專利名稱：編碼禽類細胞因子的減毒溶瘤性副粘病毒的制作方法
編碼禽類細胞因子的減毒溶瘤性副粘病毒Mit本發(fā)明涉及包含至少一種編碼禽類細胞因子的轉(zhuǎn)基因的重組溶瘤性RNA新城疫 病毒，其中該重組溶瘤性RNA新城疫病毒可從強毒力或中等毒力的溶瘤性RNA新城疫病毒 獲得。在天然宿主細胞中，病毒介導的細胞因子表達導致該病毒對禽類物種的致病性降低。本發(fā)明中的病毒適于治療疾病，尤其適于溶瘤性腫瘤療法。產(chǎn)生了編碼禽類細胞 因子的重組病毒，其中該病毒的致病性對禽類物種降低，從而導致該病毒的環(huán)境毒性降低。 該病毒的溶瘤活性不因所述降低致病性的方法受損。病毒基因組可以編碼額外的治療性轉(zhuǎn) 基因，優(yōu)選地是結(jié)合蛋白(抗體、錨蛋白重復(fù)序列分子、肽等)。這些結(jié)合蛋白、前體藥物轉(zhuǎn) 化酶和/或蛋白酶的活性提高該病毒的抗腫瘤作用。另外，本發(fā)明公開了如此修飾的病毒 的制備及其用于治療癌癥用途。
背景技術(shù)：
新城疫病毒在Chiocca(2002)中綜述了通常用于治療腫瘤的溶瘤性病毒。新城疫病毒(NDV) 已經(jīng)作為實驗性治療劑使用超過40年，見Sinkovics和Horvath (2000)綜述。新城疫病毒 通常在Alexander (1988)的書籍中描述。正在將NDV毒株P(guān)V701開發(fā)為針對成膠質(zhì)細胞瘤 的抗癌療法(Lorence等人，200 。NDV毒株MTH68已經(jīng)作為實驗性癌癥療法使用并且已經(jīng) 施用至人超過30年(Csatary等人，2004)。在Mojdl等人Q003)的論文中，描述了用水泡性口炎病毒(VSV)感染后，在 80%全部所測試腫瘤細胞系的范圍內(nèi)存在干擾素應(yīng)答缺陷?？梢约俣ㄏ嗨瓢俜謹?shù)的腫瘤 細胞系將易感于NDV感染，因為VSV和NDV均是單股負鏈RNA病毒目的成員。也已經(jīng)顯示 NDV在腫瘤細胞中的選擇性復(fù)制機制基于針對病毒的細胞干擾素應(yīng)答的缺陷(見例如US 20030044384)。副粘病毒含有負極性的單鏈RNA基因組，具有長度15-191Λ的基因組(野生型)并 且基因組含有6-10種基因。病毒包膜由表面糖蛋白和從宿主細胞衍生的膜部分形成。表 面糖蛋白(F和HN或H或G)介導病毒進入和從宿主細胞離開。核衣殼位于包膜內(nèi)并含有 RNA基因組和負責細胞間病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)。基 質(zhì)蛋白(M)連接病毒包膜和核衣殼。除了編碼結(jié)構(gòu)蛋白的這些基因，副粘病毒科病毒可以 含有“附屬”基因，所述附屬基因可以是與上文所提及的基因一起分布的額外轉(zhuǎn)錄單位。所 述附屬基因大多是與P基因轉(zhuǎn)錄單位重疊的0RF?？梢栽?Lamb，2001)中找到對副粘病毒 科的廣泛描述。NDV是屬于單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)的副粘病毒科 (Paramyxoviridae)中禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)的原型成員。病毒基因組是編碼以下6種主要蛋白質(zhì)單鏈負股RNA 核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白 (P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(HN)和聚合酶蛋白(L)。通過P蛋白mRNA的 編輯作用，翻譯出一種或兩種額外蛋白質(zhì)V(和W)。
NDV 在 Alexander (1988)和 LamM2001)中詳細表征。作為禽類病原體的新城疫病毒NDV毒株根據(jù)它們對雞的致病性分類為導致全部年齡雞急性致死性感染的強毒株 (高度毒力)、僅在幼雞中有致死性的中等毒力分離株(中間毒力)和表現(xiàn)為溫和或不明顯 疾病形式的輕型毒株(無毒力)。NDV分離株的強毒、中毒和低毒分類由殺死胚的最小致死 劑量接種后9日齡含胚卵中雞胚的平均死亡時間(MDT)決定。NDV毒力的決定因素之一似 乎是前體F蛋白的切割位點。1擬6年在英格蘭泰恩河畔新城和在印度尼西亞爪哇觀察到首次NDV暴發(fā)。自從本 病首次首先以來已經(jīng)描述了 3次NDV大流行。NDV主要通過易感鳥類所吸入的氣溶膠或大液滴傳播。感染期間，新的感染性病毒 顆粒將從感染的呼吸道撒播或在糞便中分泌出來。新感染可以因健康鳥類攝取這種含病毒 物質(zhì)而建立并且可以維持從一只鳥至另一只鳥的病毒傳播。在Alexander(1997) ,Diseases of Poultry 中詳細描述了作為禽類病原體的NDV。新城疫免疫接種在上世紀伊始已經(jīng)將NDV視為家禽場的威脅并且認識到需要免疫接種。Iyer和 Dobson在二十世紀三十年代開展強毒NDV毒株減毒的研究，導致開發(fā)一些中等毒力NDV疫 苗株?；钜呙玳_發(fā)因建立低毒力疫苗株Hitchner Bl和LaSota而向前進展，所述疫苗株現(xiàn) 在是廣泛使用的NDV疫苗。其他免疫接種策略包括使用連同載體佐劑(氫氧化鋁、油乳劑) 一起給予的(例如通過福爾馬林、β-丙內(nèi)酯)滅活的NDV疫苗。在Alexander (1997) Diseases of Poultry中詳細描述了 NDV疫苗開發(fā)的歷史和 實際狀態(tài)?；诜聪蜻z傳學技術(shù)所產(chǎn)生的重組NDV的下一代獸用疫苗在Huang等人Q003) 中綜述并且重組NDV疫苗在以下專利中描述。US 6, 699, 479B1描述了以降低的水平表達其V蛋白并且用于免疫接種孵化前胚 的新城疫病毒(NDV)突變體。US 2004/0043035涉及不能表達核蛋白(NP)的免疫優(yōu)勢表位并適合作為標記疫
苗株的重組NDV突變體。US 2003/0224017描述了用于產(chǎn)生重組NDV疫苗的NDV反向遺傳系統(tǒng)。該系統(tǒng)允 許表達轉(zhuǎn)基因例如來自NDV基因組的禽類細胞因子(雞IL-2、雞IL-4)以產(chǎn)生NDV疫苗株。EP 1 300 157涉及適合用于卵內(nèi)(in ovo)免疫接種禽類物種的減毒突變新城疫 病毒毒株，該毒株在編碼HN和/或F糖蛋白的基因序列中包含突變。US 6，719，979涉及用于完全從克隆的全長cDNA產(chǎn)生感染性新城疫病毒(NDV)的 方法并涉及以該方法產(chǎn)生和從該方法衍生的疫苗及診斷測定法的用途。WO 2007/02M31描述了用于產(chǎn)生重組減毒的新城疫La Sota毒株的方法及其在 制備用于預(yù)防由新城疫病毒(NDV)所致疾病的疫苗中的用途。WO 2000/067786涉及用于制備減毒的感染性新城疫病毒(NDV)的cDNA。包含減 毒感染性NDV的疫苗處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。重組副粘病毒EP-A-O 702 085涉及遺傳學操作的感染性復(fù)制型不分節(jié)段的負鏈RNA病毒突變體，所述突變體包含在病毒基因組的可讀框、假基因區(qū)或基因間區(qū)中的插入和/或缺失。WO 99/66045涉及從病毒基因組全長cDNA分子獲得的遺傳修飾的NDV病毒。WO 00/62735涉及腫瘤治療方法，其包括施用干擾素敏感的有復(fù)制能力的克隆性 RNA病毒，例如NDV。在WO 01/20989 (PCT/US00/26116)中，描述了用重組溶瘤性副粘病毒治療患有腫 瘤的患者的方法。腫瘤因施用有復(fù)制能力的副粘病毒科病毒而縮小。描述了可以用來工程 化病毒基因組以改善溶瘤屬性的多種方法。WO 03/005964涉及了包含編碼細胞因子的核酸的重組VSV。US 2004/0170607涉及通過施用病毒治療黑素瘤，其中所述病毒不是常見的人病原體。NDV的遺傳學操作NDV可以使用如例如EP-A-O 702 085中所述的反向遺傳學技術(shù)進行遺傳學操作。 例如，已知產(chǎn)生了包含額外核酸的重組NDV構(gòu)建體，其中所述的額外核酸編碼分泌性堿性 磷酸酶(Zhao和Peeters，2003)、綠色熒光蛋白(Engel-Herbert等人，200 、傳染性法氏囊 病病毒VP2蛋白(Huang等人，2004)、流感病毒血凝素(Nakaya等人，2001)和霉素乙?；D(zhuǎn) 移酶(Huang等人，2001) (Krishnamurthy等人，2000)。這些重組NDV沒有一個構(gòu)建用于治 療人疾病。產(chǎn)生重組NDV以研究NDV的基礎(chǔ)病毒學或開發(fā)家禽用疫苗株。NDV的輕型毒株 充當親代病毒毒株。這些毒株不具有明顯的溶瘤屬性。病毒的遺傳學操作如上所述，用于遺傳學操作RNA病毒的方法是熟知的。另外，溶瘤性病毒的遺傳學 操作例如在Bell等人Q002)中綜述。在Russell (2002)中綜述了作為病毒治療劑的RNA 病毒。這些文件中任意文件的內(nèi)容通過引用的方式并入本文。禽類細胞因子禽類細胞因子在Maeheli等人Q001)中綜述。在Kaiser等人Q005)中描述雞 細胞因子和趨化因子的基因組分析。發(fā)明簡述自六十年代早期以來，已經(jīng)將溶瘤性NDV毒株作為腫瘤治療劑研究。用于溶瘤療 法的大部分病毒毒株屬于被描述為家禽病原體的中等毒力病毒類型。為開發(fā)溶瘤性NDV作 為抗腫瘤生物藥物，應(yīng)當降低存在的潛在環(huán)境毒性，對家禽的致病性。然而，對家禽減毒的 NDV必須具有持續(xù)的裂解腫瘤細胞的能力并維持其溶瘤潛力。不能應(yīng)用現(xiàn)有的疫苗開發(fā)策 略，因為它們注重于通過采用完全滅活的病毒顆?；蚍侵虏⌒缘投玖Σ《径局甏碳B免疫 系統(tǒng)。兩種疫苗類型均不再能夠于癌細胞中復(fù)制并且因而已經(jīng)喪失裂解腫瘤細胞的潛力。在本發(fā)明中，可以借助反向遺傳學技術(shù)實現(xiàn)NDV對家禽減毒，同時不削弱該病毒 的溶瘤活性。通過插入編碼細胞因子、尤其抗病毒或免疫刺激性細胞因子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生重 組減毒NDV。此外，NDV疫苗不適合這種方法，因為疫苗的目的是誘導伴有長期持續(xù)免疫力的強 烈免疫應(yīng)答以保護動物免遭繼發(fā)感染。在本發(fā)明中，所描述的NDV減毒具有以下主要目標 使得動物控制(不希望的)原發(fā)感染并因而在治療增生性疾病中應(yīng)用時減少病毒的環(huán)境毒 性和提高其安全性。
本發(fā)明的主題是通過溶瘤性病毒裂解腫瘤細胞。這種溶瘤性病毒方法的適應(yīng)證是 人類中的癌癥治療。相反，如US 2003/0224017中公開的家禽用NDV疫苗應(yīng)用于動物并且 因而屬于動物健康護理領(lǐng)域。因而，本發(fā)明的目的是包含至少一種編碼禽類細胞因子的轉(zhuǎn)基因的重組溶瘤性 RNA新城疫病毒，其中該重組溶瘤性RNA新城疫病毒可從強毒力或中等毒力的溶瘤性RNA新 城疫病毒獲得。本發(fā)明的病毒可以包含當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性的至少 一種其它轉(zhuǎn)基因。所述至少一種其它轉(zhuǎn)基因?qū)τ谒拗鞫允遣糠滞N異基因的或部分同基因的。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的病毒可以是減毒病毒。“減毒”或“減毒的”包括病毒對禽類物種的致病性降低和在對于禽類物種有預(yù)測 性的生物測定系統(tǒng)中的致病性降低(見實施例5)。本發(fā)明的又一方面是對家禽減毒的重組溶瘤性RNA病毒，其包含含有至少一種編 碼細胞因子的轉(zhuǎn)基因的核酸。具體地，該病毒對雞是減毒的。“編碼細胞因子的轉(zhuǎn)基因”尤 其是如本文中所述的“編碼禽類細胞因子的轉(zhuǎn)基因”。另外，本發(fā)明涉及包含與衣殼蛋白復(fù)合的病毒RNA的本發(fā)明重組病毒的核衣殼。 另外，本發(fā)明涉及RNA，其為本發(fā)明病毒的RNA。本發(fā)明涉及與本發(fā)明病毒的RNA互補的RNA。另外，本發(fā)明涉及DNA，例如編碼本發(fā)明RNA的cDNA和/或與本發(fā)明RNA互補的 DNA。另外，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療腫瘤病、癌癥或/和增生性疾病。本發(fā)明的RNA或/和DNA可以以分離的形式提供。在本發(fā)明中，如本文中描述的轉(zhuǎn)基因所編碼的細胞因子可以從本發(fā)明病毒感染的 鳥細胞分泌，并且在結(jié)合至相鄰細胞上的適宜干擾素受體后，可以在攜帶受體的細胞中誘 導抗病毒狀態(tài)。因此，可以至少部分地抑制本發(fā)明病毒在干擾素刺激的鳥細胞中復(fù)制。雞 I型干擾素與哺乳動物I型干擾素之間的相似性極低(在氨基酸水平的相同性< 25% ) (Maeheli等人2001)。出于這個原因，在中顯示這種抗病毒作用的細胞因子在人細胞中基 本上不顯示生物學活性并且可以基本上不影響人腫瘤細胞中的病毒復(fù)制。另外，預(yù)料這些 細胞因子在人類生物中無不利作用。如本文中所述的編碼細胞因子的轉(zhuǎn)基因的表達導致該病毒對物種、尤其對家禽、 尤其對雞的致病性降低并且因而導致削弱的環(huán)境毒性。如本文中所述的編碼細胞因子的轉(zhuǎn) 基因的活性對該病毒的治療作用基本上無有害影響。優(yōu)選實施方式詳述病毒本發(fā)明總體上涉及RNA病毒，優(yōu)選地涉及負鏈RNA病毒，更優(yōu)選地涉及具有溶瘤屬 性和可以遺傳工程化的此類病毒。此類病毒是-副粘病毒，優(yōu)選地是新城疫病毒(NDV)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、仙臺病毒；-正粘病毒，優(yōu)選地是流感病毒；-彈狀病毒，優(yōu)選地是水泡性口炎病毒。 優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒是禽類病原體，尤其是家禽的病原體，更具體是雞的病原 體。
還優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒是負鏈RNA病毒。本發(fā)明的重組RNA病毒可以是副粘病 毒，優(yōu)選地是新城疫病毒(NDV)。NDV可以是中等毒力毒株或強毒株。優(yōu)選地，該NDV是中 等毒力的NDV。本發(fā)明的病毒可從強毒力或中等毒力的溶瘤性RNA新城疫病毒獲得、尤其從毒株 MTH68獲得。本發(fā)明的病毒優(yōu)選地有復(fù)制能力。本發(fā)明的病毒可以對禽類物種，尤其相對于自其可獲得重組病毒的病毒而言，具 有降低的致病性。優(yōu)選地，在本發(fā)明的病毒中，致病性降低是指病毒導致鳥細胞裂解的能力降低，這 是在以Μ0Ι0. 01的病毒感染細胞后約48小時通過細胞活力的增加而測量到的，其中相對于 自其可獲得所述重組病毒的病毒而言，細胞活力增加到至少約25% (如至少約25%直至約 50% )的存活細胞，更優(yōu)選地到至少約50% (如至少約50%直至約75% )的存活細胞，和 最優(yōu)選地到至少約75% (如至少約75%直至100% )的存活細胞。還優(yōu)選地，在本發(fā)明的病毒中，致病性降低是指通過測定平均死亡時間(MDT)而 測量到的11日齡含胚卵中的被病毒感染的雞胚的存活時間延長，其中與自其可獲得所述 重組病毒的病毒相比，MDT延長達至少約15小時(如至少15小時直至約20小時)、更優(yōu)選 地達至少約20小時(如至少20小時直至約30小時并且最優(yōu)選地達多于30小時。在又一個實施方式中，本發(fā)明病毒對人腫瘤細胞的溶瘤活性基本上不降低。優(yōu)選地，在本發(fā)明的病毒中，與自其可獲得重組病毒的病毒相比，通過感染48小 時后細胞活力測量到，所述病毒對人腫瘤細胞的溶瘤活性降低不超過50%，并且更優(yōu)選地 基本上不降低。細胞因子如本文中描述的至少一種轉(zhuǎn)基因所編碼的細胞因子可以是任何細胞因子。具體 地，該細胞因子可以是能夠至少部分地抑制鳥細胞中、尤其家禽類細胞中、更具體地在雞細 胞中的病毒復(fù)制的細胞因子。優(yōu)選地，病毒復(fù)制基本上被完全抑制。細胞因子可以是在哺乳動物中、尤其在人類中基本上沒有生物學活性的細胞因 子。在本上下文中，“生物學活性”尤其指細胞因子至少部分地抑制病毒復(fù)制、尤其抑制本發(fā) 明病毒復(fù)制的能力。“生物學活性”也指細胞因子的任何其他活性可以展現(xiàn)于非哺乳動物細 胞中或/和非哺乳動物中。該細胞因子可以是能夠至少部分地抑制鳥中、尤其家禽中、更具體地在雞中病毒 復(fù)制的細胞因子，并且可以在哺乳動物中、尤其在人類中基本上沒有生物學活性。細胞因子可以選自禽類細胞因子，尤其選自家禽類細胞因子，更具體地選自雞細 胞因子。細胞因子可以選自禽干擾素，尤其選自禽干擾素，更具體地選自雞干擾素，更具體 地選自雞I型干擾素。干擾素可以是干擾素-β或干擾素-α家族的成員。在優(yōu)選的實施方式中，重組溶瘤性RNA病毒是包含核酸的NDV，其中所述核酸包括 編碼雞干擾素-α或/和雞干擾素的轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因
轉(zhuǎn)基因在NDV基因組的環(huán)境中定義為病毒基因組中導入的額外核酸。所述核酸可 以選自不同的基因組來源(例如NDV基因組、不同的病毒類別、原核生物或真核生物來源、 哺乳動物或非哺乳動物物種)。來自兩個或多個不同基因組來源的融合轉(zhuǎn)基因也是可能的。 也可以構(gòu)建基于核酸序列從頭合成的轉(zhuǎn)基因。所述核酸必須位于至少一個轉(zhuǎn)錄盒內(nèi)。優(yōu)選 地，轉(zhuǎn)基因在感染的細胞中翻譯成蛋白質(zhì)。出于此原因，該轉(zhuǎn)基因序列應(yīng)當包括翻譯起始和 終止密碼子。本發(fā)明的重組溶瘤性病毒可以包含編碼至少一種其它轉(zhuǎn)基因的核酸，所述的至少 一種其它轉(zhuǎn)基因獨立地選自編碼結(jié)合蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶和蛋白酶的轉(zhuǎn)基因。所述至少一種其它轉(zhuǎn)基因優(yōu)選地編碼當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治 療活性的結(jié)合蛋白。在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述至少一種其它轉(zhuǎn)基因編碼當由病毒所感染的腫 瘤細胞表達時具有治療活性的前體藥物轉(zhuǎn)化酶。在又一個優(yōu)選的實施方式中，所述至少一種其它轉(zhuǎn)基因編碼當由病毒所感染的腫 瘤細胞表達時具有治療活性的蛋白酶。如果不另外說明，如本文中所用的“轉(zhuǎn)基因”或“至少一種轉(zhuǎn)基因”指編碼禽類細 胞因子的轉(zhuǎn)基因，或所述至少一種其它轉(zhuǎn)基因當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療 活性，或其組合。如果不另外說明，如本文中所述，“轉(zhuǎn)基因”的這個定義尤其適用于病毒基 因組內(nèi)部轉(zhuǎn)基因的位置和數(shù)目。本發(fā)明的RNA病毒、基因組、反基因組、核衣殼和/或DNA分子可以包含如本文中 所述的轉(zhuǎn)基因，其中所述轉(zhuǎn)基因可以位于如本文中所述的轉(zhuǎn)錄盒內(nèi)部。本發(fā)明的重組溶瘤性病毒可以包含至少2種、至少3種、至少4種或至少5種核酸， 每種核酸包含如本文中所述的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的重組溶瘤性病毒可以包含最多5種核酸， 每種核酸包含如本文中所述的轉(zhuǎn)基因。具體地，本發(fā)明的重組溶瘤性病毒可以包含2、3、4 種或至少5種核酸，每種核酸包含如本文中所述的轉(zhuǎn)基因。如果本發(fā)明的重組病毒包含至 少2種轉(zhuǎn)基因，則它們可以是相同或不同的。包含至少一種轉(zhuǎn)基因的核酸可以位于病毒基因的可讀框之間的任何位置。具體 地，包含至少一種轉(zhuǎn)基因的核酸可以位于N基因的5'、N與P基因之間、P與M基因之間、 M與F基因之間、F與HN基因、HN與L基因之間或/和L基因的3'。優(yōu)選地，該核酸位于 更為5'的位置，如N基因的5'力與？基因之間或/和P與M基因之間，因為這種位置與 更為3'的位置相比導致改善的表達。優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒展現(xiàn)出引起如本文中所述轉(zhuǎn)基因的腫瘤選擇性表達的腫瘤 選擇性感染。本發(fā)明的重組RNA病毒可以包含總計直到5種轉(zhuǎn)基因，直到4種轉(zhuǎn)基因或直到3 種轉(zhuǎn)基因。在本發(fā)明中，編碼禽類細胞因子的轉(zhuǎn)基因或當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具 有治療活性的至少一種其它轉(zhuǎn)基因或其組合優(yōu)選地對于作為本發(fā)明重組RNA病毒之基礎(chǔ) 的溶瘤性RNA病毒是異源的。如本文中所用的術(shù)語“異源的”指的是完整基因或其部分，所 述部分可以是基因的編碼區(qū)或其部分。異源核酸可以是人工核酸或可以從天然來源或通過重組至少兩種核酸而獲得，其中所述的至少兩種核酸選自從天然來源和/或人工核酸獲得的核酸?！疤烊粊碓础卑▌游?如哺乳動物、植物、真菌和微生物如細菌、原蟲和病毒，所述病毒可以不同于本發(fā)明的溶瘤 性RNA病毒。該轉(zhuǎn)基因也可以編碼融合蛋白。在本發(fā)明的另一個實施方式中，編碼禽類細胞因子的轉(zhuǎn)基因或當由病毒所感染的 腫瘤細胞表達時具有治療活性的至少一種其它轉(zhuǎn)基因可以位于至少兩個分立的轉(zhuǎn)錄單位 上。包含核酸的至少一個轉(zhuǎn)錄單位也可以在如本文中所述的腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄，其中所 述核酸包含編碼禽類細胞因子的至少一個轉(zhuǎn)基因。包含核酸的至少一個轉(zhuǎn)錄單位也可以在如本文中所述的鳥細胞中轉(zhuǎn)錄，其中所述 核酸包含當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性的至少一個第二轉(zhuǎn)基因。至少兩個分立的轉(zhuǎn)錄單位各自可以在如本文中所述的腫瘤細胞中和在如本文中 所述的鳥細胞中轉(zhuǎn)錄。在備選的優(yōu)選實施方式中，編碼禽類細胞因子的至少一個轉(zhuǎn)基因或當由病毒所感 染的腫瘤細胞表達時具有治療活性的至少一個其它轉(zhuǎn)基因在如本文中所述的腫瘤細胞中 和在如本文中所述的鳥細胞中翻譯。結(jié)合蛋白在本發(fā)明的溶瘤重組RNA病毒，當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性 的至少一種其它轉(zhuǎn)基因可以編碼結(jié)合蛋白。因此，本發(fā)明的主題是藥物組合物，其包含本發(fā)明的重組溶瘤性病毒、本發(fā)明的病 毒基因組、本發(fā)明的病毒反基因組和/或本發(fā)明的DNA分子作為有效成分，任選地與可藥用 載體、稀釋劑和/或輔藥在一起，所述的病毒、病毒基因組、反基因組和/或DNA分子包含當 由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性的編碼結(jié)合蛋白的至少一個其他轉(zhuǎn)基因。結(jié)合蛋白是在靶細胞中表達時能夠與所述細胞和/或相鄰細胞的組分結(jié)合的蛋 白質(zhì)。優(yōu)選地，結(jié)合蛋白是與胞內(nèi)組分結(jié)合的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實施方式中，結(jié)合蛋白選自以下由天然配體、遺傳學修飾的配體、天然受 體的重組可溶性結(jié)構(gòu)域及其修飾形式、肽配體、多肽配體、抗體分子及其片段和衍生物和抗 體樣分子如錨蛋白重復(fù)區(qū)蛋白及其片段和衍生物組成的組。高親和結(jié)合性框架的不完整綜述由Ladner和LeyQOOl)給出。如本文中所述的結(jié)合蛋白可能是人的、鼠的或密切相關(guān)源頭的或嵌合形式，即一 種蛋白質(zhì)，其可以是包含來自不同物種(例如人和小鼠)的序列的融合蛋白?；谏衔拿枋龅闹亟M結(jié)合分子可以是單體、二聚體、三聚體、四聚體或多聚體?；?于上文描述的重組結(jié)合分子可以是單特異性、雙特異性或多特異性的。優(yōu)選的結(jié)合蛋白選自具有治療活性的結(jié)合蛋白。如本文中所述的天然配體可以是生長因子或肽。遺傳學修飾的配體可以是天然存 在的生長因子或肽的類似物。天然受體或其修飾形式如本文中所述的重組可溶性結(jié)構(gòu)域是細胞表面受體和/ 或其片段的重組表達的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域、細胞黏著分子和/或其片段的重組表達的可溶 性胞外結(jié)構(gòu)域。
如上文提到的抗體分子可以是具有任何已知特異性和同種型的單克隆免疫球蛋 白抗體、其片段和/或其與效應(yīng)蛋白融合的片段?？贵w分子可以是嵌合抗體、人源化抗體或 人抗體?？贵w片段含有抗體的至少一個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)在文獻中廣泛描述抗體片段 (在例如通過引用方式并入本文的Allen Q002)中綜述)。優(yōu)選例子是單鏈Fv片段、Fab片 段、F(ab2 ‘)、稱作微型抗體的刪除結(jié)構(gòu)域的形式和其他免疫活性部分、片段、區(qū)段和其他更 小或更大的部分抗體結(jié)構(gòu)物，其中更大的部分抗體結(jié)構(gòu)物擁有充足的靶向?qū)傩曰蛎庖邔W刺 激或抑制活性，從而治療性地用于本發(fā)明方法中。此類抗體可以從使用轉(zhuǎn)基因小鼠的雜交瘤克隆實驗獲得或從含有人抗體序列的 抗體文庫的噬菌體展示選擇法、核糖體展示選擇法或菌落濾器篩選法或相關(guān)方法學獲得。具有如本文中所述抗體樣屬性的結(jié)合蛋白可以是遺傳修飾的蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域， 其中在氨基酸水平上使一個或多個肽環(huán)以如此方式隨機化從而具有高度特異性的高親和 力結(jié)合分子可以通過噬菌體展示選擇法、核糖體展示選擇法或菌落濾器篩選法對來自此 類分子的文庫中的任何反基因組富集。所選蛋白質(zhì)通常具有高的熱穩(wěn)定性和熱動力穩(wěn)定 性并且在重組表達系統(tǒng)如大腸桿菌(E. coli)、酵母、昆蟲和哺乳動物表達系統(tǒng)中良好表 達。此類具有抗體樣屬性的結(jié)合蛋白的例子是如Binz等人Q004)中所述的錨蛋白重復(fù) 序列蛋白、如Skerr乂2000)所述中的脂籠蛋白、如DE 199 32 688. 6中所述的γ -晶體 蛋白、如Hogbom等人Q003)或Nord等人Q000)中所述的修飾的蛋白A支架(親和體 (affibodies))或纖連蛋白框架和其他蛋白質(zhì)?？贵w樣分子可以是構(gòu)建為單鏈分子或多鏈 分子的單體分子或重復(fù)分子其中抗體樣分子擁有充足的靶向?qū)傩曰蛎庖邔W刺激或抑制活 性，從而治療性地用于本發(fā)明方法中。本發(fā)明的另一個主題是用于治療增生性疾病、尤其過度增生性疾病如腫瘤或癌癥 的方法，包括給有需要的對象施用藥物有效量的包含至少一種其它轉(zhuǎn)基因的本發(fā)明重組溶 瘤性病毒、本發(fā)明病毒基因組、本發(fā)明病毒反基因組和/或本發(fā)明DNA分子，其中所述至少 一種其它轉(zhuǎn)基因當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性并編碼如本文中所述的
結(jié)合蛋白ο具有額外功能的結(jié)合分子結(jié)合蛋白可以是包含(例如來自抗體的)至少一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域和至少一個異源結(jié) 構(gòu)域的融合蛋白。“異源的”具有如上文在異源基因的上下文中所討論的意思。上文所述的結(jié)合蛋白能夠作為所謂內(nèi)部體或作為胞外可用結(jié)合蛋白遞送有效負 載至疾病特異性部分(例如腫瘤)。遞送的有效負載可以是異源結(jié)構(gòu)域，例如毒素如人 RNA 酶(De Lorenzo, 2004) (Zewe, 1997)、假單胞菌外毒素(Chaudhary，1989) (Kreitman 和 Pastan, 1995) (Batra, 1992)、白喉毒素(Kreitman, 1993) (Chaudhary, 1990) (Batra, 1991)， 或具有治療效力的酶如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(Roffler，1991) (Wang， 1992) (Bosslet，1992)、β-葡糖苷酶(Rowlinson-Busza，1992)、羧肽酶(Antoniw, 1990) (Bagshawe,1988), β -內(nèi)酰胺酶，或具有細胞因子活性的免疫刺激蛋白如IL-2、IL-12、 TNF- α、IFN- β 或 GM-CSF (見例如 Alien (2002)的綜述)。在另一個例子中，上文所述的結(jié)合蛋白本身具有治療上有用的拮抗或激動效力。 拮抗/阻斷性結(jié)合分子的例子是VEGF抑制抗體Avastin (Ferrara等人，2004)、HER2/neu受 體阻斷性抗體Here印tin (Noonberg和Benz，2000)或EGF受體阻斷性抗體Erbitux (Herbst和Langer，2002)。激動性結(jié)合蛋白可以是誘導例如凋亡(Georgakis等人，2005)或?qū)NA、 RNA或蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)活性(例如誘導轉(zhuǎn)錄、使蛋白質(zhì)穩(wěn)定)的結(jié)合蛋白。Adams和Weiner， 2005的綜述描述了也可以并入溶瘤性病毒的多種治療性抗體。前體藥物轉(zhuǎn)化酶在本發(fā)明的溶瘤重組RNA病毒，當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性 的至少一種其它轉(zhuǎn)基因可以編碼前體藥物轉(zhuǎn)化酶。前體藥物是治療活性化合物的衍生物或前體，其可以酶促地轉(zhuǎn)化成該活性化合 物。前體藥物轉(zhuǎn)化酶是能夠?qū)⑶绑w藥物轉(zhuǎn)化成治療活性藥物的酶。因此，本發(fā)明的主題是藥物組合物，其包含本發(fā)明的重組溶瘤性病毒、本發(fā)明的病 毒基因組、本發(fā)明的病毒反基因組和/或本發(fā)明的DNA分子作為有效成分，任選地與可藥用 載體、稀釋劑和/或輔藥在一起，所述的病毒、病毒基因組、反基因組和/或DNA分子包含當 由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性的編碼前體藥物轉(zhuǎn)化酶的至少一個其他轉(zhuǎn) 基因。藥物組合物可以還包含可被前體藥物轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化成治療活性化合物的前體藥物， 其中所述的前體藥物轉(zhuǎn)化酶由該病毒、病毒基因組、反基因組和/或DNA分子編碼。藥物組 合物可以適用于治療和/或減緩增生性疾病。前體藥物可以連同作為有效成分的本發(fā)明重組溶瘤性病毒、本發(fā)明病毒基因組、 本發(fā)明病毒反基因組和/或本發(fā)明DNA分子配制于單一組合物中，或可以配制在不同于溶 瘤性病毒制劑的組合物中。如果本發(fā)明的溶瘤重組RNA病毒編碼前體藥物轉(zhuǎn)化酶，則本發(fā)明的溶瘤性病毒引 起前體藥物轉(zhuǎn)化酶在病毒感染的通常不表達或不充分表達該前體藥物轉(zhuǎn)化的靶細胞(尤 其腫瘤細胞)中選擇性表達。因此，在治療有需要的對象期間，將前體藥物特異性地在細胞 中，尤其在腫瘤細胞中轉(zhuǎn)化成藥物活性化合物，不過可以在非靶細胞中、尤其在待治療對象 的健康細胞中基本上不轉(zhuǎn)化成治療活性化合物。因而，與單用治療活性化合物的療法相比， 該治療活性化合物的不受歡迎的副作用減少，在本發(fā)明的環(huán)境中，前體藥物可以是適合治療和/或減緩增生性疾病、腫瘤或/和 癌癥的治療活性化合物的衍生物或前體，所述前體藥物可以由前體藥物轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化。該前 體藥物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化合物。優(yōu)選地，該前體藥物是基本上無藥物活性和/或無毒的。本發(fā)明前體藥物轉(zhuǎn)化酶的例子是β -葡糖醛酸糖苷酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖 苷酶、羧肽酶、β-內(nèi)酰胺酶、D-氨基酸氧化酶。其他例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。優(yōu)選地，該前體藥物轉(zhuǎn)化酶在非腫瘤細胞中基本上不表達。該前體藥物轉(zhuǎn)化酶可以從選自哺乳動物、植物、真菌和微生物如細菌、原蟲和病毒 的生物獲得。前體藥物轉(zhuǎn)化酶與前體藥物的最優(yōu)選組合是大腸桿菌β -葡糖醛酸糖苷酶和可 以由葡糖醛酸糖苷酶轉(zhuǎn)化成活性細胞毒化合物的前體藥物。一個例子是可以轉(zhuǎn)化成多 柔比星的HMRl^e (多柔比星-葡糖苷酸)，其中所述多柔比星是用于治療癌癥的已知化合 物。 本發(fā)明的另一個主題是用于治療增生性疾病、尤其過度增生性疾病如腫瘤或癌癥的方法，包括給有需要的對象施用藥物有效量的包含至少一種其它轉(zhuǎn)基因的本發(fā)明重組溶 瘤性病毒、本發(fā)明病毒基因組、本發(fā)明病毒反基因組和/或本發(fā)明DNA分子，其中所述至少 一種其它轉(zhuǎn)基因編碼如本文中所述的前體藥物轉(zhuǎn)化酶。具體地，本發(fā)明的主題是用于治療增生性疾病、尤其過度增生性疾病如癌癥的方 法，包括給有需要的對象施用藥物有效量的(i)包含編碼前體藥物轉(zhuǎn)化酶的至少一種轉(zhuǎn)基因的本發(fā)明重組溶瘤性病毒、本發(fā) 明病毒基因組、本發(fā)明病毒反基因組和/或本發(fā)明DNA分子，和(ii)適合治療增生性疾病的前體藥物，其中所述前體藥物可以由(i)的前體藥物 轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化成藥物活性化合物。該方法可以包括使用包含兩種組分(i)和(ii)的單一藥物組合物或可以包括施 用兩種明顯不同的藥物組合物，所述藥物組合物之一包含組分(i)并且另一種組合物包含 (ii)。蛋白酶在本發(fā)明的溶瘤重組RNA病毒，當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性 的至少一種其它轉(zhuǎn)基因可以編碼蛋白酶。因此，本發(fā)明的主題是藥物組合物，其包含本發(fā)明的重組溶瘤性病毒、本發(fā)明的病 毒基因組、本發(fā)明的病毒反基因組和/或本發(fā)明的DNA分子作為有效成分，任選地與可藥用 載體、稀釋劑和/或輔藥在一起，所述的病毒、病毒基因組、反基因組和/或DNA分子包含當 由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性的編碼蛋白酶的至少一個其他轉(zhuǎn)基因。藥物 組合物可以適用于治療和/或減緩增生性疾病。如果本發(fā)明的溶瘤重組RNA病毒編碼蛋白酶，則本發(fā)明的溶瘤性病毒可以引起該 蛋白酶在病毒感染的通常不表達或不充分表達該蛋白酶的靶細胞(尤其腫瘤細胞)中選擇 性表達。因此，在治療有需要的對象期間，該蛋白酶可以不可逆地在靶細胞中切割靶多肽， 因而抑制靶細胞的增生和/或生長或殺死靶細胞，不過可以在非靶細胞中、尤其在待治療 對象的健康細胞中基本上不切割靶分子。通過這種策略，蛋白酶療法的不良副作用減少。優(yōu)選地，該蛋白酶是序列特異性蛋白酶。更優(yōu)選特異性切割靶多肽的蛋白酶。該蛋 白酶可以是天然來源的并且可以從任何物種衍生或它可以進行工程化。適合特異性切割預(yù) 定靶多肽的氨基酸序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員，例如基于公眾可用的序列數(shù)據(jù)庫確定。US 2005-0175581和US2004-0072276描述了具有預(yù)定底物專一性的蛋白質(zhì)工程化蛋白酶的產(chǎn) 生。這兩份文件通過引用的方式納入本文。該蛋白酶的靶分子可以如下文對結(jié)合蛋白的靶所描述的任意靶分子。本發(fā)明的另一個主題是用于治療增生性疾病、尤其過度增生性疾病如腫瘤或癌癥 的方法，包括給有需要的對象施用藥物有效量的包含至少一種其它轉(zhuǎn)基因的本發(fā)明重組溶 瘤性病毒、本發(fā)明病毒基因組、本發(fā)明病毒反基因組和/或本發(fā)明DNA分子，其中所述至少 一種其它轉(zhuǎn)基因當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性并編碼如本文中所述的 蛋白酶。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因可以編碼如上文所定義前體藥物轉(zhuǎn)化酶、如上文所定義結(jié)合分子 和/或如上文所定義蛋白酶的融合蛋白。特別優(yōu)選前體藥物轉(zhuǎn)化酶與結(jié)合分子的融合蛋白 或蛋白酶與結(jié)合分子的融合蛋白。
治療性應(yīng)用本發(fā)明涉及藥物組合物，該藥物組合物包含如本文中所述的病毒、該病毒的核衣 殼、該病毒的基因組或編碼該病毒的基因組或/和反基因組的DNA分子作為有效成分，它們 任選地與可藥用載體、稀釋劑和/或輔藥在一起。該藥物組合物可以作為溶液劑、混懸劑、凍干劑或以任何其他適合形式提供。除有 效成分外，該組合物還可以包含如本領(lǐng)域已知的載體、緩沖劑、表面活性劑和/或輔藥?？?以例如經(jīng)口、局部、經(jīng)鼻、經(jīng)肺或通過局部或靜脈內(nèi)注射而施用該組合物。藥物組合物以根 據(jù)疾病類型、患者狀況和體重、施用途徑等的藥物有效量施用。優(yōu)選地，每次應(yīng)用施用IO9至 IO12個病毒顆粒、IO8至IO11UO7至101°或IO6至IO9個病毒顆粒。溶瘤療法可以任選地與 其他腫瘤療法如手術(shù)、放射療法和/或化療法如環(huán)磷酰胺療法和/或高熱治療組合。又一個方面是用于治療增生性疾病或/和癌癥的方法，包括給有需要的對象施用 藥物有效量的任選地與可藥用載體、稀釋劑和/或輔藥在一起的如本文中所述的重組溶瘤 性病毒、該病毒的基因組或編碼該基因組或/和反基因組的DNA分子。根據(jù)本發(fā)明，重組溶瘤性副粘病毒可以表達可以留在感染的細胞中或可以被分泌 的可溶性結(jié)合蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶和/或蛋白酶，如抗體、抗體片段、錨蛋白重復(fù)序列蛋 白或如下文詳述的另一種結(jié)合分子。作為示例NDV，在本申請中選擇毒株MTH68，原因是它具有天生溶瘤屬性，同時具 有來自實驗性臨床治療患者的有前景的數(shù)據(jù)(Sinkovics和Horvath，2000)。然而，原則上， 可以使用具有多個基本融合蛋白切割位點的大部分NDV毒株作為治療腫瘤的溶瘤劑。反向 遺傳學技術(shù)可應(yīng)用于全部毒株。已經(jīng)展示如本文中所述的結(jié)合蛋白是有高治療潛力的。溶瘤性NDV與具有上述屬性的治療性結(jié)合蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶和/或蛋白酶的 組合將產(chǎn)生兩種治療性原則的額外或甚至協(xié)同效力。溶瘤性自我復(fù)制型病毒將結(jié)合蛋白藥 物、前體藥物轉(zhuǎn)化酶和/或蛋白酶靶向其中所述病毒以高局部濃度原位表達的優(yōu)選作用位 點。此類蛋白質(zhì)表達預(yù)期極具選擇性并且具有相應(yīng)作用模式的結(jié)合蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶 和/或蛋白酶將加入NDV的固有治療性溶瘤活性。基于所用病毒有復(fù)制能力的特征和在腫 瘤細胞中選擇性復(fù)制，所表達轉(zhuǎn)基因(結(jié)合蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶和/或蛋白酶)的量預(yù)期 大體上正比于腫瘤的量?？贵w分子或抗體樣分子或其衍生物是待與NDV系統(tǒng)使用的理想結(jié)合蛋白?？贵w分 子已經(jīng)成為密切研究的主題并且現(xiàn)在可獲得產(chǎn)生以下抗體分子的技術(shù)，所述抗體分子無免 疫原性、極有選擇性并具有高親和性。與標準療法相比，抗體分子以高濃度的局部表達產(chǎn)生 極明顯的激動或拮抗效力或效應(yīng)分子的高效靶向，伴以降低的毒性譜。預(yù)期在NDV系統(tǒng)中使用抗體樣分子甚至是優(yōu)越的。與正?？贵w相比，將這些分子 設(shè)計用于選擇性高親和力結(jié)合作用，伴以極高的熱穩(wěn)定性和產(chǎn)率。在基于錨蛋白的抗體樣 分子的情況下，可以根據(jù)相應(yīng)靶精細調(diào)節(jié)該分子的重復(fù)特質(zhì)以優(yōu)化靶向、結(jié)合、抑制或激活 作用。利用在一個錨蛋白重復(fù)序列分子中聯(lián)合具有不同結(jié)合專一性的幾個單元的可能性， 也可以在一個靶分子內(nèi)部組合不同的結(jié)合專一性。這種模塊式結(jié)構(gòu)與抗體相比允許與更大 的蛋白質(zhì)表面發(fā)生多價結(jié)合，所述多價結(jié)合可能在阻斷蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中極端重 要。也可以利用這種模塊式結(jié)構(gòu)來僅用一種單一阻斷性錨蛋白重復(fù)序列蛋白阻斷幾種效應(yīng)物。由于錨蛋白重復(fù)序列分子甚至在還原條件下極端穩(wěn)定，因而這些分子可以設(shè)計成 靶向細胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)(“內(nèi)部體”)。也可能使用結(jié)合蛋白編碼序列的文庫連同NDV用于體內(nèi)靶鑒定。結(jié)合分子或/和蛋白酶的可能靶可以是靶細胞或包圍靶細胞的胞外基質(zhì)的全部 結(jié)構(gòu)物，所述的結(jié)構(gòu)物可以由所述結(jié)合蛋白或/和蛋白酶識別并且與某個類型的病理學表 型相關(guān)。這些結(jié)構(gòu)物可以是結(jié)構(gòu)蛋白、酶、生長因子、生長因子受體、整聯(lián)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等。甚至可以通過本發(fā)明對付不可由小分子投藥的靶(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、DNA
纟口 口寸乂。設(shè)想溶瘤性NDV與如上所述的治療性結(jié)合蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶和/或蛋白酶的 組合用于治療炎性疾病例如類風濕性關(guān)節(jié)炎和治療癌癥。為治療癌癥，可以靶向有助于癌發(fā)展的全部途徑。這些途徑是自我滿足生長信 號、對生長抑制(抗生長)信號不敏感、逃避凋亡、無限制復(fù)制潛能、持續(xù)的血管生成和組 織入侵和轉(zhuǎn)移。這些途徑的總結(jié)在(Hanahan *Wfeinberg，2000)中給出。參與腫瘤發(fā)生 過程并且可以被所述方法靶向的信號傳導途徑是受體酪氨酸激酶途徑(RTK)、RB和p53途 徑、凋亡途徑、APC途徑、HIFl途徑、GLI途徑、PII途徑和SMAD途徑。在Vogelstein和 Kinzler(2004)中給出這些信號傳導途徑的詳細描述。所述結(jié)合蛋白可能對其干擾的其他信號傳導途徑是raS、Wnt和Hedgehog途徑，其 中可以例如阻斷蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。有益介入癌細胞中上述途徑的結(jié)合蛋白的例子是-自主活性生長因子受體(例如EGFR，Met)的阻斷蛋白-生長因子的競爭性結(jié)合蛋白(拮抗物)-Rb-磷酸化的阻斷蛋白-E2F依賴性轉(zhuǎn)錄的阻斷蛋白_p53的穩(wěn)定蛋白-抗凋亡蛋白(例如Bcl-2)的拮抗性結(jié)合蛋白-細胞周期蛋白的拮抗性結(jié)合蛋白-Ras效應(yīng)物(例如GEF)的拮抗性結(jié)合蛋白-低氧誘導蛋白(例如HIFlα)的拮抗性結(jié)合蛋白-干擾二聚化、DNA結(jié)合或/和輔因子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(例如Myc/Max)的抑制物-分化誘導蛋白-smad信號傳導/轉(zhuǎn)位的抑制物-細胞黏著相互作用(鈣黏著蛋白、整聯(lián)蛋白例如α5β1、αν β 3)的抑制物-降解胞外基質(zhì)的酶(例如MMP)的抑制物-促血管生成配體(例如可溶性VEGF-R)的拮抗性結(jié)合蛋白-有絲分裂激酶(例如Plk-I)的抑制物-促血管生成受體的拮抗性結(jié)合蛋白-支架復(fù)合體形成(例如KSR/Ras)的抑制物-翻譯起始(eIF4E，EIF2a)抑制因子
本發(fā)明的蛋白酶、前體藥物轉(zhuǎn)化酶和/或因前體藥物轉(zhuǎn)化酶從本發(fā)明的前體藥物 衍生的治療活性化合物也可以有益地介入癌細胞的上述途徑。重組病毒重組病毒意指在其基因組RNA序列中具有工程化所定義變更的病毒。這種變更可 以是一個或多個插入、缺失、點突變或其組合。本發(fā)明的重組RNA病毒可以包含天然(未修飾)RNA病毒的全長基因組序列或從 中衍生的序列并且可以額外地包含至少一個重組轉(zhuǎn)錄盒。所述至少一個轉(zhuǎn)錄盒可以位于病 毒基因組的兩個基因(轉(zhuǎn)錄單位)之間。在這種情況下，所述至少一個轉(zhuǎn)錄盒兩側(cè)分布有 轉(zhuǎn)錄起始序列和終止序列。所述至少一個轉(zhuǎn)錄盒也可以位于病毒基因組的轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)部。 在這種情況下，不需要額外的轉(zhuǎn)錄起始序列和終止序列。至少一個轉(zhuǎn)錄盒可以包含限制性位點，如I^cI或/和AscI，所述限制性位點可以 是單一的。如果兩個轉(zhuǎn)錄盒存在，它們可以包含不同的限制性位點。優(yōu)選地，本發(fā)明的RNA病毒包含一個或兩個重組轉(zhuǎn)錄盒。在本發(fā)明的的至少一個轉(zhuǎn)錄盒中，存在可以編碼如本文中所述的結(jié)合蛋白、前體 藥物轉(zhuǎn)化酶和/或蛋白酶的轉(zhuǎn)基因。病毒基因組的兩個基因(轉(zhuǎn)錄單位)彼此之間的任何基因間區(qū)適合導入至少一個 重組轉(zhuǎn)錄盒。如果存在多于一個重組轉(zhuǎn)錄盒，它們可以位于相同或不同的基因間區(qū)。優(yōu)選 地，至少一個重組轉(zhuǎn)錄盒位于病毒F基因和HN基因之間，尤其當本發(fā)明的RNA病毒是重組 新城疫病毒時。不存在副粘病毒科病毒基因組尺寸的已知上限。因此，對于導入本發(fā)明重組RNA 病毒的轉(zhuǎn)基因的數(shù)目和尺寸不存在上限。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因(如本文中所述，編碼禽類細胞因 子的轉(zhuǎn)基因或當由病毒所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性的至少一種其它轉(zhuǎn)基因或 其組合)獨立地具有直至約IOWk更優(yōu)選直至約51Λ、最優(yōu)選直至約21Λ的尺寸。在如本文中所述轉(zhuǎn)基因的表達(包括病毒RNA轉(zhuǎn)錄成mRNA和mRNA翻譯)中，使 用表達調(diào)控序列如轉(zhuǎn)錄起始序列與終止序列和控制翻譯的序列?？梢允褂肦NA病毒的表達 調(diào)控序列，其中所述的RNA病毒可以是作為本發(fā)明重組RNA病毒的基礎(chǔ)的RNA病毒。具體 地，可以從RNA病毒獲得轉(zhuǎn)錄起始序列和終止序列。也可以從靶細胞獲得表達調(diào)控序列，尤 其控制翻譯和/或蛋白質(zhì)運輸?shù)男蛄小ｈb于副粘病毒科病毒的復(fù)制機制，基因組或反基因組RNA通常不作為裸露RNA出 現(xiàn)?；蚪M或反基因組RNA與核蛋白裝配。因此，本發(fā)明的又一方面是本發(fā)明的重組溶瘤 性RNA病毒的核衣殼。核衣殼包含編碼該RNA病毒的基因組或/和反基因組和核衣殼蛋白 的RNA分子。核衣殼也可以包含聚合酶蛋白L或/和磷蛋白P。本發(fā)明的主題也是如本文中所述的本發(fā)明基因組的反基因組。本發(fā)明的又一個方面是編碼本發(fā)明重組溶瘤性RNA病毒的基因組或/和反基因組 的DNA分子。該DNA分子可以是質(zhì)粒。本發(fā)明的DNA分子可以用于遺傳地改造本發(fā)明的 RNA病毒。另外，該DNA分子可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的RNA病毒。因此，該DNA分子可以與轉(zhuǎn) 錄調(diào)控序列例如原核或真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操縱連接。本發(fā)明的另一個方面是用于產(chǎn)生從DNA分子表達的重組溶瘤性RNA病毒的方法， 其中所述的DNA分子編碼本發(fā)明重組溶瘤性病毒、尤其本發(fā)明重組溶瘤性NDV的基因組和/或反基因組。本發(fā)明的又一個方面是包含本發(fā)明重組溶瘤性病毒、本發(fā)明病毒基因組、本發(fā)明 病毒反基因組和/或本發(fā)明DNA分子的細胞。該細胞可以是原核細胞或真核細胞。該細胞 可以是細胞系、尤其哺乳動物細胞系，更具體是人或鼠細胞系。該細胞可以在本發(fā)明方法中 用于產(chǎn)生本發(fā)明的RNA病毒。用于轉(zhuǎn)錄DNA分子的合適系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例 如在原核系統(tǒng)如大腸桿菌或真核系統(tǒng)如HeLa或CHO中。又一個方面是溶瘤性RNA病毒、其基因組或反基因組或DNA分子，其包含其中至少 一個基因或基因間區(qū)經(jīng)過遺傳修飾的副粘病毒科全套基因或副粘病毒科一組基因并且還 包如本文中所述的含至少一個重組轉(zhuǎn)錄盒。這種病毒、基因組或反基因組或DNA分子可以 用于制備藥物和/或治療癌癥。這種RNA病毒、基因組或反基因組或DNA分子適合通過基因 工程技術(shù)構(gòu)建重組副粘病毒科病毒、尤其重組新城疫病毒，以便將重組序列導入轉(zhuǎn)錄盒。處 于此目的，所述至少一個轉(zhuǎn)錄盒可以包含限制性位點。如果存在多于一個轉(zhuǎn)錄盒，轉(zhuǎn)錄盒的 單一限制性位點可以是不同的。例子是W02006/050984的

圖1的質(zhì)粒pflMTH68_Asc_Pac， 所述專利的內(nèi)容通過引用的方式并入本文。另一個例子是如WO 2006/050984的圖2中公 開的pflMTH68小鼠IgG EDB，所述專利的內(nèi)容通過引用的方式并入本文。療效相關(guān)性癌癥或/和腫瘤的治療包括抑制腫瘤生長，優(yōu)選地包括以一個時間間隔通過感染 殺死腫瘤細胞或阻斷增生。NDV選擇性地在腫瘤細胞中復(fù)制。本發(fā)明的病毒可以用來治療增生性疾病、尤其過度增生性疾病。優(yōu)選地，可以用所 述病毒治療腫瘤，優(yōu)選地可以治療來自由肺癌、結(jié)腸癌、前列腺、乳腺癌和腦癌組成的組中
的癌癥。更優(yōu)選地，可以治療實體瘤。更優(yōu)選地，可以治療具有低增生速率的腫瘤。具有低增生速率的腫瘤的例子是前 列腺癌或乳腺癌。更優(yōu)選地，可以治療腦腫瘤。更優(yōu)選地，可以治療實成膠質(zhì)細胞瘤。哺乳動物包括人、小鼠和大鼠。重組RNA病毒的制備本發(fā)明的重組RNA病毒、尤其重組NDV可以如Romer-Oberdorfer等人(1999)中 所述構(gòu)建。(1999).新核酸序列的構(gòu)建是在cDNA的水平上進行的，其中所述cDNA隨后使用 以下初始質(zhì)粒pCITE P、pCITE N、pCITE L, ρΧ8 δ T f INDV在真核細胞內(nèi)部翻譯成RNA。NDV可以是任意新城疫病毒毒株、更優(yōu)選是以其野生型形式有溶瘤性的毒株。質(zhì)粒ρΧ8δΤ 在 EP 0 702 085 (Conzelmann KK)中描述。本發(fā)明的重組RNA病毒、尤其重組NDV可以最初從表達Τ7聚合酶的細胞例如BHK Τ7細胞回收或用Τ7聚合酶轉(zhuǎn)染的CHO細胞短暫地回收。該重組RNA病毒可以在細胞如 3、CEC32、HT 或A431中擴增。它也可以在含胚雞卵的尿囊液中擴增。在以下條件貯藏重組RNA病毒、尤其重組NDV。重組RNA病毒、尤其NDV在5 % D-甘 露醇/1% (w/v)L-賴氨酸/pH 8.0或標準細胞培養(yǎng)基中穩(wěn)定。在_20°C持續(xù)直到1個月。
在_80°C持續(xù)直到10年?？梢允褂靡吧筒《净蛑亟M病毒作為原材料制備本發(fā)明的重組RNA病毒。也可以 使用包含這種野生型或重組序列的核酸，如DNA。例如，可以使用如WO 2006/050984中所述 的重組RNA病毒或/和DNA分子作為原材料。一個例子是WO 2006/050984的圖1的質(zhì)粒 pflMTH68_Asc_Pac。另一個例子是如 WO 2006/050984 的圖 2 的 pflMTH68 小鼠 IgG EDB。 W02006/050984的內(nèi)容通過引用的方式并入本文。具體地，本文中通過引用的方式包含涉及 重組溶瘤性RNA病毒及其構(gòu)建的WO 2006/050984的內(nèi)容。重組NDV作為藥物的用途本發(fā)明的重組RNA病毒、尤其純化的本發(fā)明重組NDV可以作為藥物使用，因為它顯 示藥理學作用。本發(fā)明的重組RNA病毒、尤其重組NDV、本發(fā)明的病毒基因組、反基因組、核衣殼和 /或DNA分子可以用于制備特別用于預(yù)防、減緩或/和治療癌癥(如肺癌、前列腺癌、腦癌、 結(jié)腸癌、乳腺癌)的藥物。本發(fā)明的藥物組合物任選地包含可藥用的載體和稀釋劑。此類載體和稀釋劑在第 15版Remington' s Pharmaceutical Science中描述。藥物組合物中所用或/和在本發(fā)明 治療方法中應(yīng)用的病毒滴度可以根據(jù)治療的適應(yīng)證在每劑量IO9至IO12Pfu范圍內(nèi)、在IO8 至IO11Pfu范圍內(nèi)、在IO7至101Qpfu范圍內(nèi)或在IO6至IOi3Pfu范圍內(nèi)。本發(fā)明的藥物組合物可以用于預(yù)防或/和治療增生性疾病如癌癥。本發(fā)明的藥物組合物可以包含本發(fā)明重組溶瘤性RNA病毒、尤其本發(fā)明NDV的乳 劑并且可以通過吸入、靜脈內(nèi)輸注、皮下注射、腹膜內(nèi)注射或腫瘤內(nèi)注射施用。在用于預(yù)防或/和治療增生性疾病、尤其癌癥的本發(fā)明方法中，藥物有效量是本 發(fā)明溶瘤性RNA病毒、尤其本發(fā)明NDV、本發(fā)明病毒基因組或本發(fā)明DNA分子的的滴度，其預(yù) 防、減緩或/和抑制該疾病。對治療作用而言，可接受的劑量可以取決于例如構(gòu)建體、患者、施用途徑和癌癥類 型。優(yōu)選地，對象(患者)是哺乳動物，更優(yōu)選地，是人患者。本發(fā)明通過以下圖和實施例進一步說明。附圖簡述圖1描述包含NDV全長基因組和一個包含雞干擾素-α (ChIFN- α )轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄 盒的質(zhì)粒 pf lMTH68ChIFN- α。圖2描述包含NDV全長基因組和一個包含雞干擾素-β (ChIFN- β )轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄 盒的質(zhì)粒 pflMTH68ChIFN-3。圖3a表明禽CEC-32細胞系在感染NDV-ChIFN- α后48小時部分地免于裂解并且 在感染NDV-ChIFN- β后受到強烈保護。用表達GFP的NDV感染完全摧毀CEC-32單層。相 反，在感染致瘤性Hela細胞系后，未見三種病毒NDV-GFP、NDV-ChIFN- α和NDV-ChIFN-β 之間裂解的差異。與所用病毒無關(guān)，Hela細胞單層在感染后48小時被完全摧毀。圖 3b 顯示以病毒 NDV-GFP、NDV-ChIFN- α 和 NDV-ChIFN- β 感染后 48 小時的 CEC-32和Hela細胞的細胞存活量化。在用NDV-GFP感染后，觀察到幾乎完全殺死CEC-32 細胞，僅3 %的細胞是活的。鵪鶉細胞用NDV-ChIFN- α的感染使得沈%的感染細胞活下來。在NDV-ChIFN-β病毒感染后觀察到用最好的保護，96%的CEC-32細胞是活的。相反，在感 染后48小時，致瘤性Hela細胞的活力降低到10%以下，與所用重組NDV無關(guān)。圖4表明在用NDV-ChIFN- α和NDV-ChIFN- β感染腫瘤細胞和成纖維細胞后存在 巨大的治療窗。溶瘤性病毒NDV-ChIFN-α和NDV-ChIFN-β的增殖抑制作用在腫瘤細胞上 很強烈，并且相反在感染原代成纖維細胞后，幾乎觀察不到生長抑制，尤其在低MOI如0. 1 和 MOI 0. 01 時。圖 5a 描述了 以 4 種 NDV 病毒 NDV-GFP、NDV-ChIFN- α、NDV-ChIFN- β 和非致病性 毒株LaSota進行NDV感染的含胚雞卵的存活曲線。用NDV_ChIFN_a或NDV-ChIFN-β感 染的雞胚比NDV-GFP感染的胚存活得更長。這些曲線清晰地朝低毒力NDV LaSota毒株的 存活曲線方向移動。圖恥從存活曲線的結(jié)果對每個感染組計算MDT (平均死亡時間)。與NDV-GFP相 比，病毒NDV-ChIFN-α和ChIFN-β的MDT增加。在非致病性毒株LaSota觀察到最高MDT。實施例1產(chǎn)生具有引起雞細胞因子表達的禽衍生性轉(zhuǎn)基因的重組NDV使用NDV的溶瘤毒株MTH68來獲得病毒RNA。使用RT-PCR，獲得幾個cDNA片段并且 在多步驟克隆方法中，將它們裝配成全長基因組cDNA，將后者克隆入載體ρΧ8 δ T (Schnell 等人，1994)，產(chǎn)生質(zhì)粒pflMTH68。該載體可以用于轉(zhuǎn)染以便從表達T7-聚合酶的細胞系拯
救重組病毒。將一個額外轉(zhuǎn)錄盒克隆到NDV MTH68全長基因組質(zhì)粒(pflMTH68)中編碼F蛋白 和HN蛋白的基因之間的單一 SfiI限制性位點內(nèi)。兩種DNA寡核苷酸Sfi正向(5' -agg ccttaattaaccgacaacttaagaaaaaatacgggtagaacggcctgag-3‘ ，SEQ ID NO 1)禾口 Sfi J^ ( (5 ‘ -aggccgttctacccgtattttttcttaagttgtcggttaattaaggcctctc-3‘ , SEQ ID NO 2)復(fù) 性并隨后連接到入pflMTH68的SfiI位點。通過PCR 擴增編碼 ChIFN-α (ΝΜ_205427)和 ChIFN-β (ΝΜ_001024836)的兩個 DNA 轉(zhuǎn)基因。作為聚合酶鏈反應(yīng)的模板，使用Schultz等人，1995和Sick等人，1996中所述的 ChIFN- α和ChIFN-β表達構(gòu)建體。為擴增ChIFN-α轉(zhuǎn)基因，使用以下引物對ChIFN-a f w(5' -ccttaattaagccaccatggctgtgcctgcaagccc-3‘ SEQ ID NO :3)和ChIFN-α-rev(5‘-ccttaattaactaagtgcgcgtgttgcctgtg-3' SEQ ID NO :4)，并且為擴增 ChIFN-β 編碼序列， 使用兩條弓 I物 PacI ChIFN- β fw (5 ‘ -ccttaattaacgcaccatgactgcaaaccatcagtctccagg-3 ‘SEQ ID NO :5)禾口 ChIFN-β-rev (5 ‘ -ccttaattaatcactgggtgttgagacgtttggatg-3 ‘ SEQ ID NO 6)。兩個chIFN-轉(zhuǎn)基因的每一個分別克隆到質(zhì)粒pflMTH68Pac的I3acI位點內(nèi)。調(diào)節(jié) 基因組的總長度至6的倍數(shù)以符合該病毒基因組長度的“6堿基規(guī)則”。ChIFN-β插入物 的序列相同性由核苷酸測序證實。在ChIFN-α插入物中，與序列NM_20M27相比，在第89 位置檢測到一個G至A核苷酸交換。從表達T7的細胞拯救重組病毒，其中所述細胞用含有 ChIFN-α (圖1)基因或ChIFN-β (圖2、基因的全長病毒基因組質(zhì)粒通過標準病毒拯救技 術(shù)轉(zhuǎn)染。所得表達ChIFN-α的病毒命名為NDV-ChIFN-α并且表達ChIFN-β的NDV命名 為NDV-ChIFN-β。在組織培養(yǎng)中或在雞卵的尿囊液中培養(yǎng)病毒以產(chǎn)生高滴度。實施例2
從重組NDV表達的ChIFN- α和ChIFN- β是有生物學活性的材料與方法將CEC-32細胞(禽鵪鶉細胞系)或Hela細胞(子宮頸癌細胞系)以IxlO5個細 胞/孔鋪種于6孔平板中。在細胞貼壁后，使用0. 01的Μ0Ι，細胞用表達GFP的對照病毒 NDV-GFP,NDV-ChIFN-α ,NDV-ChIFN-β或模擬病毒感染。在64小時后，收獲上清液并通過 UV照射失活感染性病毒顆粒。為顯示病毒感染的細胞的上清液中ChIFN-α或ChIFN-β的生物學活性，使用 雞干擾素特異性生物測定法(khwarz等人，JICR，2005)。該測定法基于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的鵪鶉 細胞系CEC-511，其中該細胞系攜帶受IFN應(yīng)答型雞Mx啟動子控制的螢光素酶基因。當 CEC-511指示細胞與ChIFN-α或ChIFN-β孵育時，誘導出螢光素酶活性。為開展該測定 法，將15. 000個CEC-511細胞鋪種于96-孔平板中。在鋪種M小時后，細胞用病毒感染的 Hela細胞或CEC-32細胞的UV處理的上清液處理。細胞與相應(yīng)上清液的1 100稀釋物 75 μ 1孵育。作為陽性對照，細胞與來自293Τ-細胞的上清液的1 1000稀釋物或僅與培 養(yǎng)基孵育，其中所述的四31~-細胞用ChIFN-α或ChIFN-β的表達質(zhì)粒(Sick等人，1996) 轉(zhuǎn)染。在6小時孵育時間后，按照制造商提供的方案開展Meady- Glo 螢光素酶測定法 (Promega)。為確定平均值，一式三份測量每個數(shù)據(jù)點。結(jié)果在感染后64小時，NDV-ChIFN- α和NDV-ChIFN- β感染的CEC-32細胞和Hela細 胞的上清液在CEC-511細胞上具有強烈的螢光素酶誘導活性，顯示感染細胞中病毒介導的 ChIFN- α和ChIFN-β表達。相反，模擬感染或用表達GFP的對照病毒感染的細胞的上清液 在CEC-511指示細胞系上不顯示螢光素酶誘導活性。上清液含有重組ChIFN- α或ChIFN- β 的1 1000稀釋物也顯示出ChIFN依賴性Mx啟動子誘導活性。表1 用表達ChIFN-α或ChIFN-β的重組NDV所感染CEC-32和Hela細胞的上 清液中的干擾素活性。在攜帶受Mx啟動子控制的螢光素酶報道基因的指示細胞中測量IFN 應(yīng)答。測量值以相對螢光素酶計數(shù)給出。
權(quán)利要求
1.重組溶瘤性RNA新城疫病毒，其包含至少一種編碼禽類細胞因子的轉(zhuǎn)基因，其中該 重組溶瘤性RNA新城疫病毒可從強毒力或中等毒力溶瘤性RNA新城疫病毒獲得。
2.權(quán)利要求1的病毒，包含至少一種其它轉(zhuǎn)基因，所述至少一種其它轉(zhuǎn)基因當由病毒 所感染的腫瘤細胞表達時具有治療活性。
3.權(quán)利要求2的病毒，其中所述至少一種其它轉(zhuǎn)基因?qū)λ拗鞫允遣糠滞N異基因的 或部分同基因的。
4.權(quán)利要求1至3任一項的病毒，其中該病毒對禽類物種的致病性是降低的。
5.權(quán)利要求4的病毒，其中該病毒對禽類物種的致病性相對于可自其獲得該重組病毒 的病毒而言是降低的。
6.權(quán)利要求4或5的病毒，其中禽類物種選自家禽。
7.權(quán)利要求4至6任一項的病毒，其中禽類物種是雞。
8.權(quán)利要求1至7任一項的病毒，其為禽類病原體，尤其是家禽病原體，更具體是雞病 原體。
9.權(quán)利要求1至8任一項的病毒，其可從中等毒力毒株MTH6獲得。
10.權(quán)利要求1至9任一項的病毒，其中所述至少一種其它轉(zhuǎn)基因編碼當由病毒所感染 的腫瘤細胞表達時具有治療活性的結(jié)合蛋白。
11.權(quán)利要求10的病毒，其中所述結(jié)合蛋白選自以下由天然配體、遺傳學修飾的配體、 天然受體的重組可溶性結(jié)構(gòu)域及其修飾形式、肽配體、多肽配體、抗體分子及其片段和衍生 物和抗體樣分子如錨蛋白重復(fù)區(qū)蛋白及其片段和衍生物組成的組。
12.權(quán)利要求10或11的病毒，其中結(jié)合蛋白來自哺乳動物例如人、鼠或密切相關(guān)來源 或是嵌合蛋白。
13.權(quán)利要求10至12任一項的病毒，其中結(jié)合蛋白是單體、二聚體、三聚體、四聚體或 多聚體蛋白。
14.權(quán)利要求10至13任一項的病毒，其中結(jié)合蛋白是單特異性、雙特異性或多特異性的。
15.權(quán)利要求10至14任一項的病毒，其中結(jié)合蛋白是包含至少一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域和至少 一個異源結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
16.權(quán)利要求15的病毒，其中結(jié)合蛋白是包含毒素如人RNA酶(假單胞菌外毒素、白 喉毒素)的融合蛋白或包含酶如β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、羧 肽酶、β -內(nèi)酰胺酶的融合蛋白或包含具有細胞因子活性的免疫刺激蛋白如IL-2、IL-12、 TNF- α、IFN- β或GM-CSF的融合蛋白。
17.權(quán)利要求10至16任一項的病毒，其中結(jié)合蛋白選自由以下蛋白組成的組自主 活性生長因子受體(例如EGFR、Met)的阻斷蛋白、生長因子的競爭性結(jié)合蛋白(拮抗物)、 Rb-磷酸化的阻斷蛋白、E2F依賴性轉(zhuǎn)錄的阻斷蛋白；p53的穩(wěn)定蛋白；抗凋亡蛋白(例如 Bcl-2)的拮抗性結(jié)合蛋白；細胞周期蛋白的拮抗性結(jié)合蛋白；Ras效應(yīng)物(例如GEF)的拮 抗性結(jié)合蛋白；低氧誘導蛋白(例如HIFl α)的拮抗性結(jié)合蛋白；干擾二聚化、DNA結(jié)合或 /和輔因子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(例如Myc/Max)抑制物；分化誘導蛋白；smad信號傳導/轉(zhuǎn)位 抑制物；細胞黏著相互作用(鈣黏著蛋白、整聯(lián)蛋白、例如α5β1、ανβ3)的抑制物；降解 胞外基質(zhì)的酶(例如MMP)的抑制物；促血管生成配體(例如可溶性VEGF-R)的拮抗性結(jié)合蛋白；針對促血管生成受體的拮抗性結(jié)合蛋白；支架復(fù)合體形成(例如KSR/Ras)的抑制 物；翻譯起始(例如eIF4E、EIF2a)的抑制物；和有絲分裂激酶(例如Plk-I)的抑制物。
18.權(quán)利要求1至9任一項的病毒，其中所述至少一種其它轉(zhuǎn)基因編碼當由病毒所感染 的腫瘤細胞表達時具有治療活性的前體藥物轉(zhuǎn)化酶。
19.權(quán)利要求1至9任一項的病毒，其中所述至少一種其它轉(zhuǎn)基因編碼當由病毒所感染 的腫瘤細胞表達時具有治療活性的蛋白酶。
20.前述權(quán)利要求任一項的病毒，其中所述編碼禽類細胞因子的至少一種轉(zhuǎn)基因選自 雞干擾素。
21.權(quán)利要求20的病毒，其中所述編碼禽類細胞因子的至少一種轉(zhuǎn)基因選自雞I型干擾素。
22.權(quán)利要求5至21任一項的病毒，其中致病性降低是指病毒導致鳥細胞裂解的能力 降低，這是在以MOI 0.01的病毒感染細胞后約48小時通過細胞活力的增加而測量到的，其 中相對于自其可獲得所述重組病毒的病毒而言，細胞活力增加到至少約25%直至約50% 的存活細胞，更優(yōu)選地到至少約50%直至約75%的存活細胞，和最優(yōu)選地到至少約75%直 至到100%的存活細胞。
23.權(quán)利要求5至21任一項的病毒，其中致病性降低是指通過測定平均死亡時間 (MDT)而測量到的11日齡含胚卵中的被病毒感染的雞胚的存活時間延長，其中與自其可獲 得所述重組病毒的病毒相比，MDT延長達至少約15小時直至約20小時，更優(yōu)選地至少約20 小時直至約30小時，和最優(yōu)選地多于30小時。
24.權(quán)利要求1至23任一項的病毒，其中所述病毒對人腫瘤細胞的溶瘤活性基本上不 降低。
25.權(quán)利要求1至23任一項的病毒，其中與自其可獲得所述重組病毒的病毒相比，通過 感染48小時后細胞活力而測量到的所述病毒對人腫瘤細胞的溶瘤活性降低不超過50%， 并且更優(yōu)選地，相對于自其可獲得所述重組病毒的病毒而言，基本上不降低。
26.權(quán)利要求1-25任一項的重組溶瘤性RNA病毒的核衣殼。
27.權(quán)利要求1-25任一項的重組溶瘤性RNA病毒的基因組。
28.編碼權(quán)利要求1-25任一項的重組溶瘤性RNA病毒的基因組和/或反基因組的DNA 分子。
29.權(quán)利要求27的DNA分子，其與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操縱連接。
30.細胞，其包含權(quán)利要求1-25任一項的重組溶瘤性病毒、權(quán)利要求27的病毒基因組 或/和權(quán)利要求28或四的DNA分子。
31.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-25任一項的重組溶瘤性病毒、權(quán)利要求27的病毒 基因組或/和權(quán)利要求觀或四的DNA分子作為有效成分，任選地與可藥用載體、稀釋劑和/或輔藥在一起。
32.權(quán)利要求31的藥物組合物，還包含可以由至少一種其它轉(zhuǎn)基因所編碼的前體藥物 轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化成治療活性化合物的前體藥物。
33.用于治療增生性疾病的方法，包含給有需要的對象施用藥物有效量的權(quán)利要求 1-25任一項的重組溶瘤性病毒、權(quán)利要求27的病毒基因組或/和權(quán)利要求28或四的DNA 分子。
34.權(quán)利要求33的方法，包含給有需要的對象施用藥物有效量的以下物質(zhì)(i)包含至少一種編碼前體藥物轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)基因的權(quán)利要求1-25任一項的重組溶瘤 性病毒、權(quán)利要求27的病毒基因組或/和權(quán)利要求28或四的DNA分子，和( )適合與該病毒聯(lián)合治療增生性疾病的前體藥物，該前體藥物可以由(i)的前體藥 物轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化成藥學活性化合物。
35.權(quán)利要求33至34任一項的方法，其中對象是人患者。
36.對家禽減毒的重組溶瘤性RNA病毒，其包含含有至少一種編碼細胞因子的轉(zhuǎn)基因 的核酸。
37.權(quán)利要求36的病毒，其對雞是減毒的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療增生性疾病的重組溶瘤性RNA新城疫病毒，其包含至少一種編碼禽類細胞因子的轉(zhuǎn)基因，其中該重組溶瘤性RNA新城疫病毒可從強毒力或中等毒力溶瘤性RNA新城疫病毒獲得。病毒介導的該細胞因子在天然宿主細胞中的表達導致該病毒對禽類物種的致病性降低。另外，該病毒基因組可以編碼結(jié)合蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶或/和蛋白酶。這些分子在病毒所感染的腫瘤細胞中的選擇性表達增加該病毒的抗腫瘤作用。
文檔編號A61K35/76GK102099045SQ200980103531
公開日2011年6月15日 申請日期2009年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日
發(fā)明者F·普勒, R·拜爾 申請人:拜耳先靈醫(yī)藥股份有限公司