蕩作用lh。 TBST洗板6次，加入HRP標(biāo)記的抗
5M13抗體，200 ii 1/孔，室溫震蕩作用lh。 TBST洗板6次，加入TMB顯色液顯色，2mol/L H2S04 終止顯色，測(cè)定450nm處的光密度(OD)值。用抗體庫中的噬菌體作陰性對(duì)照，TBST作空白 對(duì)照。 實(shí)施例6 :競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)噬菌體陽性克隆特異性 用包被液稀釋的NS1抗原(100iig/ml)包被酶標(biāo)板4。C過夜，4t:封閉lh后，加 50ii1(1011 pfu/ml)噬菌體溶液與50iU不同濃度(50、25、12. 5、6. 25ii g/ml)的NS1抗原 混合液，37。C孵育lh，TBST[Tris-HCl緩沖液+0. 5% (V/V) Tween-20)洗滌，再加入1 : 5000 稀釋的HRP標(biāo)記的抗M13抗體100iil/孔，37。C孵育lh，以TMB顯色10min后，2mol/L H2S04 終止顯色，酶標(biāo)儀讀取OD值(波長(zhǎng)450nm)。
實(shí)施例7 :使用人源化NS1抗體檢測(cè)流感病毒 雙抗體夾心酶免試劑的研制將抗NS1的單克隆抗體利用CB稀釋到lmg/ml，以每 孔100iU的量包被到酶標(biāo)板上；同時(shí)將抗NS1的單克隆抗體同辣根過氧化物酶或堿性磷酸 酶相偶聯(lián)，制成雙抗體夾心檢測(cè)試劑。將疑似患者的鼻腔分泌物、口腔分泌液、血液等稀釋 一倍后取100 iU加到加樣孔，37t:溫育30分鐘，洗板五次后，將NS1單克隆抗體同辣根過 氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的偶聯(lián)物稀釋到10 y g/ml加入到加樣孔中，37t:溫育30分鐘， 洗板五次后，加入顯色劑顯色，如果顯色即可認(rèn)為該患者感染流感病毒。
金標(biāo)試紙條的研制將NS1單克隆抗體用PBS(Ph7. 8，0. 02M PB，O. 17M NaCl)稀釋 到4mg/ml，以點(diǎn)或線的形式包被到NC膜上，同時(shí)將NS1的單克隆抗體包被到金、硒等顯色物 質(zhì)上制成試紙條，將可疑性患者的鼻腔分泌物、口腔分泌物、血液等稀釋一倍后取50 iU點(diǎn) 到加樣膜上，過10-15分鐘如果包被NS1單克隆抗體的包被線顯色即可認(rèn)為該患者感染流 感病毒。 實(shí)施例8 :使用人源化NS1抗體進(jìn)行病毒中和實(shí)驗(yàn) —定濃度的流感病毒與倍比稀釋的NS1抗體等量混合，室溫放置lh。取9-10日齡 雞胚，75 %酒精消毒后氣室朝上置于超凈臺(tái)，用無菌鑷子、剪刀在氣室端開一小口 ，從小口 中滴入無菌的液體石蠟，輕輕晃動(dòng)雞胚，使液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層鋪開。注射器吸取標(biāo)本 剌入尿囊腔，每個(gè)雞胚接種0. 2ml。每個(gè)稀釋度接種4只雞胚，無菌醫(yī)用膠布封口后37t:孵 育72h至7天，每天取一只胚檢查雞胚尿囊液的血凝活性，不出現(xiàn)血凝活性的最高稀釋度即 為血清中和抗體滴度。
權(quán)利要求
人源化中和性抗流感NS1基因工程抗體制備方法與用途，其特征為通過運(yùn)用基因工程技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù)，直接從人抗體基因庫中篩選能與甲型流感病毒NS1抗原特異性結(jié)合的抗體，獲得其抗體基因并表達(dá)，用作臨床抗甲型病毒藥物評(píng)價(jià)和甲型病毒治療。
2. 如權(quán)利要求1所述的NS1基因工程抗體，其特征是可與流感病毒發(fā)生中和反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人源化抗流感病毒NS1蛋白中和性抗體的制備方法與用途。通過運(yùn)用基因工程技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù)，直接從人抗體基因庫中篩選能與甲型流感病毒NS1抗原特異性結(jié)合的抗體，獲得其抗體基因并表達(dá)，用作臨床抗甲型病毒藥物評(píng)價(jià)和甲型病毒治療。
文檔編號(hào)A61P31/16GK101712719SQ20091017250
公開日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日
發(fā)明者楊麗萍, 袁福寧 申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院