柳葉蠟梅總生物堿提取物及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥和保健品領域，具體涉及柳葉蠟梅總生物堿提取物及其單體化合物在制備治療消化道腫瘤疾病方面的藥物或保健品中的應用。本發(fā)明從蠟梅科蠟梅屬植物柳葉蠟梅中提取和制備柳葉蠟梅總生物堿提取物及其山蠟梅堿類單體化合物（1?4），并經(jīng)實驗證實，所述柳葉蠟梅總生物堿提取物能顯著抑制胃癌SGC-7901、結腸癌SW1116、結腸癌HCT116細胞的增殖和誘導癌細胞凋亡；所述生物堿單體化合物對胃癌SGC-7901、結腸癌SW1116、結腸癌HCT116細胞具有不同程度的抑制作用。本發(fā)明的柳葉蠟梅提取物及其單體化合物可單獨應用或者合用，或與適宜的賦形劑結合，按照常規(guī)方法制成口服或非口服劑型用于治療或輔助消化道腫瘤疾病，尤其是制成治療胃癌和結腸癌的藥物或保健制品。
【專利說明】
柳葉蠟梅總生物堿提取物及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥和保健品領域，具體涉及柳葉蠟梅總生物堿提取物及其制備方 法和應用，具體涉及柳葉蠟梅總生物堿提取物及其單體化合物在制備治療消化道腫瘤疾病 方面的藥物或保健品中的應用。 技術背景
[0002] 現(xiàn)有技術公開了胃癌和結腸癌是我國常見的消化系腫瘤，就發(fā)病率和死亡率而 言，胃癌在我國居各種惡性腫瘤的首位，而結腸癌在我國也是處于逐年上升的趨勢，在發(fā)達 國家要列于前三位。對于消化系的兩大常見腫瘤，現(xiàn)代醫(yī)學通常是以手術治療為主、化療為 輔，醫(yī)療實踐顯示，上述治療干預措施副作用大，且術后復發(fā)轉移幾率非常高，并發(fā)癥較多， 因此，目前在預防和治療方面缺乏有效的措施和方法。中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，有標本兼 治、虛實并治、緩急兼收之功效，近年來中醫(yī)藥在治療惡性腫瘤方面已取得了良好效果。因 此，如何在中醫(yī)理論指導下發(fā)掘中醫(yī)特色和優(yōu)勢，開發(fā)毒副作用小、療效可靠、經(jīng)濟安全、使 用方便的中草藥制劑或中藥新藥治療惡性腫瘤是一個亟待探索的課題。
[0003] 畬藥是我國民族特色藥物之一，在畬族中有著悠久的應用歷史。柳葉蠟梅 (Chimonanthus salicifolius)，俗稱石涼茶、食涼撐、山錯茶，是我國浙江麗水畬族人民應 用最廣泛的的草藥之一。經(jīng)檢測畬鄉(xiāng)民間用柳葉蠟梅的葉加工制成食涼茶中主要含有桉葉 素、生物堿、黃酮類和鯊肌醇等成分，其中VB1、VB2、VC含量豐富，并含有18種人體必需的氨 基酸，同時還含有鐵、鋅、鈣、鎂、硒等人體必需的微量元素，是一種很好的天然保健藥。1997 年版中國藥典一部收載"柳葉蠟梅葉及其制劑柳葉蠟梅茶"有祛風解表、清熱解毒之功效， 用于防治感冒和流行性感冒。且由柳葉蠟梅葉中提取的揮發(fā)油成分研制而成的脾胃舒膠 囊，具有理氣健脾、消食化積之功效，臨床用于治療寒濕困脾、肝胃不和的消化功能紊亂、胃 部疾患等癥。此外，有臨床研究采用柳葉蠟梅提取物用于輔助化療胃腸道惡性腫瘤（胃癌、 大腸癌)的治療。然而，迄今尚未見柳葉蠟梅提取物用于胃癌、結腸癌藥物上的應用，更未見 關于柳葉蠟梅總生物堿提取物及其生物堿單體化合物的相關研究的報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供新的治療消化道腫瘤疾病的藥物或保健品，具體涉及柳葉 蠟梅總生物堿提取物及其制備方法和應用，更具體涉及柳葉蠟梅總生物堿提取物及其單體 化合物和在制備治療消化道腫瘤疾病的藥物或保健品中的應用。
[0005] 本發(fā)明經(jīng)研究證實，柳葉蠟梅中含有生物堿成分，且在隨機活性篩選實驗中發(fā)現(xiàn) 總生物堿提取物對消化道腫瘤細胞具有抑制活性，因此，所述的柳葉蠟梅總生物堿提取物 及其山蠟梅堿類單體化合物可進一步用于制備治療消化道腫瘤疾病的藥物或保健品。
[0006] 本發(fā)明中，還提供了柳葉蠟梅總生物堿提取物及其山蠟梅堿類單體化合物（1- 4) 的提取和制備方法。
[0007] 本發(fā)明的活性成分柳葉蠟梅總生物堿提取物及其山蠟梅堿類單體化合物可從柳 葉蠟梅枝和葉經(jīng)由本領域所涉常規(guī)的方法制備而得。
[0008] 具體的，本發(fā)明的柳葉蠟梅總生物堿提取物，可通過下述方法制得：以柳葉蠟梅 枝葉為原料，采用溶劑提取法制成濃縮提取物。所采用的溶劑提取法中，可以選用水、甲 醇、乙醇、丙酮等單一溶劑或多種溶劑的混和溶劑，以50~95%乙醇為最佳提取溶劑，在室 溫下浸漬提取或加熱條件下回流提取，提取次數(shù)為2~3次，提取液濃縮后懸浮于適量3% 酒石酸水溶液中，以等體積的乙酸乙酯萃取2~3次；酒石酸水溶液以Na 2C03調節(jié)pH值 至10,然后用氯仿進行萃取，獲得總生物堿(氯仿提取物）；進一步，經(jīng)柱色譜分離、純化， 從柳葉錯梅氯仿提取物中依次得到下式單體化合物salicifoxazines A (1)和B (2)， (-)-chimonanthine (3)和（meso)-chimonanthine (4)，
其中，所述的單體化合物1和2,通過1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR和MS，確定其化學結構如 下式所示：
Salicifoxazine A (1) ：[a ]D-243. 9 (c 0. 37, MeOH) ; UV (MeOH) Anax(l〇g e) 241 (3.87), 298 (3.45) nm; IR (film) vnax： 3279, 2930, 2850, 1604, 1483, 1379 cm1; 4-匪1? (400MHz，CDC13):S 2.44 (2H, m, overlapped, H-2), 2.63 (1H, ddd, overlapped, H-3), 1.71 (1H, td, 4.9, 11.8, H-3), 7.16 (1H, dd, 7.5, 1.0, H-4), 6.74 (1H, td, 7.5, 1.0, H-5), 7.07 (1H, td, 7.5, 1.0, H-6), 6.61 (1H, dd, 7.5，1.0，H-7), 4.47 (1H, brs, H-8a), 2.27 (3H, s, N「CH3); S 2.66 (1H, ddd, overlapped, H-2'），2.33 (1H，td，11.3，3.5，H-2'），2.45 (1H，m，H-3'），2.02 (1H，ddd，2.2，3.5，13.3，H-3'），7.21 (1H，dd，7.5，1.0，H-4'），6.86 (1H，td， 7.5，1.0，H-5'），7.17 (1H，td，7.5，1.0，H-6'），6.71 (1H，dd，7.5，1.0，H-7'）， 5.11 (1H，brs，H-8a'），2.41 (3H，s，&，-〇13);13C-NMR (100 MHz, CDC13): S 52.9 (C-2)， 34.3 (C-3)， 125.7 (C-4)， 118.6 (C-5)， 128.3 (C-6)， 109.2 (C-7)， 64.1 (C-3a), 132.3 (C-4a), 151.1 (C-7a), 85.2 (C-8a), 37.2 (N「CH3); S 53.8 (C-2，）， 27.3 (C-3'），125.1 (C-4'），118.8 (C-5'），128.5 (C-6'），109.5 (C-7'），50.9 (C-3a'），129.4 (C-4a'），151.1 (C-7a'），93.2 (C-8a'），46.3 (Ni'-CHd; (+) ES頂S m/z 363 [M+H] + ; EIMS m/z (rel. int. ) 362 (6.8), 173 (50.0), 172 (50.7), 143 (69.4), 130 (96.7); HRESIMS m/z 363.2176 [M+H]+ (calcd for C22H27N40, 36 3 . 2 1 79, A = -〇. 9 ppm). Salicifoxazine B (2)：[a]D-2. 2 (c 0.32, MeOH) ; UV (MeOH) Anax (log e) 241 (3.62), 294 (3.20) nm; IR (film) vnax： 3265, 2925, 2848, 1605, 1483, 1379 cm1; iH-NMRUOOMHzJDClJJ 2.67 (1H, m, H-2), 2.43 (1H, m, overlapped, H-2), 2.53 (1H, ddd, 6.5, 8.3, 11.8, H-3), 1.84 (1H, m, H-3), 6.51 (1H, d, overlapped, H-4), 6.47 (1H, t, 7.5, H-5), 6.97 (1H, t, 7.5, H-6), 6.47 (1H, d, 7.5, H-7), 4.83 (1H, brs, H-8a), 2.39 (3H, s, N「CH3); S 2.83 (1H, ddd, 3.8，5.3，10.2， H-2'），2.46 (1H, m, H-2'），2.46 (1H, m, overlapped, H-3'），2.38 (1H, m， overlapped, H_3'），6.61 (1H, d, overlapped, H_4'），6.75 (1H, t, 7.5，H_5'）， 7.12 (1H，t，7.5，H-6'），6.55 (1H，d，7.5，H-7'），5.26 (1H，brs, H-8a'），2.49 (3H, s, Nr-CH3) ; 13C-NMR (100 MHz, CDC13) : 8 52. 7 (C-2), 35.0 (C-3), 124.9 (C-4), 118.2 (C-5), 127.9 (C-6), 108.8 (C-7), 64.3 (C-3a), 132.3 (C-4a), 150.9 (C-7a), 83.6 (C-8a), 36.4 (N「CH3); S 53.9 (C-2'），28.4 (C-3'），123.8 (C-4'）， 118.9 (C-5'），128.4 (C-6'），109.7 (C-7'），50.8 (C-3a'），130.4 (C-4a'），150.7 (C-7a, ), 92.3 (C-8a, ), 46.4 (Nr-CH3) ; (+) ESIMS m/z 363 [M+Na] + ; EIMS m/z 362 (5.0), 173 (81.3), 172 (100.0), 143 (31.5), 130 (80.9); (+) HRESIMS m/z 385.1995 [M+H]+ (calcd for C22H26N40Na, 385.1999, A = -1. 0 ppm). 〇
[0009] 本發(fā)明進行了 MTT活性測試實驗，結果表明所述的，柳葉蠟梅總生物堿提取物及 其山蠟梅堿類單體化合物對胃癌SGC-7901，結腸癌SW1116、HCT116細胞具有明顯的抑制作 用。
[0010] 本發(fā)明所述的柳葉蠟梅提取物及其單體化合物可單獨應用或者合用，或與適宜的 賦形劑結合，按照常規(guī)方法制成口服或非口服劑型用于治療消化道腫瘤疾病，尤其是制成 治療胃癌和結腸癌的藥物。
[0011] 本發(fā)明所述的柳葉蠟梅提取物及其單體化合物可單獨應用或者合用，或與適宜的 賦形劑結合，按照常規(guī)方法制成口服或非口服劑型用于輔助治療消化道腫瘤疾病保健品制 劑，尤其是制成輔助治療胃癌和結腸癌的藥物保健品制劑。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點是： 1，提供了柳葉蠟梅總生物堿提取物及山蠟梅堿類單體化合物對消化道腫瘤，尤其是胃 癌和結腸癌的治療新用途，且應用前景廣闊； 2, 其中的單體化合物1 -4結構獨特，尤其是其中的化合物1和2為從臘梅科植物中獲 得的具有六元氮氧雜環(huán)的新化合物，天然產(chǎn)物中此類結構十分罕見； 3, 柳葉蠟梅在我國南方分布廣泛，自然資源豐富，價廉易得； 4, 柳葉蠟梅總生物堿提取物及單體化合物的提取及制備工藝簡便易行，作為治療消化 道腫瘤的藥物，能有效簡化治療方案，降低治療成本。
【具體實施方式】
[0013] 下述實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明有任何限制。本 領域技術人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作的任何變動都將落在權利要求書 的范圍內。
[0014] 實施例1:制備柳葉蠟梅總生物堿提取物 取干重2. 0 kg柳葉蠟梅枝葉，粉碎，用3倍量的90%甲醇室溫冷浸24小時，共3次。合 并3次提取液，減壓濃縮，得到300 g浸膏，浸膏用2倍量的3%酒石酸水溶液混懸，用與混 懸液等體積的乙酸乙酯進行萃取三次，然后用Na2C0 3將酒石酸水溶液部分調至pH = 10,再 用氯仿萃取三次，氯仿萃取部分減壓濃縮后得浸膏2. 3 g，即為柳葉蠟梅總生物堿提取物。
[0015] 實施例2:制備柳葉蠟梅總生物堿提取物 取干重2. 0 kg柳葉蠟梅枝葉，粉碎，用80%乙醇室溫下回流3小時，重復3次，合并提 取液，減壓濃縮得浸膏330 g，浸膏用2倍量的3%酒石酸水溶液混懸，用與混懸液等體積的 乙酸乙酯萃取三次，然后用Na2C0 3將酒石酸水溶液調至pH = 10,以等體積氯仿萃取三次， 氯仿萃取部分減壓濃縮后得柳葉蠟梅總生物堿提取物浸膏2. 6 g。
[0016] 實施例3:制備生物堿單體化合物（1 - 4 ) 將制得的2.0 g總生物堿浸膏以等倍硅膠（100~200目）拌樣，以50倍量的硅膠 (200~300目）進行柱層析，用二氯甲烷：甲醇作為流動相梯度洗脫洗脫(體積比1:0 - 0:1)。收集二氯甲烷：甲醇（15:1，體積比）洗脫組分，該組分繼續(xù)過硅膠柱，采用二氯 甲烷：甲醇50 :1、30:1、10:1洗脫，對30:1洗脫組分采用制備HPLC進行純化，以甲醇： 水：二乙胺（68:32:0. 05%)等度洗脫，收集17. 2 min組分，得到12. 2 mg白色無定形 粉末（-)-chimonanthine (3)，收集13.0 min組分，得到8.1 mg的白色無定形粉末 8已1：[(^;1^(?32；[116 13(2);以甲醇：水：二乙胺（75:25:0.05%)等度洗脫，收集10.6 111；[11組 分，得到白色無定形粉末（meso)-chimonanthine (4) 4.6 mg;以甲醇：水：二乙胺（55:45: 0.05%)等度洗脫，收集15.5 111；[11組分，4.2 11^得到淡黃色膠狀物831;[(^;1；'(?32；[116 4(1)。
[0017] 實施例4: 將2. 0 g總生物堿浸膏上樣至大孔樹脂HP-20,分別以水、50%乙醇、90%乙醇洗脫，將 50%乙醇洗脫部分上S印hadex LH-20,采用二氯甲烷：甲醇2:1洗脫，通過TLC檢測合并得 到4.3 11^的（111680)-(311；[1]10仙111：11；[116(4)和3.8 11^的8&1；[(^；1^0叉&2；[116八（1)，其余組分 合并后采用制備HPLC進行純化，以甲醇：水：二乙胺（68 :32 :0. 05%)等度洗脫，收集17. 2 min組分得13. 2 mg白色無定形粉末（-)-chimonanthine (3)，收集13. 0 min組分得8. 7 mg的白色無定形粉末salicifoxazine B (2)0
[0018] 實施例5:總生物堿提取物及單體化合物對消化道腫瘤細胞增殖的抑制作用 本實施例中，為了探究總生物堿提取物及單體化合物對消化道腫瘤細胞的抑制效果， 選擇了 3種惡性消化道腫瘤細胞系（胃癌SGC-7901、結腸癌SW1116、結腸癌HCT116 )，并對其 進行體外活性測試，具體的方法與結果如下： 1)材料及方法 細胞株：胃癌SGC-7901、結腸癌SW-1116購買于中科院上海細胞生物學研究所，結腸癌 HCT-116由華東師范大學趙正教授提供。HCT-116細胞接種于含10%熱滅活新生牛血清、 10萬U/L青霉素和10萬U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 °C、5% C02條件下培養(yǎng)，用 0. 25%的胰酶消化傳代； 主要試劑：四甲基偶氮唑藍（MTT)(美國sigma公司）;二甲基亞砜（DMS0)(美國sigma 公司）；胰蛋白酶(美國resco公司）；1640培養(yǎng)基（賽默飛生物化學制品有限公司）；5_氟尿 啼啶(美國sigma公司）；胚牛血清（FBS,美國sigma公司）； MTT檢測抑制活性：取對數(shù)生長期的各腫瘤細胞（胃癌SGC-7901、結腸癌SW1116、 HCT116)以5000個/孔分別接種于96孔板，接種24h后，分別加入含不同濃度的柳葉蠟梅 總生物堿和單體化合物樣品，對照組加新鮮培養(yǎng)液，每個濃度及對照組（5-氟尿嘧啶）均設 6個復孔，在37° e培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于48h后加入5mg/mLMTT溶液10 yL于37° C培養(yǎng)箱 中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去上清，加入150 yL DMSO振蕩十分鐘后用酶聯(lián)免疫檢測儀器測定各 孔在570 nm處的吸光度，按下式計算細胞生長抑制率，抑制率（％)= (1-A$M /A,- ) X 100% ; 根據(jù)各組樣品對不同腫瘤細胞的生長抑制率，用LOGIT法計算得出個樣品對各腫瘤細胞的 半數(shù)抑制濃度（IC 5。)，測試數(shù)據(jù)如下：
結果顯示： 柳葉蠟梅總生物堿提取物及單體化合物對不同消化道腫瘤細胞的抑制活性不同， 其中，化合物1對結腸癌SW1116細胞的生長具有明顯的抑制作用，化合物2和4對胃癌 SGC-7901細胞的生長具有明顯的抑制活性，化合物3對結腸癌HCT116細胞的生長具有明顯 的抑制活性。
【主權項】
1. 柳葉蠟梅總生物堿提取物及其單體化合物，其特征在于，通過下述方法制備：W柳 葉蠟梅枝葉為原料，采用溶劑提取法制成濃縮提取物；其中，W水、甲醇、乙醇或丙酬單一 溶劑或多種溶劑的混和溶劑為提取溶劑，在室溫下浸潰提取或加熱條件下回流提取2~3 次，提取液濃縮后懸浮于適量3%酒石酸水溶液中，W等體積的乙酸乙醋萃取2~3次；酒石 酸水溶液W NazCOs調節(jié)抑值至10,然后用氯仿進行萃取得氯仿提取物，獲得總生物堿；再 經(jīng)柱色譜分離、純化，從所述氯仿提取物中依次得下式單體化合物salici化xazines A (1) 和 B (2)，（ 一 )-chimonanthine (3)和（meso)-chimonanthine (4)，2. 按權利要求1所述的柳葉蠟梅總生物堿提取物及其單體化合物，其特征在于，所述 制備方法中：W 50~95%乙醇為提取溶劑。3. 權利要求1所述的柳葉蠟梅總生物堿提取物及其單體化合物在制備治療消化道腫 瘤藥物或保健品中的應用。4. 按權利要求3所述的用途，其特征在于所述的消化道腫瘤是胃癌或結腸癌。5. -種治療消化道腫瘤的藥物組合物，其特征在于：包括權利要求1所述的柳葉蠟梅 總生物堿提取物或其單體化合物和藥學中常用的賦形劑。6. -種輔助治療消化道腫瘤的保健品，其特征在于：包括權利要求1所述的柳葉蠟梅 總生物堿提取物或其單體化合物和保健品中常用的賦形劑。7. 根據(jù)權利要求5所述的治療消化道腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組 合物制成經(jīng)口服給藥的制劑和非口服給藥的注射劑。8. 根據(jù)權利要求6所述的輔助治療消化道腫瘤的保健品，其特征在于，所述的保健品 制成經(jīng)口服給藥的制劑和非口服給藥的注射劑。
【文檔編號】A61K31/5365GK105985358SQ201510081635
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月15日
【發(fā)明人】胡金鋒, 麻光磊, 楊國勛, 熊娟
【申請人】復旦大學