專(zhuān)利名稱：調(diào)節(jié)間隙壓力與溶瘤病毒的遞送和分布的制作方法
調(diào)節(jié)間隙壓力與溶瘤病毒的遞送和分布
背景技術(shù)：
盡管其是大分子并且依賴于溶劑牽引來(lái)幫助有效遞送，但是溶瘤病毒治療在下列方面的意義上是獨(dú)特的這些試劑能夠在腫瘤靶中自身復(fù)制并傳播，溶胞靶細(xì)胞，釋放子代并重新靶向鄰近的細(xì)胞。因此，溶瘤病毒減輕對(duì)用于在整個(gè)腫瘤團(tuán)塊中遞送的傳送的總依賴性。

發(fā)明內(nèi)容
本文中提供在受試者中治療增生性疾病的方法，該方法包括在受試者中降低間隙壓力和/或增加血管滲透性，以及向受試者施用溶瘤病毒。這些方法改善了溶瘤病毒的遞送和分布。一個(gè)或多個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在下面的附圖和描述中給出。其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將 從說(shuō)明書(shū)、附圖、以及權(quán)利要求書(shū)中清楚看出。附圖簡(jiǎn)述

圖1A、1B和IC是示出呼腸孤病毒和雷帕霉素在體外對(duì)于B16. FlO細(xì)胞的效果的圖。將細(xì)胞(5xl03/孔)接種到96孔板中并且允許貼壁過(guò)夜。將培養(yǎng)基用雷帕霉素和/或呼腸孤病毒的兩倍稀釋液代替，分別對(duì)應(yīng)于之前測(cè)定的ED50的2、I、0. 5和O. 25倍，在新鮮培養(yǎng)基中稀釋?zhuān)掷m(xù)溫育48h。然后除去培養(yǎng)基，并使用MTS測(cè)試法來(lái)測(cè)定相對(duì)于未處理的細(xì)胞的細(xì)胞存活百分率。圖2A和2B是示出呼腸孤病毒和雷帕霉素在體內(nèi)協(xié)同作用的圖。將B16. FlO腫瘤皮下接種到C57B1/6鼠中，并且單獨(dú)或聯(lián)合在第I天和第4天瘤內(nèi)呼腸孤病毒T3D 5xIO8TCID5tl處理、以及在第1、4、8和12天腹腔內(nèi)雷帕霉素5mg/kg處理，或?qū)φ仗幚?瘤內(nèi)PBS,腹腔內(nèi)PBS)。圖2A是示出在C57Bl/g用呼腸孤病毒和雷帕霉素處理的鼠中B16. FlO腫瘤的平均腫瘤直徑的圖。圖2B是示出C57Bl/g用呼腸孤病毒和雷帕霉素處理的具有B16.FlO腫瘤的鼠的存活數(shù)據(jù)的圖。圖3是示出Treg缺失+IL-2增強(qiáng)呼腸孤病毒系統(tǒng)地遞送至皮下腫瘤的圖。使C57B1/6鼠接種皮下B16腫瘤。9天后，使鼠接受腹腔內(nèi)注射抗⑶25抗體PC-61或?qū)φ誌gG。24小時(shí)后，使鼠腹腔內(nèi)注射PBS或以75，000單位/注射的劑量腹腔內(nèi)注射重組人IL-2，一天三次，共3天。在第4天，給予單次另外注射IL-2。在該最后注射IL-2/PBS兩小時(shí)后，使鼠接受靜脈注射呼腸孤病毒(3. 75xl09TCID5(l)，24h小時(shí)后進(jìn)行又一次類(lèi)似的病毒注射。72h后，將腫瘤外植和解離，并且測(cè)定從所示處理的鼠(3只鼠/組)的腫瘤的凍融裂解物中回收的病毒滴度。圖4A和4B是示出CPA-介導(dǎo)的Treg修飾(IL-2和低劑量呼腸孤病毒)針對(duì)建立的腫瘤有治療性的圖。對(duì)于圖4A，使C57B1/6鼠接種皮下B16腫瘤。9天后，使鼠接受腹腔內(nèi)注射CPA(100mg/kg)或者抗CD25抗體PC-61或PBS。24小時(shí)后，使鼠腹腔內(nèi)注射PBS或以75，000單位/注射的劑量腹腔內(nèi)注射重組人IL-2，一天三次，共3天。在第4天，給予單次另外注射IL-2。在該最后注射IL-2/PBS兩小時(shí)后，使鼠接受靜脈注射呼腸孤病毒(以低于最大可實(shí)現(xiàn)的劑量IxlO8 TCID5tl的劑量)，24h小時(shí)后進(jìn)行又一次類(lèi)似的病毒注射。示出在腫瘤接種后隨時(shí)間變化的鼠的存活(腫瘤的任何直徑< I. 0cm) (n = 7/組)。只用呼腸孤病毒處理(半數(shù)存活時(shí)間21d)、CPA/IL-2 (23d)處理、PC-61/呼腸孤病毒(22d)處理或CPA/呼腸孤病毒(21d)處理的組的半數(shù)存活時(shí)間彼此之間沒(méi)有顯著性差異，并且這些處理中沒(méi)有一個(gè)產(chǎn)生任何長(zhǎng)期存活者。用IL-2/呼腸孤病毒(25d)、PC-61/IL-2/呼腸孤病毒(24d)或CPA/IL-2/呼腸孤病毒(25d)處理的組的半數(shù)存活時(shí)間比那些其他組的半數(shù)存活時(shí)間明顯更長(zhǎng)(P = O. 04)。用PC-61/IL-2/呼腸孤病毒或CPA/IL-2/呼腸孤病毒處理導(dǎo)致產(chǎn)生長(zhǎng)期存活者，并且這兩種情況明顯更具有治療性**，P < O. 01。圖4B是示出在如圖4A中所示最后病毒注射鼠7至10天后，針對(duì)從鼠回收的血清中的呼腸孤病毒的中和抗體的圖。發(fā)明詳述用于治療腫瘤形成的大的生物試劑可能受到瘤內(nèi)間隙壓力和/或降低的血管滲透性的限制。另外，擴(kuò)散看起來(lái)是小分子(即，MW 4000Da)在組織中被動(dòng)運(yùn)輸?shù)淖钪匾哪Ｊ?，而傳送或溶劑牽引典型地是大蛋?MW > 40，OOODa)運(yùn)動(dòng)的主要機(jī)理。 腫瘤團(tuán)塊內(nèi)的間隙壓力可源自增加的毛細(xì)血管壓力(MVP)，其依賴于動(dòng)靜脈壓力差與對(duì)血流的幾何學(xué)和粘性抗性(即，血管直徑減小的結(jié)果，其是由于實(shí)體瘤的生長(zhǎng)而減小血管直徑、從而導(dǎo)致產(chǎn)生在血管上的物理應(yīng)力的函數(shù))。同樣地，瘤內(nèi)環(huán)境是導(dǎo)致增加的間隙壓力和/或降低的血管滲透性的環(huán)境，并且可抑制大分子的遞送。降低腫瘤中靜水壓力的試劑產(chǎn)生這樣的情況，其中腫瘤團(tuán)塊外的靜水壓力將大于腫瘤本身的靜水壓力。該情況有助于大分子(例如溶瘤病毒)的遞送。因此，本文中提供在受試者中治療增生性疾病的方法，該方法包括在需要治療的受試者中降低間隙壓力和/或增加血管滲透性，以及向需要治療的受試者施用溶瘤病毒。任選地，在受試者中降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的同時(shí)、之前或之后施用溶瘤病毒。任選地，受試者中的間隙壓力通過(guò)降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑而降低。因此，任選地，降低間隙壓力的試劑也增加血管滲透性?？蛇x擇地，降低間隙壓力的試劑可和增加血管滲透性的試劑聯(lián)合使用。適用于提供的方法中的試劑包括紫杉烷。在提供的方法中使用的合適的紫杉烷包括但不限于taxol (紫杉醇)、萊龍?zhí)┧?Iarotaxel)和taxotere (多西他賽)。其他試劑包括但不限于加壓素；TNF ;白細(xì)胞間介素-I (IL-I);干擾素-(IFN-K) ;P物質(zhì)；蛋白酶抑制劑，例如N-α-甲苯磺酰基-L-賴氨?；?氯甲酮(TLCK)、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)和亮抑酶肽；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF);硝化甘油；5_羥色胺；血漿激肽，例如緩激肽；血小板激活因子(PAF);前列腺素El (PGEl);組織胺；伊馬替尼；封閉帶毒素(ZOT);白細(xì)胞間介素-2 氧化氮抑制劑，例如L-N-單甲基精氨酸(L-NMMA)和L-N-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME);以及人生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，例如吉非替尼。至少對(duì)于本文中所述的試劑和所述試劑的制備方法與使用方法，參見(jiàn)Martin et al. , Immunology 64(2)301-5 (1988) ；Zhou et al.，Radiat. Res. 168(3) :299-307 (2007) ；ffatanabe et al.，Inflammation Research 17(5-6) :472-79(1986);美國(guó)公開(kāi)No. 2005/0101559 ;Moasser etal. , J. Magn. Reson. Imaging 26(6) 1618-25 (2007);和 Vlahovic et al. , Br. J. Cancer97 (6) :735-40 (2007)，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。
任選地，受試者中的間隙壓力通過(guò)降低細(xì)胞外鈣離子濃度而降低。低的細(xì)胞外鈣離子濃度條件也可以用于增強(qiáng)血管滲透性。例如，低鈣離子濃度流體可灌流通過(guò)施用溶瘤病毒的組織的脈管系統(tǒng)。合適的灌流物的鈣離子濃度可為約40或50Tmol/L至約500Tmol/L,更優(yōu)選為約50Tmol/L至約200Tmol/L。提供約50Tmol/L的灌流物的鈣濃度。鈣離子(例如Ca2+)濃度還可以通過(guò)(例如)使用合適的緩沖劑來(lái)降低，例如螯合劑，如乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、乙二·胺四乙酸(EDTA)或1，2-雙-(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，f , Ni -四乙酸(BAPTA)。參見(jiàn)美國(guó)公開(kāi)No. 2005/0101559，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。因此，本文中提供在受試者中治療增生性疾病的方法，該方法包括向受試者施用降低間隙壓力的低鈣離子濃度流體和溶瘤病毒。任選地，所述方法還包括施用增加血管滲透性的試劑。任選地，腫瘤的間隙壓力可通過(guò)除去過(guò)量的間隙液來(lái)除去。過(guò)量的間隙液的除去通過(guò)任何已知的方法來(lái)完成，例如包括人工淋巴系統(tǒng)(ALS)。這些方法在(例如)美國(guó)公開(kāi)No. 2001/0047152、美國(guó)專(zhuān)利No. 5，484，399、美國(guó)公開(kāi)No. 2005/0165342和美國(guó)公開(kāi)No. 2003/0149407中有所描述，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。因此，本文中提供在受試者中治療腫瘤的方法，該方法包括在受試者中降低腫瘤的過(guò)量的間隙液，以及向受試者施用溶瘤病毒。任選地，在施用溶瘤病毒之前除去過(guò)量的間隙液。任選地，所述方法還包括施用增加血管滲透性的試劑。如果系統(tǒng)地施用溶瘤病毒，滲透性光動(dòng)力學(xué)治療(P-PDT)可用于通過(guò)增強(qiáng)血管滲透性而增強(qiáng)溶瘤病毒的遞送。P-PDT誘導(dǎo)的血管滲漏允許治療劑離開(kāi)脈管系統(tǒng)，并且以比不使用現(xiàn)有的滲透性PDT而獲得的濃度更高的濃度分布到過(guò)度增生性組織(例如瘤床)中。參見(jiàn)美國(guó)公開(kāi)No. 2004/0010218，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。因此，本文中提供在受試者中治療腫瘤的方法，該方法包括向受試者施用滲透性光動(dòng)力學(xué)治療劑和溶瘤病毒。任選地，滲透性光動(dòng)力學(xué)治療劑在施用溶瘤病毒之前施用。任選地，該方法還包括施用降低間隙壓力的試劑。任選地，提供的方法還包括向受試者施用免疫抑制劑。任選地，免疫抑制劑是抑制促炎細(xì)胞因子的試劑。如本文中所使用的，促炎細(xì)胞因子是指直接或間接刺激免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子。促炎細(xì)胞因子包括但不限于IL-1I、IL-3、IL-6、IL-12 p70、IL-17、MIP-II和RANTES。因此,本文中提供在受試者中治療腫瘤的方法,該方法包括向需要治療的受試者施用降低間隙壓力的試劑、抑制促炎細(xì)胞因子的試劑和溶瘤病毒。任選地，首先向受試者施用降低間隙壓力的試劑，接著施用抑制促炎細(xì)胞因子的試劑和溶瘤病毒。任選地，在抑制促炎細(xì)胞因子的試劑之后施用溶瘤病毒。任選地，抑制促炎細(xì)胞因子的試劑抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)或活性。任選地，所述試劑阻斷T-細(xì)胞應(yīng)答，同時(shí)對(duì)于B-細(xì)胞活性具有很小或沒(méi)有影響。因此，所述試劑抑制促炎細(xì)胞因子，但不抑制或最低程度地抑制NARA的產(chǎn)生。任選地，所述試劑是鉬化合物。合適的鉬化合物也包括但不限于順鉬、卡鉬、metaplatin和奧沙利鉬。任選地，降低間隙壓力的試劑是紫杉醇，抑制促炎細(xì)胞因子的試劑是卡鉬，并且溶瘤病毒是呼腸孤病毒。抑制促炎細(xì)胞因子的其他試劑包括但不限于TNF_I抗體，例如英夫利西單抗、⑶P571、⑶P870和阿達(dá)木單抗；重組人可溶性p55TNF受體，例如奧那西普；可溶性TNF受體和Fe片段融合蛋白，例如依那西普；聚乙二醇化TNF的人源化抗體的Fab片段，例如賽妥珠單抗；IL_2受體的抗I鏈的嵌合抗體，例如巴利昔單抗或達(dá)利珠單抗；IL-12p40抗體，例如ABT-874 ；IL-6受體抗體，例如MRA或托珠單抗；IFN_K抗體，例如芳妥珠單抗；抑制IL-I結(jié)合至IL-I受體的抗體，例如AMG108 ;抑制細(xì)胞因子釋放的半胱天冬酶_1抑制劑，例如 diarylsulphonylurene ;IL_15 抗體，例如美泊珠單抗；IL_8 抗體,例如 ABX-IL-8 ;IL_9抗體，包括IL-9單克隆抗體；重組人IL-21，也稱為494C10 ；TNF-I, IL-I θ、IL-6和粒細(xì)胞-巨曬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)的抑制劑，例如biophylum sensitivum ;抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)的NF-PB信號(hào)阻斷劑，例如辛伐他??；以及IL-6表達(dá)和NF-PB激活的抑制劑，例如(-)-表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯(EGCG)。抑制促炎細(xì)胞因子的其他試劑包括人重組乳鐵蛋白，其抑制促炎細(xì)胞因子和促轉(zhuǎn)移細(xì)胞因子(包括IL-6、IL-8、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和TNF-α)的細(xì)胞釋放。樹(shù)突細(xì)胞衍生的IL-12和IL-18的抑制劑(例如雷帕霉素和sanglifehrin)也適用于所提供的方法中。雷帕霉素是抑制T細(xì)胞mTOR激酶激活的免疫抑制劑，并且Sanglifehrin A是也抑制IL-2依賴性T-細(xì)胞增生的親環(huán)蛋白-結(jié)合免疫抑制劑。食用蘆丁(dietary rutin)也適用于所提供的方法中，其抑制促炎細(xì)胞因子(例如IL-I β、IL-6和GM-CS)的誘導(dǎo)。 任選地，提供的方法還包括選擇患有增生性疾病的受試者的步驟。因此，提供在受試者中治療增生性疾病的方法，該方法包括選擇患有增生性疾病的受試者，向需要治療的受試者施用降低間隙壓力的試劑和溶瘤病毒。任選地，增生性疾病是ras-介導(dǎo)的增生性疾病。因此，任選地，提供的方法還包括選擇患有ras-介導(dǎo)的增生性疾病的受試者的步驟。任選地，增生性疾病是特征為干擾素-抗性、p53-缺乏或Rb-缺乏的增生性疾病。任選地，受試者需要增強(qiáng)溶瘤病毒的遞送。因此，本文中提供向患有增生性疾病的受試者增強(qiáng)溶瘤病毒的遞送的方法，該方法包括向受試者施用降低間隙壓力的試劑和向受試者施用溶瘤病毒。這些方法還可包括選擇患有增生性疾病的受試者的步驟。任選地，提供的方法還包括下列步驟例如通過(guò)確定增生性疾病是否是ras-介導(dǎo)的增生性疾病來(lái)診斷增生性疾病的顯型。通過(guò)另外的例子的方式提供這樣的方法，該方法包括確定增生性疾病是否是干擾素抗性腫瘤、P53缺乏腫瘤或Rb缺乏腫瘤的步驟。確定增生性疾病是否具有某些顯型的方法是已知的，例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 7，306，902，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。能夠用于實(shí)施所提供的方法的溶瘤病毒包括但不限于肌尾噬菌體科、長(zhǎng)尾噬菌體科、短尾噬菌體科、復(fù)層噬菌體科、覆蓋噬菌體科、芽生噬菌體科、脂毛噬菌體科、微小紡錘形曬菌體科、痘病毒科、虹彩病毒科、藻類(lèi)DNA病毒科、桿狀病毒科、皰疫病毒科、腺病毒科、乳多空病毒科、多分體DNA病毒科、絲狀曬菌體科、微小曬菌體科、雙生病毒科、圓環(huán)病毒科、細(xì)小病毒科、嗜肝DNA病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、囊狀噬菌體科、呼腸孤病毒科、雙RNA病毒科、副粘液病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、正粘液病毒科、布尼安病毒科、沙粒病毒科、光滑噬菌體科、小RNA病毒科、伴生病毒科、豇豆花葉病毒科、馬鈴薯Y病毒科、杯狀病毒科、星狀病毒科、野田病毒科、四病毒科、番爺叢矮病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、披膜病毒科和桿狀RNA病毒科家族中成員的溶瘤病毒。這些和其他溶瘤病毒的免疫保護(hù)病毒、和重配或重組病毒也包括在所提供的方法中。此外，至少兩種溶瘤病毒的組合也同樣可以用于實(shí)施所提供的方法。一些溶瘤病毒在后面有所討論，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可以根據(jù)本文中公開(kāi)的和本領(lǐng)域可獲知的知識(shí)來(lái)使用另外的溶瘤病毒實(shí)施本發(fā)明的方法。
通常，當(dāng)病毒進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，雙鏈RNA激酶(PKR)被激活并阻斷蛋白合成，病毒不能夠在此細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。一些病毒已經(jīng)生成了系統(tǒng)來(lái)抑制PKR，從而有助于病毒蛋白合成和病毒復(fù)制。例如，腺病毒產(chǎn)生大量的小RNA-VAl RNA。VAl RNA具有廣泛的二級(jí)結(jié)構(gòu)，與通常情況下激活PKR的雙鏈RNA(dsRNA)相競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PKR。由于其需要最小長(zhǎng)度的dsRNA來(lái)激活PKR，因此VAl RNA不會(huì)激活PKR。相反，VAl RNA能夠依賴其量多的特征來(lái)隔離PKR。因此，蛋白合成不會(huì)被阻斷，并且腺病毒可以在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。Ras-激活的瘤細(xì)胞不會(huì)由于PKR而受到蛋白合成的抑制，因?yàn)閞as使PKR失活。因此這些細(xì)胞容易被病毒感染，即使病毒不具有PKR-抑制系統(tǒng)。因此，如果在腺病毒、牛痘病毒、單純皰疫病毒或副痘病毒屬羊口瘡病毒(parapoxvirus orf virus)中PKR抑制劑突變，以至于再也不能夠阻斷PKR的功能，那么所得病毒就會(huì)由于PKR抑制蛋白合成而無(wú)法感染正常細(xì)胞，但是它們可以在缺乏PKR活性的ras-激活的瘤細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。通過(guò)例子的方式，呼腸孤病毒選擇性地復(fù)制和溶胞ras-激活的瘤細(xì)胞。因此，經(jīng)過(guò)修飾或突變使得不會(huì)抑制PKR功能的病毒選擇性地在ras-激活的瘤細(xì) 胞中進(jìn)行復(fù)制，而正常細(xì)胞是抵抗性的。優(yōu)選地，溶瘤病毒為在VAl區(qū)域有突變的腺病毒、在K3L和/或E3L區(qū)域有突變的牛痘病毒、在胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因中有突變的牛痘病毒、在牛痘生長(zhǎng)因子(VGF)基因中有突變的牛痘病毒、在Y 134. 5基因中有突變的皰疹病毒、在0V20. OL基因中有突變的副痘病毒屬羊口瘡病毒、或在NS-I基因中有突變的流感病毒。在病毒胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因中有突變的牛痘病毒不能制備DNA復(fù)制所需要的核苷酸。在正常的細(xì)胞中，細(xì)胞TK水平通常非常低，并且病毒不能復(fù)制。在腫瘤中，腫瘤抑制劑Rb的損失或細(xì)胞周期蛋白活性的增加導(dǎo)致E2F途徑激活和高水平的TK表達(dá)。因此，癌細(xì)胞具有高的TK水平，并且突變的牛痘病毒可以復(fù)制和擴(kuò)散。牛痘生長(zhǎng)因子(VGF)基因是哺乳動(dòng)物表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的同系物，并且可結(jié)合和激活EGF受體(EGFR)。在VGF基因中有突變的牛痘病毒對(duì)于具有激活的EGF途徑的細(xì)胞是生長(zhǎng)抑制的，其在癌癥中通常是突變的。根據(jù)已知的病毒PKR抑制劑的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，病毒可以被修飾或突變。例如，由于E3蛋白的氨基酸末端區(qū)域與PKR的羧基-末端區(qū)域的結(jié)構(gòu)域相互作用，因此這個(gè)結(jié)構(gòu)域的缺失或點(diǎn)突變會(huì)阻止抗PKR功能(Chang et al. , PNAS 89:4825-4829(1992);Chang, H.ff.et al. , Virology 194 :537-547 (1993) ；Chang et al. , J.Virol.69 6605-6608(1995) ；Sharp et al. , Virol. 250 :301-315(1998)；和 Romano et al. , MoI.and Cell. Bio. 18 :7304-7316 (1998))。牛痘病毒的 K3L 基因編碼 pK3，pK3 是 PKR 的偽底物(pseudosubstrate)。與eIF_2的79至83殘基同源的K3L蛋白的C-末端部分的截短或點(diǎn)突變破壞了 PKR 的抑制活性(Kawagishi-Kobayashi,M. , et al. ,Mol. Cell. Biology 17 4146-4158(1997))。另一個(gè)例子是Delta24病毒，它是在ElA區(qū)域攜帶24個(gè)堿基對(duì)的缺失的突變腺病毒(Fueyo，J.，et al. ,Oncogene 19(1) :2-12 (2000)) 這個(gè)區(qū)域負(fù)責(zé)與細(xì)胞的腫瘤抑制劑Rb結(jié)合以及抑制Rb功能，從而允許細(xì)胞的增殖機(jī)能以及因此允許病毒的復(fù)制，進(jìn)而以非控制的形式進(jìn)行。Delta24在Rb結(jié)合區(qū)域有缺失，并且不能與Rb相結(jié)合。因此，在正常細(xì)胞內(nèi)，突變病毒的復(fù)制被Rb抑制。然而，如果Rb失活并且細(xì)胞變成瘤細(xì)胞，Delta24將不再被抑制。相反，突變病毒高效地進(jìn)行復(fù)制以及溶胞Rb缺陷性細(xì)胞。另外，水泡性口炎病毒(VSV)選擇性地殺死瘤細(xì)胞(并且可加入干擾素)。核糖核苷酸還原酶表達(dá)有缺陷的單純皰疹病毒I(HSV-I)的突變體hrR3在結(jié)腸癌細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，但是不能在正常的肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制(Yoon，S. S.，et al.，F(xiàn)ASEB J. 14:301-311(2000))。新城疫病毒(NDV)優(yōu)選在惡性細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，最常使用的株為73-T(Reichard, K. ff. , et al. , J. of Surgical Research 52 :448-453(1992) ；Zorn, U. etal.，Cancer Biotherapy 9(3) :22-235(1994) ；Bar-Eli, N.，et al.，J.Cancer Res. Clin.Oncol. 122 :409-415 (1996))。牛痘病毒在一些惡性腫瘤細(xì)胞系中可以進(jìn)行傳播。腦炎病毒在小鼠肉瘤腫瘤中具有溶瘤作用，但是為了減少其在正常細(xì)胞中的傳染性，可要求減少其劑量。已經(jīng)描述了在感染帶狀皰疹、肝炎病毒、流感、水痘和麻疹病毒的腫瘤患者中出現(xiàn)腫瘤的退化(評(píng)論參見(jiàn) Nemunaitis, J.，Invest. New Drugs 17 :375-386 (1999))。任選地，溶瘤病毒是呼腸孤病毒。呼腸孤病毒是指任何被分類(lèi)于呼腸孤病毒屬的病毒，不管是天然產(chǎn)生的、經(jīng)修飾過(guò)的或者是重組的。呼腸孤病毒是具有分節(jié)段的雙鏈RNA基因組的病毒。病毒粒子的直徑為60-80nm，并具有兩個(gè)同心的、均為20面體的衣殼外殼。 基因組包括10-12個(gè)離散節(jié)段的雙鏈RNA，總的基因組大小為16-27kbp。每個(gè)RNA節(jié)段的大小不同。三個(gè)獨(dú)特的、但是相關(guān)的呼腸孤病毒類(lèi)型在許多物種中被發(fā)現(xiàn)。所有三種類(lèi)型都共享共同的補(bǔ)體固定抗原。人類(lèi)呼腸孤病毒三種血清型類(lèi)型I (Lang株或TlL)、類(lèi)型2 (Jones株，T2J)以及類(lèi)型3 (Dearing株或Abney株,T3D)?；谥泻图把种圃囼?yàn),可以容易地識(shí)別這三種血清型。根據(jù)本公開(kāi)的呼腸孤病毒可以是類(lèi)型3哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒。類(lèi)型3哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒包括但不限于Dearing株和Abney株(分別為T(mén)3D或T3A)。例如參見(jiàn)ATCC登陸No. VR-232和VR-824。如上所述，呼腸孤病毒使用宿主細(xì)胞的ras途徑機(jī)能來(lái)下調(diào)雙鏈RNA-激活的蛋白激酶(PKR)，以及因此在細(xì)胞中的復(fù)制。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 6，110，461、6，136，307,6, 261，555,6, 344，195,6, 576，234 和 6，811，775，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。呼腸孤病毒可以為天然產(chǎn)生的或修飾的。當(dāng)呼腸孤病毒可以從天然來(lái)源中分離出來(lái)、并且沒(méi)有在實(shí)驗(yàn)室中被人類(lèi)有意地進(jìn)行修飾時(shí)，其是天然產(chǎn)生的。例如，呼腸孤病毒可以來(lái)源于野生來(lái)源(field source)，即來(lái)源于感染呼腸孤病毒的人類(lèi)。呼腸孤病毒還可以被選擇或者被誘變以提高溶瘤活性。呼腸孤病毒可以被修飾，但是仍然能夠可胞解地感染具有活性ras途徑的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在施用至增殖細(xì)胞之前，可以對(duì)呼腸孤病毒進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)預(yù)處理(例如使用蛋白酶進(jìn)行處理，例如使用胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)。使用蛋白酶進(jìn)行的預(yù)處理除去病毒的外層或衣殼，并且可能增加病毒的感染性。呼腸孤病毒可以被包裹在脂質(zhì)體或微團(tuán)(micelle)中(Chandran and Niben, J. of Virology 72(1) :467-751998)。例如，可以在存在形成微團(tuán)濃度的烷基硫酸鹽去垢劑時(shí)使用胰凝乳蛋白酶處理病毒粒子，從而產(chǎn)生新的傳染性亞病毒顆粒(ISVP)。呼腸孤病毒可以是重組呼腸孤病毒。例如重組呼腸孤病毒可以是重配呼腸孤病毒，其包括來(lái)自兩種或多種遺傳上不同的呼腸孤病毒的基因組節(jié)段。呼腸孤病毒基因組節(jié)段的重組/重配可以發(fā)生在宿主生物體被至少兩種遺傳上不同的呼腸孤病毒感染之后。重組/重配病毒還可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生，例如，通過(guò)以遺傳上不同的呼腸孤病毒同時(shí)感染批準(zhǔn)的宿主細(xì)胞。因此，提供的方法包括使用通過(guò)對(duì)來(lái)自兩種或多種遺傳上不同的呼腸孤病毒的基因組節(jié)段重配而形成的重組呼腸孤病毒，所述呼腸孤病毒包括但不限于人類(lèi)呼腸孤病毒，例如類(lèi)型I (例如Lang株)、類(lèi)型2 (例如Jones株)和類(lèi)型3 (例如Dearing株或Abney株)，非人類(lèi)哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒，或禽類(lèi)呼腸孤病毒。任選地，提供的方法包括使用通過(guò)對(duì)來(lái)自兩種或多種遺傳上不同的呼腸孤病毒的基因組節(jié)段重配而形成的重組呼腸孤病毒，其中至少一種親本病毒是遺傳上改造的，包含一個(gè)或多個(gè)化學(xué)合成的基因組節(jié)段，經(jīng)化學(xué)或物理誘變劑處理過(guò)，或者本身是重組事件的結(jié)果。任選地，提供的方法包括使用在化學(xué)誘變劑的存在下或者在物理誘導(dǎo)劑的存在下發(fā)生重組的重組呼腸孤病毒，該化學(xué)誘變劑包括但不限于硫酸二甲酯和澳化乙錠，該物理誘導(dǎo)劑包括但不限于紫外光和其他形式的輻射。任選地，提供的方法包括使用這樣的呼腸孤病毒，其在一個(gè)或多個(gè)基因組節(jié)段中具有突變，包括插入、替換、缺失或復(fù)制。這些突變可包括由于與宿主細(xì)胞基因組發(fā)生重組 所得的額外遺傳信息，或可包括合成的基因。例如，如本文中所描述的突變呼腸孤病毒可含有減少或基本上消除sigma3多肽表達(dá)的突變或?qū)е虏淮嬖诠δ苄詓igma3多肽的突變，如U.S. Serial No. 12/124，522中所述，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。消除sigma3多肽表達(dá)的突變或?qū)е虏淮嬖诠δ苄詓igma3多肽的突變可在編碼sigma3多肽的核酸(即，S4基因)中或在編碼調(diào)節(jié)sigma3多肽的表達(dá)或功能的多肽的核酸中。如本文中所使用的，減少sigma3多肽表達(dá)的突變是指和表達(dá)呼腸孤病毒的野生型水平的sigma3多肽相比，導(dǎo)致sigma3多肽的量減少至少30% (例如至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% )的突變。如本文中所使用的，基本上消除sigma3多肽表達(dá)的突變是指相對(duì)于由野生型呼腸孤病毒產(chǎn)生的sigma3多肽的量，導(dǎo)致sigma3多肽的量減少至少95% (例如96%、97%、98%、99%或100%)的突變。如本文中所使用的，導(dǎo)致減少或不存在功能性sigma3多肽的突變是指允許sigma3多肽表達(dá)、但導(dǎo)致形成不能夠在裝配或引入病毒衣殼中的sigma3多肽的突變。應(yīng)該理解，可期望或需要sigma3多肽保持其他功能(例如結(jié)合RNA的能力)，以使突變呼腸孤病毒保持傳播的能力。如本文中所描述的sigma3多肽中的突變可導(dǎo)致以這樣的水平引入衣殼中的sigma3多肽,該水平相對(duì)于不合突變的sigma3多肽(例如野生型sigma3多肽)是降低的。如本文中所描述的sigma3多肽中的突變還可導(dǎo)致不能弓I入病毒衣殼中的sigma3多肽。不受任何特定機(jī)理的束縛，例如由于sigma3多肽和mul多肽不能合適地結(jié)合,或由于減少或抑制sigma3多肽引入衣殼中的構(gòu)象改變,因此sigma3多肽可已經(jīng)降低功能或缺少功能。除了破壞或減少sigma3多肽的表達(dá)或者導(dǎo)致不具有功能或功能降低的sigma3多肽的突變，如本文中所描述的突變呼腸孤病毒還可在其他呼腸孤病毒衣殼多肽(例如mul、lambda2和/或sigmal)中的一者中含有一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的突變(例如第二、第三或第四突變)。含有影響sigma3多肽的突變、和任選地在其他外衣殼蛋白中的任一者或全部中含有進(jìn)一步的突變的呼腸孤病毒可以被篩選這種突變呼腸孤病毒感染并引起細(xì)胞溶胞的能力。例如，抗野生型呼腸孤病毒溶胞的瘤細(xì)胞可用于篩選本文中所述的有效的突變呼腸孤病毒。例如，進(jìn)一步的突變可減少或基本上消除mul多肽表達(dá)，或?qū)е虏淮嬖诠δ苄詍ul多肽。由M2基因編碼的mul多肽可能涉及細(xì)胞滲透，并且可在轉(zhuǎn)錄酶激活中發(fā)揮作用。各病毒粒子含有約600個(gè)mul多肽的副本,其和sigma3多肽以I : I復(fù)合物的形式存在。mul多肽在其N(xiāo)-末端上是肉豆蘧?；模缓笕舛罐觉；腘-末端42個(gè)殘基被切割下來(lái)，從而導(dǎo)致C-末端片段(mulC)。另外或可選擇地，進(jìn)一步的突變可減少或基本上消除lambda2多肽表達(dá)，或?qū)е虏淮嬖诠δ苄詌ambda2多肽，和/或進(jìn)一步的突變可減少或基本上消除sigmal多肽表達(dá)，或?qū)е虏淮嬖诠δ苄詓igmal多肽。由L2基因編碼的lambda2多肽涉及顆粒裝配，并且表現(xiàn)出鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶活性。由SI基因編碼的sigmal多肽涉及細(xì)胞附著，并且起到病毒血凝素的作用。例如，呼腸孤病毒具有具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的lambda-3多肽；具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的sigma-3多肽；具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的mu-1多肽；和/或具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的mu-2多肽，如U. S. Serial No. 12/046, 095中所述，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。通過(guò)例子的方式，lambda-3多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾是殘基214處的Val、殘基267處的Ala、殘基557處的Thr、殘基755處的Lys、殘基756處的Met、殘基926處的Pro、殘基963處的Pro、殘基979處的Leu、殘基1045處的Arg、殘基1071處 的Val、或其任意組合，其相對(duì)于GenBank登陸No. M24734. I進(jìn)行編號(hào)。應(yīng)該注意，當(dāng)氨基酸序列是殘基214處的Val或殘基1071處的Val時(shí)，氨基酸序列還包括在所述氨基酸序列中的至少一個(gè)另外的改變。任選地，lambda-3多肽包括SEQ ID NO :18中示出的序列。進(jìn)一步通過(guò)例子的方式，sigma-3多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾是殘基14處的Leu、殘基198處的Lys、或其任意組合，其相對(duì)于GenBank登陸No. K02739進(jìn)行編號(hào)。應(yīng)該注意，當(dāng)氨基酸序列是殘基14處的Leu時(shí)，氨基酸序列還包括在所述氨基酸序列中的至少一個(gè)另外的改變。任選地，sigma-3多肽包括SEQ ID NO :14中示出的序列。進(jìn)一步通過(guò)例子的方式,mu_l多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾是殘基73處的Asp，其相對(duì)于GenBank登陸No. M20161. I進(jìn)行編號(hào)。任選地，mu-Ι多肽包括SEQ ID NO :16中示出的序列。還通過(guò)例子的方式,mu_2多肽中的氨基酸修飾是殘基528處的Ser，其相對(duì)于GenBank登陸No. AF461684. I進(jìn)行編號(hào)。任選地，mu-Ι多肽包括SEQ ID NO :15中示出的序列。如本文中所描述的具有一個(gè)或多個(gè)修飾的呼腸孤病毒還可包括呼腸孤病毒sigma-2多肽。這種sigma-2多肽在70、127、195、241、255、294、296或340位中的一共或多個(gè)具有Cys，其相對(duì)于GenBank登陸No. NP694684. I進(jìn)行編號(hào)。任選地，sigma-2多肽包括SEQ ID NO 12中示出的序列。任選地，呼腸孤病毒具有具有一個(gè)或多個(gè)核酸修飾的LI基因組節(jié)段；具有一個(gè)或多個(gè)核酸修飾的S4基因組節(jié)段；具有一個(gè)或多個(gè)核酸修飾的Ml基因組節(jié)段；和/或具有一個(gè)或多個(gè)核酸修飾的M2基因組節(jié)段，如U. S. Serial No. 12/046, 095中所述，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。通過(guò)例子的方式，LI基因組節(jié)段中的一個(gè)或多個(gè)核酸修飾是660位的 T、817 位的 G、1687 位的 A、2283 位的 G、2284-2286 位的 ATG,2794 位的 C、2905 位的 C、2953位的C、3153位的A、或3231位的G，其相對(duì)于GenBank登陸No. M24734. I進(jìn)行編號(hào)。任選地，LI基因組節(jié)段包括SEQ ID NO :8中示出的序列。進(jìn)一步通過(guò)例子的方式，S4基因組節(jié)段中的一個(gè)或多個(gè)核酸修飾是74位的A和624位的A，其相對(duì)于GenBank登陸No. K02739進(jìn)行編號(hào)。任選地，S4基因組節(jié)段包括SEQ ID NO :4中示出的序列。進(jìn)一步通過(guò)例子的方式，M2基因組節(jié)段中的核酸修飾可以是248位的C，其相對(duì)于GenBank登陸No. M20161. I進(jìn)行編號(hào)。例如，M2基因組節(jié)段包括SEQ ID NO :6中示出的序列。還通過(guò)例子的方式，Ml基因組節(jié)段中的核酸修飾是1595位的T，其相對(duì)于GenBank登陸No. AF461684. I進(jìn)行編號(hào)。任選地，Ml基因組節(jié)段包括SEQ ID NO :5中所示的序列。如本文中所描述的呼腸孤病毒可包括本文中公開(kāi)的任意修飾或修飾的組合。任選地，如本文中所描述的呼腸孤病毒包括具有SEQ ID NO :1-10中所示的序列的基因組節(jié)段或SEQ ID NO :11、12和16-21、以及SEQ IDNO :13和/或14中所示的多肽。任選地，如本文中所公開(kāi)的呼腸孤病毒被確定為IDAC登陸No. 190907-01，保藏時(shí)間為2007年9月19日，保藏機(jī)構(gòu)為加拿大國(guó)際微生物保藏中心(IDAC)，保藏單位地址為R3E 3R2加拿大馬尼托巴省溫尼伯市阿靈頓街1015號(hào)。辛德畢斯病毒(SIN)可被用于本文 中所述的方法之中。辛德畢斯病毒是披衣病毒科家族中的阿爾法病毒屬中的成員。辛德畢斯病毒基因組為11703個(gè)核苷酸的單鏈RNA，在5’末端帶帽，在3’末端多聚腺苷酸化?；蚪M包括49S不翻譯區(qū)(UT)、非結(jié)構(gòu)蛋白nsPl、nsP2、nsP3和nsP4，然后是啟動(dòng)子。啟動(dòng)子之后是26S UT、結(jié)構(gòu)蛋白C、E3、E2、6K和E1，最后是3’-UT和多聚腺苷酸化末端。基因組49S RNA是正義的，有傳染性的，并且在被感染的細(xì)胞內(nèi)起mRNA作用。辛德畢斯載體在體內(nèi)系統(tǒng)地和特異性地感染/檢測(cè)以及殺死轉(zhuǎn)移性腫瘤，從而導(dǎo)致了對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制，并提高了存活機(jī)會(huì)(Hurtado et al. , RejuvenationRes. 9 (I) :36-44(2006))。辛德畢斯病毒通過(guò)使用Mr 67，000昆布氨酸受體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，該受體水平在腫瘤中比在正常細(xì)胞有所提高。腫瘤昆布氨酸受體的過(guò)表達(dá)可以解釋辛德畢斯載體在體內(nèi)對(duì)于腫瘤細(xì)胞所展示的特異性和有效性。辛德畢斯不一定需要經(jīng)過(guò)遺傳處理來(lái)靶向癌細(xì)胞或被直接注射到腫瘤中。辛德畢斯可被注射到受試者的任何地方，并通過(guò)血流到達(dá)革巴點(diǎn)區(qū)域(Tseng et al. ,Cancer Res. 64(18) :6684-92 (2004)。辛德畢斯還可以被遺傳改造從而攜帶一種或多種抑制針對(duì)病毒的免疫應(yīng)答的基因、和/或促進(jìn)針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的基因，例如抗腫瘤細(xì)胞因子基因，如白細(xì)胞間介素-12和白細(xì)胞間介素-15基因。溶瘤病毒可以是天然產(chǎn)生的或經(jīng)修飾的。在施用到瘤細(xì)胞之前，病毒可以經(jīng)過(guò)化學(xué)或生物化學(xué)的預(yù)處理(例如使用蛋白酶如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶進(jìn)行處理)。使用蛋白酶進(jìn)行預(yù)處理除去病毒的外層或衣殼，可以增加病毒的感染性。病毒可以被包裹在脂質(zhì)體或微團(tuán)中，以降低或預(yù)防來(lái)自已針對(duì)該病毒產(chǎn)生了免疫性的哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答(Chandran and Nibert, J. of Virology 72(1) :467-75 (1998))。例如，在存在能夠形成微團(tuán)的濃度的烷基硫酸鹽去垢劑時(shí)使用胰凝乳蛋白酶處理病毒粒子，從而產(chǎn)生新的傳染性亞病毒顆粒。溶瘤病毒還可以為重配病毒或ISVP。本發(fā)明的方法包括根據(jù)本文中所公開(kāi)的和本領(lǐng)域中獲知的知識(shí)來(lái)使用任何溶瘤病毒。溶瘤病毒可以是天然產(chǎn)生的或經(jīng)修飾的。當(dāng)溶瘤病毒可以從天然來(lái)源中被分離出來(lái)并且沒(méi)有被人類(lèi)在實(shí)驗(yàn)室有意進(jìn)行修飾過(guò)的時(shí)候，其是天然產(chǎn)生的。例如，溶瘤病毒可以來(lái)源于野生來(lái)源，即來(lái)源于被溶瘤病毒感染的人類(lèi)。溶瘤病毒可以是重組溶瘤病毒。例如，重組溶瘤病毒源自對(duì)來(lái)自兩種或多種遺傳上不同的溶瘤病毒的基因組節(jié)段重配(本文中也稱為重配體)而形成的重組溶瘤病毒。溶瘤病毒基因組節(jié)段的重配可以發(fā)生在宿主生物體被至少兩種遺傳上不同的溶瘤病毒感染之后。重組病毒還可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生,例如,通過(guò)以遺傳上不同的溶瘤病毒同時(shí)感染批準(zhǔn)的宿主細(xì)胞。任選地，所述方法包括使用通過(guò)對(duì)來(lái)自兩種或多種遺傳上不同的溶瘤病毒的基因組節(jié)段重配而形成的重組溶瘤病毒，其中至少一種親本病毒是遺傳上改造的，包含一個(gè)或多個(gè)化學(xué)合成的基因組節(jié)段，經(jīng)化學(xué)或物理誘變劑處理過(guò)，或者本身是重組事件的結(jié)果。任選地，所述方法包括使用在化學(xué)誘變劑的存在下或者在物理誘導(dǎo)劑的存在下發(fā)生重組的重組溶瘤病毒，該化學(xué)誘變劑包括但不限于硫酸二甲酯和澳化乙錠，該物理誘導(dǎo)劑包括但不限于紫外光和其他形式的輻射。任選地，所述方法包括使用這樣的溶瘤病毒，其在一個(gè)或多個(gè)基因組節(jié)段中具有突變，包括插入、替換、缺失或復(fù)制。這些突變可包括由于與宿主細(xì)胞基因組發(fā)生重組所得的額外遺傳信息，或可包括合成的基因，例如編碼抑制抗病毒免疫應(yīng)答的試劑的基因。任選地，溶瘤病毒是突變?nèi)芰霾《?。例如，可以通過(guò)例如向病毒粒子外衣殼中引入突變的外殼蛋白來(lái)對(duì)溶瘤病毒進(jìn)行修飾。任選地，突變?nèi)芰霾《臼峭蛔兒裟c孤病毒。如本文中所描述的突變呼腸孤病毒可含有減少或基本上消除sigma3多肽表達(dá)的突變或?qū)е虏淮嬖诠δ苄詓igma3多肽的突變，如U. S. Serial No. 12/124，522中所述，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。任選地。提供的方法中使用的突變呼腸孤病毒是如U. S. Serial No. 12/046, 095中所述的那樣突變的，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。本文中所稱的突變可以是替換、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸。例如點(diǎn)突變包括單核苷酸轉(zhuǎn)變(single nucleotide transition)(嘌呤至嘌呤或卩密唳至卩密卩定)或顛換(嘌呤至嘧啶或嘧啶至嘌呤)、和單或多核苷酸缺失或插入。核酸中的突變可導(dǎo)致在編碼的多肽中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)保守或非保守氨基酸替換，這可導(dǎo)致構(gòu)象改變或者損失或部分損失功能；翻譯的閱讀框的偏移(框偏移)，這導(dǎo)致從該點(diǎn)編碼的完全不同的多肽；早熟的終止密碼子，這導(dǎo)致截短的多肽(截短)，或病毒核酸中的突變根本不可改變編碼的多肽(沉默的或無(wú)義的)。對(duì)于保守和非保守氨基酸替換的公開(kāi)，例如參見(jiàn)Johnson和Ovenngton,1993，J. Mol. Biol. 233:716-38 ；Henikoff 和 Henikoff,1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :10915-19 ;和美國(guó)專(zhuān)利 No. 4，554，101?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法來(lái)在溶瘤病毒的核酸產(chǎn)生突變。例如，定點(diǎn)誘變法可用于修飾呼腸孤病毒核酸序列。定點(diǎn)誘變法的一種最普通的方法是寡核苷酸定點(diǎn)誘變法。在寡核苷酸定點(diǎn)誘變法中，將編碼序列中的期望改變的寡核苷酸退火到目標(biāo)DNA的一條鏈中，并起到引發(fā)DNA合成的引物的作用的。以這種方式，含有序列改變的寡核苷酸弓I入新合成的鏈中。例如參見(jiàn) Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 488 ；KunkeI etal.，1987，Meth. Enzymol. 154 367 ；Lewis and Thompson，1990，Nucl. Acids Res. 18 :3439 ；Bohnsack，1996，Meth. Mol. Biol. 57 :1 ；Deng 和 Nickoloff，1992，Anal. Biochem. 200 :81 ；以及Shimada，1996，Meth. Mol. Biol. 57 :157。其他方法在本領(lǐng)域中慣例地用于修飾蛋白或多肽的序列。例如，含有突變的核酸可使用PCR或化學(xué)合成法來(lái)產(chǎn)生，或可化學(xué)合成氨基酸序列中具有期望改變的多妝。例如參見(jiàn)Bang and Kent，2005，Proc. Natl. Acad. Sci. USA102 :5014-9并且并入本文中。病毒可使用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)純化。例如參見(jiàn)Schiff et al.，“Orthoreovirusesand Their Replication，，，Ch 52，in Fields Virology, Knipe 和 Howley，eds. , 2006,Lippincott Williams 和 Wilkins ;Smith et al.，1969，Virology 39(4) :791-810 ;和美國(guó)專(zhuān)利No. 7，186，542.7, 049，127.6, 808，916和6，528，305，其全部通過(guò)引用的方式并入本文中。如本文中所使用的，純化的病毒是指從天然地伴隨它們的細(xì)胞組分中分離出來(lái)的病毒。典型地，當(dāng)它們是至少70干重％ (例如至少75干重％、80干重％、85干重％、90干重％、95干重％或99干重％ )、并且不含和它們天然地締合的蛋白與其他細(xì)胞組分時(shí)，病毒被認(rèn)為是純化的。本文中提供包含溶瘤病毒的藥物組合物。本文中還提供包含治療劑(例如降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑)的藥物組合物。任選地，藥物組合物包含溶瘤病毒和降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑。任選地，藥物組合物包含溶瘤病毒、降低間隙壓力和/或血管滲透性的試劑、和抑制促炎細(xì)胞因子的試劑。因此，提供的藥物組合物可包含一種試劑或多于一種的試劑。例如，獨(dú)立的藥物組合物或相同的組合物中可含有溶瘤病毒、降低間隙壓力和/或血管滲透性的試劑、和抑制促炎細(xì)胞因子的試劑中的每一種。如果獨(dú)立的藥物組合物中含有溶瘤病毒和所述試劑，所述組合物可伴隨或連續(xù)施用。本文中提供的組合物在藥學(xué)上可接受的載體中在體外或體內(nèi)施用。藥學(xué)上可接受的載體可以是可起到呼腸孤病毒的媒介、載體或介質(zhì)的作用的固體、半固體或液體材料，因此，含有呼腸孤病毒和/或一種或多種提供的試劑的組合物可以為片劑、丸劑、粉末、錠劑、香袋劑、酏劑、懸浮劑、乳劑、溶液、糖漿、氣霧劑(作為固體或在液體介質(zhì)中)、例如包含最多10重量％的活性化合物的藥膏、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無(wú)菌可注射用溶液、和無(wú)菌密封粉末的形式。任選地，所述組合物含有適于輸注的溶瘤病毒。對(duì)于靜脈輸注，有兩種類(lèi)型的通常使用的流體類(lèi)晶體流體和膠體。類(lèi)晶體流體是無(wú)機(jī)鹽或其他水溶性分子的水溶液。膠體含有更大的不溶性分子，例如明膠；血液本身是膠體。最通常使用的類(lèi)晶體流體是生理鹽水，其是濃度為O. 9%的氯化鈉溶液，并且接近血液中的濃度(等滲)。林格氏乳酸鹽溶液或林格氏乙酸鹽溶液是另外的通常用于大體積流體置換的等滲溶液。如果患者處于低血糖或高鈉的風(fēng)險(xiǎn)中，經(jīng)常使用有時(shí)稱為D5W的在水中的5%的葡萄糖溶液代替。合適的載體的一些例子包括磷酸鹽-緩沖鹽水或另外的生理學(xué)上可接受的緩沖液、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、西黃耆膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無(wú)菌水、糖漿和甲基纖維素。藥物組合物還另外包括但不限于潤(rùn)滑劑例如滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油；潤(rùn)濕劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑例如甲基和丙基羥基苯甲酸酯；甜味劑；和調(diào)味劑。藥物組合物可以被配制為在通過(guò)采用本領(lǐng)域已知的程序施用后，提供迅速的、持續(xù)的或延長(zhǎng)的突變呼腸孤病毒釋放。除了下面所述的代表性制劑，在藥物組合物中使用的其他合適的制劑可在Remington TheScience and Practice of Pharmacy(21th ed. )ed. David B. Troy, Lippincott Williams& Wilkins, 2005中找到。為了制備固體組合物例如片劑，突變呼腸孤病毒可與藥物載體混合以形成固體組合物。任選地，片劑或丸劑可以被包衣或混合起來(lái)以提供獲得延長(zhǎng)作用時(shí)間優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如，片劑或丸劑可以包含內(nèi)部劑量和外部劑量成分，后者以外殼的形式包裹前者。兩種成分可以通過(guò)腸溶衣層分開(kāi)，腸溶衣在胃部可以抵抗崩解，使得內(nèi)部組分完整地進(jìn)入十二指腸或延緩其釋放。可以使用不同的材料用于這種腸溶衣或包衣層，這些材料包括許多聚合酸，以及聚合酸與諸如蟲(chóng)漆、十六烷醇和醋酸纖維素的這些材料的混合物。包含用于口服或注射的呼腸孤病毒和/或試劑的液體制劑通常包括水溶液、適宜口味的糖漿、水性或油性懸浮劑、以及含有例如玉米油、棉花子油、芝麻油、椰子油或花生油的食用油的經(jīng)調(diào)味乳劑、以及酏劑和類(lèi)似的藥物媒介物。、
用于吸入或吹入的組合物包括在藥學(xué)上可以接受的水或有機(jī)溶劑或它們的混合物中的溶液和懸浮液、以及粉末。這些液體或固體組合物可以含有如本文中所描述的合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑。這種組合物可經(jīng)過(guò)口服或鼻呼吸途徑施用于局部或全身作用。藥學(xué)上可接受的溶劑中的組合物可以通過(guò)使用惰性氣體噴霧給藥。噴霧溶液可以從噴霧裝置直接吸入，或者噴霧裝置可以與面罩吸入器或間歇性正壓呼吸機(jī)相連。溶液、懸浮液或粉末組合物可以從以適當(dāng)方式遞送制劑的裝置中通過(guò)口或鼻施用。任選地在本公開(kāi)的方法中使用的另外的制劑包括經(jīng)皮遞送裝置(例如貼劑)。這種經(jīng)皮貼劑可用于提供如本文中所描述的病毒和試劑的連續(xù)或間斷注入。用于遞送藥劑的經(jīng)皮貼劑的構(gòu)造和用途是本領(lǐng)域公知的。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 5，023，252。這種貼劑可以被構(gòu)建用于連續(xù)的、脈動(dòng)的或按要求遞送突變呼腸孤病毒。如上所述，如果需要，病毒和/或其他試劑可以被包裹在脂質(zhì)體或微團(tuán)中，以降低或預(yù)防針對(duì)所述病毒或試劑產(chǎn)生了免疫性的哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。這些組合物被稱為免疫保護(hù)病毒或試劑。例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 6，565，831和7，014，847?！ぴ谔峁┑姆椒ㄖ?，溶瘤病毒例如以這樣的方式系統(tǒng)地施用，該方式為使得其可最終解除靶腫瘤或腫瘤細(xì)胞。使用病毒的途徑、以及制劑、載體或媒介，取決于靶細(xì)胞的位置和類(lèi)型?？梢圆捎枚喾N施用途徑。例如，對(duì)于易接近的實(shí)體瘤，可通過(guò)直接注射到腫瘤中來(lái)施用病毒。對(duì)于造血瘤，例如，可靜脈或血管內(nèi)施用病毒。對(duì)于體內(nèi)不易接近的腫瘤，例如轉(zhuǎn)移瘤(metastases),病毒以這樣的方式施用，該方式為使得其可系統(tǒng)地輸送通過(guò)哺乳動(dòng)物的機(jī)體，從而導(dǎo)致到底(例如靜脈或肌肉內(nèi))。可選擇地，病毒直接施用至單個(gè)實(shí)體瘤，其中然后其被攜帶系統(tǒng)地通過(guò)機(jī)體至轉(zhuǎn)移瘤。病毒也可以皮下、腹腔內(nèi)、鞘內(nèi)或室內(nèi)(例如對(duì)于腦瘤)、局部(例如對(duì)于黑素瘤)、口腔(例如對(duì)于口腔或食道癌)、直腸(例如對(duì)于結(jié)腸直腸癌)、陰道(例如對(duì)于子宮癌或陰道癌)、通過(guò)吸入噴霧或氣霧劑經(jīng)鼻(例如對(duì)于肺癌)施用。任選地，病毒至少一日一次連續(xù)地施用至受試者、或最多間歇地或連續(xù)地整天連續(xù)數(shù)日施用至受試者一段時(shí)間。因此，例如病毒通過(guò)靜脈施用的方式在任何藥理學(xué)上可接受的溶液中施用至受試者，或以輸注的方式在一段時(shí)間內(nèi)施用至受試者。例如，物質(zhì)可通過(guò)注射(例如頂或皮下)系統(tǒng)地施用或每日口服至少一日一次。或通過(guò)輸注以這樣的方式施用，該方式為使得導(dǎo)致每日遞送到受試者的組織或血流中。當(dāng)病毒通過(guò)輸注在一段時(shí)間內(nèi)施用時(shí)，所述時(shí)間例如為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或24小時(shí)，或I至24小時(shí)之間的任何時(shí)間(包括I和24小時(shí))，或更多。任選地，所述時(shí)間為5、15、30、60、90、120、150或180分鐘，或5至180分鐘之間的任何時(shí)間(包括5和180分鐘)，或更多。因此，例如，病毒通過(guò)輸注施用60分鐘。施用可每日重復(fù)，共2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、21、28天，或2至28天之間的任何時(shí)間(包括2和28天)，或更多。提供的方法的降低間隙壓力和/或血管滲透性的試劑或其他治療劑(即，抑制促炎細(xì)胞因子的試劑)也通過(guò)多種施用途徑來(lái)施用。因此，所述試劑通過(guò)多種施用途徑中的任一種來(lái)施用，包括局部、口腔、胃腸外、靜脈、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、透皮、肝內(nèi)、顱內(nèi)、霧化/吸入、或通過(guò)支氣管鏡檢查法滴注來(lái)施用。任選地，治療劑以上面涉及溶瘤病毒所述的方式連續(xù)地施用。因此，例如，所述試劑通過(guò)靜脈施用的方式在任何藥理學(xué)上可接受的溶液中施用至受試者，或以輸注的方式在一段時(shí)間內(nèi)施用至受試者。任選地，所述試劑在治療位點(diǎn)處或其附近局部施用?？蛇x擇地，所述試劑系統(tǒng)地施用。降低間隙壓力和/或血管滲透性的試劑的施用的量(即，有效量)為足以降低間隙壓力和/或增加血管滲透性。抑制促炎細(xì)胞因子的試劑的施用的量(即，有效量)為足以抑制一種或多種促炎細(xì)胞因子。通過(guò)例子的方式，紫杉烷的有效量包括約40-300mg/m2的腫瘤體積，或40至300mg/m2之間的任何量(包括40和300mg/m2)。因此，有效量的紫杉烷包括130_225mg/m2。通過(guò)另外的例子的方式，鉬化合物的有效量包括約5-1000mg/m2或5至1000mg/m2之間的任何量(包括5和1000mg/m2)。因此，例如順鉬的有效量包括約175-200mg/m2，卡鉬的有效量包括約 200-600mg/m2。其他試劑的有效量為 O. 001-10，000mg/kg 體重，或 0. 001 至 10，OOOmg/kg體重之間的任何量(包括0. 001和10，000mg/kg體重)。任選地，鉬化合物的有效量包括約2至7mg/mL分鐘(AUC),其通過(guò)Calvert式來(lái)計(jì)算。任選地,鉬化合物的有效量包括約5或6mg/mL分鐘(AUC),其通過(guò)Calvert式來(lái)計(jì)算。任選地,鉬化合物以靜脈輸注的方式施用30分鐘的時(shí)間。本文中公開(kāi)的病毒的施用的量(B卩，有效量)為足以治療增生性疾病。當(dāng)施用至增殖細(xì)胞的病毒影響受到影響的細(xì)胞的溶胞(例如溶瘤)，從而導(dǎo)致異常增殖細(xì)胞的數(shù)量減 少、癌的尺寸降低和/或與增生性疾病相關(guān)的癥狀(例如疼痛)減輕或消除時(shí)，增生性疾病被治療。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)溶瘤是指至少10%的增殖細(xì)胞溶胞(例如至少約20%、30%、40%、50%或75%的細(xì)胞溶胞)。溶胞百分率可(例如)通過(guò)測(cè)定哺乳動(dòng)物中癌的尺寸降低或增殖細(xì)胞的數(shù)量的減少來(lái)確定，或通過(guò)測(cè)定體外細(xì)胞溶胞的量來(lái)確定(例如來(lái)自增殖細(xì)胞的活組織切片檢查)。有效量的病毒將在個(gè)體基礎(chǔ)上來(lái)確定，并且可至少部分基于使用的特定病毒、個(gè)體的尺寸、年齡、性別、以及異常增殖細(xì)胞的尺寸和其他特征。例如，對(duì)于人類(lèi)的治療，使用約IO3至IO12空斑形成單位(PFU)的病毒，這取決于存在的增殖細(xì)胞或癌的類(lèi)型、尺寸和數(shù)量。例如，有效量可以是約I. 0PFU/kg體重至約1015PFU/kg體重(例如約102PFU/kg體重至約1013PFU/kg體重)。任選地，有效量是約IxlO8至約1x1012TCID5。。任選地，有效量是約1X101QTCID5。。通過(guò)例子的方式，175mg/m2的降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑(例如紫杉醇)施用至受試者；以及3X101(ITCID5(I或IxIOiciTCID5ci的呼腸孤病毒施用至受試者。任選地，200mg/m2的的降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑(例如紫杉醇)施用至受試者；以及3X101(iTCID5(i或IxIOiciTCID5ci的呼腸孤病毒施用至受試者。任選地，降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑以3小時(shí)靜脈輸注的形式施用。任選地，呼腸孤病毒以I小時(shí)靜脈輸注的形式施用。通過(guò)另外的例子的方式，175mg/m2的降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑(例如紫杉醇)施用至受試者；5mg/ml分鐘(AUC,其通過(guò)Calvert式來(lái)計(jì)算)的抑制促炎細(xì)胞因子的試劑(例如卡鉬)施用至受試者；以及3X101(iTCID5(i或IxIOiciTCID5ci的呼腸孤病毒施用至受試者。任選地，200mg/m2的的降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑(例如紫杉醇)施用至受試者；6mg/ml分鐘(AUC,其通過(guò)Calvert式來(lái)計(jì)算)的抑制促炎細(xì)胞因子的試劑(例如卡鉬)施用至受試者；以及3X101(iTCID5(i或IxIOiciTCID5ci的呼腸孤病毒施用至受試者。任選地，降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑以3小時(shí)靜脈輸注的形式施用。任選地，抑制促炎細(xì)胞因子的試劑以30分鐘靜脈輸注的形式施用。任選地，呼腸孤病毒以I小時(shí)靜脈輸注的形式施用。
病毒和治療劑以及含有病毒和試劑的最佳劑量取決于多種因素。需要的確切劑量將隨受試者的變化而變化，其取決于物種、年齡、體重和受試者的總體情況、接受治療的疾病的嚴(yán)重性、使用的特定病毒或載體以及其施用方式。因此，不可能為每種組合物指定確切劑量。然而，僅僅通過(guò)本文中所提供的指導(dǎo)來(lái)使用日常試驗(yàn)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員就可確定合適的量。施用組合物的有效劑量和安排可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定。例如，多種增生性疾病的動(dòng)物模型可得自 Jackson Laboratory,600 Main Street,Bar Harbor,Maine 04609 USA。直接測(cè)定(例如腫瘤組織學(xué))和功能測(cè)定(例如受試者的存活或腫瘤的尺寸)都可用于監(jiān)控對(duì)于治療的應(yīng)答。這些方法包括處理代表性動(dòng)物以評(píng)價(jià)種群數(shù)，增加試驗(yàn)所必需的動(dòng)物數(shù)量。腫瘤中熒光素酶活性的測(cè)定提供可選擇的方法來(lái)評(píng)價(jià)腫瘤體積，而無(wú)需處理動(dòng)物并且允許進(jìn)行治療的縱向群體基分析(longitudinal population-based analysis)。用于施用組合物的劑量范圍大到足以提供所期望的效果，使得疾病的癥狀受到影 響。劑量不應(yīng)該大到會(huì)引發(fā)不良副作用，例如不希望的交叉反應(yīng)和過(guò)敏性反應(yīng)。如果發(fā)生任何禁忌癥時(shí)，劑量可以由個(gè)人醫(yī)師進(jìn)行調(diào)節(jié)。劑量改變并且每日以一種或多種劑量施用來(lái)施用I天或數(shù)天。提供的病毒和治療劑以單劑量或多劑量(例如2、3、4、6或更多劑量)來(lái)施用。例如，如果通過(guò)輸注來(lái)施用，輸注可以是單緩釋劑量，或可以通過(guò)多次輸注來(lái)遞送。治療可持續(xù)數(shù)天至數(shù)月，或直到實(shí)現(xiàn)疾病的減輕為止。提供的病毒和治療劑伴隨(例如作為混合物)、分開(kāi)但同時(shí)(例如通過(guò)分開(kāi)的靜脈線進(jìn)入相同受試者)、或依次(例如首先給予一種化合物或試劑，接著給予第二種)地聯(lián)合施用。因此，術(shù)語(yǔ)聯(lián)合用于指兩種或多種試劑的伴隨、同時(shí)或依次施用。通過(guò)例子的方式，降低間隙壓力的試劑在溶瘤病毒之前或同時(shí)施用。通過(guò)另外的例子的方式，降低間隙壓力的試劑第一或第二施用，抑制促炎細(xì)胞因子的試劑第一或第二施用，并且溶瘤病毒第三施用。任選地，降低間隙壓力的試劑第一施用，抑制促炎細(xì)胞因子的試劑和溶瘤病毒同時(shí)施用。當(dāng)一種化合物在另一種化合物之前施用時(shí)，第一化合物在第二化合物施用之前數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、數(shù)天或數(shù)周施用。例如，第一化合物可在第二化合物施用之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、36、48、60或72小時(shí)、或I至72小時(shí)之間的任何時(shí)間(包括I和72小時(shí))施用。任選地，第一化合物在第二化合物之前多于72小時(shí)施用。通過(guò)另外的例子的方式，第一化合物可在第二化合物施用之前1、5、15、30、60、90、120、150或180分鐘、或I至180分鐘之間的任何時(shí)間(包括I和180分鐘)施用。任選地，第一化合物在第二化合物施用之前1、2、3、4、5、6、7、14、21或28天、或I至28天之間的任何時(shí)間(包括I和28天)施用。任選地，第一化合物在第二化合物之前多于28天施用。例如，降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑在溶瘤病毒施用之前約I至8小時(shí)施用。通過(guò)另外的例子的方式，降低間隙壓力和/或增加血管滲透性在溶瘤病毒施用之前4、6、8或10小時(shí)第一施用，抑制促炎細(xì)胞因子的試劑在溶瘤病毒施用之前I小時(shí)第二施用，并且溶瘤病毒第三施用(即，在施用抑制促炎細(xì)胞因子的試劑I小時(shí)后施用)。溶瘤病毒或包含這種病毒的藥物組合物任選地包裝在試劑盒中。試劑盒還包含一種或多種試劑、或包含這種降低間隙壓力和/或增加血管滲透性的試劑的藥物組合物。任選地，試劑盒還包含一種或多種抑制促炎細(xì)胞因子的試劑、一種或多種化學(xué)治療劑、一種或多種免疫抑制劑、和/或一種或多種抗-抗-病毒抗體。藥物組合物可配制為單位劑量形式。術(shù)語(yǔ)“單位劑量形式”是指物理上不連續(xù)的單位，作為單元?jiǎng)┝坑糜谌耸茉囌吆推渌溉閯?dòng)物，每個(gè)單位含有與合適的藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合的、為了產(chǎn)生期望的治療效果而計(jì)算出的突變呼腸孤病毒的預(yù)定量。提供的方法可以與其他腫瘤治療法例如化學(xué)治療法、放射性治療法、手術(shù)法、激素治療法和/或免疫治療法相結(jié)合。因此，溶瘤病毒的施用可以與手術(shù)或去除瘤聯(lián)合。因此，本文中提供治療實(shí)體瘤的方法，該方法包括瘤的手術(shù)去除和在瘤位點(diǎn)或其附近施用溶瘤病毒。在提供的方法中所述組合物任選地與已知的抗癌化合物或化學(xué)治療試劑聯(lián)合施用或在其基礎(chǔ)上附加施用?；瘜W(xué)治療試劑為可以抑制腫瘤生長(zhǎng)的化合物。這些試劑包括但不限于5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C、甲氨蝶吟、羥基脲、環(huán)磷酰胺、氮烯唑胺、米托蒽醌、蒽環(huán)類(lèi)(表柔比星和多柔比星)、受體抗體例如赫賽汀、依托泊苷、pregnasome、激素治療劑如他莫 西芬和抗雌激素、干擾素、芳香酶抑制劑、促孕劑和LHRH類(lèi)似物。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)增生性疾病是指任何這樣的細(xì)胞疾病，其中和正常組織生長(zhǎng)相比，細(xì)胞增生過(guò)快。增生性疾病包括但不限于癌，其葉稱為腫瘤。癌可包括但不限于胰腺癌、乳腺癌、腦瘤(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、肝癌、神經(jīng)性纖維瘤I和白血病。癌可以是實(shí)體癌(例如肉瘤或癌瘤)或影響造血系統(tǒng)的癌細(xì)胞生長(zhǎng)(例如淋巴瘤或白血病)。其他增生性疾病包括但不限于神經(jīng)性纖維瘤。通常，在使用溶瘤病毒進(jìn)行治療的增生性疾病中，和疾病相關(guān)的一種或多種增殖細(xì)胞可具有突變，其中Ras基因(或ras信號(hào)傳導(dǎo)途徑的元件)被直接(例如通過(guò)激活ras中的突變)或間接(例如通過(guò)激活ras途徑中的上游元件或下游元件)激活。激活ras途徑中的上游元件包括(例如)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)或Sos的轉(zhuǎn)化。例如參見(jiàn)Wiessmuller 和 Wittinghofer, 1994, Cellular Signaling 6(3) :247-267 ;以及 Barbacid,1987，Ann. Rev. Biochem. 56，779-827。激活ras途徑中的下游元件包括(例如)B-Raf內(nèi)的突變。例如參見(jiàn) Brose et al. , 2002, Cancer Res. 62 :6997_7000。至少部分源自 ras、ras的上游元件、或ras信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的元件的激活的增生性疾病在本文中被稱為thatr ras-介導(dǎo)的增生性疾病。另外，溶瘤病毒用于治療由PKR的突變或失調(diào)引起的增生性疾病。例如參見(jiàn) Strong et al.，1998，EMBO J. 17 :3351_62。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療(treatment) ”、“治療(treat) ”、“治療(treating) ”或“改善(ameliorating) ”是指能夠減輕病癥或者狀況的作用、或者減輕病癥或者狀況的癥狀的方法。因此在公開(kāi)的方法中，治療可以是指減輕或改善已確立的病癥或者狀況的嚴(yán)重性的、或者病癥或者狀況的癥狀的10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80%、90%或100%。例如，在受試者中，與對(duì)照相比，治療癌癥的方法降低病癥的一種或多種癥狀的10%，則該方法被認(rèn)為是治療。因此，與天然的或者對(duì)照的水平相比，降低可以為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%或在10與100之間任何百分比的降低。應(yīng)理解，治療并不一定是指治愈或者完全消除病癥、狀況、或者病癥或狀況的癥狀。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)受試者可以為脊推動(dòng)物，更具體為哺乳動(dòng)物(例如，人類(lèi)、馬、豬、兔、狗、綿羊、山羊、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、牛、貓、豚鼠或嚙齒動(dòng)物)、魚(yú)類(lèi)、禽類(lèi)或爬蟲(chóng)動(dòng)物或兩棲動(dòng)物。該術(shù)語(yǔ)并不表示特定的年齡或性別。因此，成年和新生的受試者，無(wú)論雄性或雌性，都意欲包括在內(nèi)。如本文中所使用的，患者或受試者可以互換使用，并且可以是指患有病癥或疾病的受試者。術(shù)語(yǔ)患者或受試者包括人類(lèi)和獸類(lèi)受試者。本文中公開(kāi)的材料、化合物、組合物和組分可以用于所公開(kāi)的方法和組合物，可與它們結(jié)合使用，可用于制備所公開(kāi)的方法和組合物，或者是所公開(kāi)的方法的產(chǎn)物和組合物。本文中公開(kāi)這些和其他的材料,應(yīng)理解，當(dāng)公開(kāi)這些材料的組合、子集、相互作用、組等時(shí)，雖然可不明確公開(kāi)對(duì)各單獨(dú)和集合組合的具體參考以及這些化合物的排列，但是本文中都預(yù)期和描述上述內(nèi)容。例如，如果抑制劑被公開(kāi)和討論，并且可對(duì)許多分子(包括抑制劑)進(jìn)行的許多修改被討論，除非具體指出有相反含義，則具體預(yù)期了抑制劑的可能的每一個(gè)和每一種組合和排列。同樣，也具體設(shè)想并公開(kāi)了上述的任何子集和 組合。這種概念應(yīng)用于本公開(kāi)的所有方面，包括但不限于使用公開(kāi)的組合物的方法中的步驟。因此，如果可以進(jìn)行各種附加步驟，應(yīng)理解這些附加步驟的每一個(gè)步驟都可以與所公開(kāi)的方法的任何具體的方法步驟或方法步驟的組合一起進(jìn)行，并且每一個(gè)這樣的組合或組合的子集都是具體設(shè)想的并應(yīng)認(rèn)為是公開(kāi)的。在整個(gè)該申請(qǐng)中引用了多篇公開(kāi)文獻(xiàn)。這些公開(kāi)文獻(xiàn)的公開(kāi)全部通過(guò)引用的方式并入本申請(qǐng)中。許多本發(fā)明的方面已經(jīng)被描述。然而，將理解可以做出各種修改。另外，當(dāng)描述一個(gè)特征或步驟時(shí)，其可結(jié)合本文中的任何其他特征或布置，即使所述結(jié)合并未明確地闡述。因此，其他方面也在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例I.人用呼腸孤病毒、紫杉醇和卡鉬方案這是每隔3周靜脈給予呼腸孤病毒和紫杉醇與卡鉬的研究設(shè)計(jì)。以175mg/m2或200mg/m2的劑量靜脈輸注3小時(shí)來(lái)施用紫杉醇。然后以通過(guò)Calvert式計(jì)算的劑量(AUC 5mg/mL分鐘或6mg/mL分鐘，GFR通過(guò)51Cr EDTA測(cè)定)靜脈輸注30分鐘來(lái)施用卡鉬。在施用紫杉醇和卡鉬后，以IxlOw或3X101(iTCID5(i的劑量靜脈輸注I小時(shí)來(lái)施用呼腸孤病毒。在第2至5天將只施用呼腸孤病毒，使用和第I天使用的相同的劑量和方法。表2-給藥方法紫杉醇劑量卡鉑劑量呼腸孤病毒劑量
(mg/m2)AUC mg/mL min (TCID50)
__只在第I天__只在第I天__I -5天_
方法 I__175__5__IxlQ10_
方法 2__175__5__3xl01Q_
方法 3__200__6__IxIOiq_
方法 4_[200_[_6_ 3xlQ10_實(shí)施例2.呼腸孤病毒和mTOR抑制劑基于Chou 和 Talalay 的中效原理(Chou 和 Talalay, Trends Pharmacol. Sci. 4 450-454 (1983))，使用恒定比例聯(lián)合設(shè)計(jì)和聯(lián)合指數(shù)法，評(píng)價(jià)呼腸孤病毒聯(lián)合雷帕霉素對(duì)于B16. FlO細(xì)胞的影響。將細(xì)胞(5xl03/孔)接種到96孔板中并且允許貼壁過(guò)夜。將培養(yǎng)基用雷帕霉素和/或呼腸孤病毒的兩倍稀釋液代替，分別對(duì)應(yīng)于之前測(cè)定的ED50的2、1、0. 5和O. 25倍，在新鮮培養(yǎng)基中稀釋?zhuān)掷m(xù)溫育48h。然后除去培養(yǎng)基，并使用MTS測(cè)試法來(lái)測(cè)定相對(duì)于未處理的細(xì)胞的細(xì)胞存活百分率。數(shù)據(jù)使用CalcuSyn程序分析。通過(guò)在呼腸孤病毒之前或之后24小時(shí)加入雷帕霉素來(lái)評(píng)價(jià)改變順序的影響。值得注意的是，在24小時(shí)，對(duì)于呼腸孤病毒觀察到很少細(xì)胞死亡(如果有的話)。如果雷帕霉素在線給予或伴隨呼腸孤病毒給予(分別為圖Ia和Ib)，相互作用是對(duì)抗性的(聯(lián)合指數(shù)值(CIV)大于I)。只有在雷帕霉素在呼腸孤病毒之后給予時(shí)(圖Ic)，在呼腸孤病毒和雷帕霉素之間才觀察到協(xié)同性相互作用(CIV小于I)。在體內(nèi)環(huán)境中，呼腸孤病毒和雷帕霉素聯(lián)合處理降低了皮下移植的腫瘤的生長(zhǎng)，并且延長(zhǎng)了鼠的半數(shù)存活時(shí)間。將B16.F10腫瘤皮下接種到C57B1/6鼠中，并且在第I和4天用瘤內(nèi)呼腸孤病毒T3D 5xl08 TCID5tl處理，在第1、4、8和12天以5mg/kg的劑量腹腔內(nèi)給予雷帕霉素，單獨(dú)或聯(lián)合，或使用對(duì)照處理(瘤內(nèi)PBS，腹腔內(nèi)PBS)。對(duì)于各組測(cè)定各腫瘤的直徑并計(jì)算平均值。和單一試劑處理或?qū)φ仗幚硐啾?，呼腸孤病毒T3D/雷帕霉素聯(lián)合處理導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)顯著地降低(圖2A)。將存活率繪制成Kaplan-Meier曲線。對(duì)照處理的鼠的半數(shù)存活時(shí)間為7天。單獨(dú)使用雷帕霉素的半數(shù)存活時(shí)間沒(méi)有改善。單獨(dú)使用呼腸孤病毒延長(zhǎng)半數(shù)存活時(shí)間至9天。聯(lián)合處理增加存活時(shí)間至> 15天(Logrank檢驗(yàn)p = O. 0216)(圖2B)。實(shí)施例3.呼腸孤病毒、環(huán)磷酰胺(CPA)和IL-2.預(yù)處理具有Treg缺失(PC-61)和/或IL-2的C57B1/6鼠增強(qiáng)了靜脈局部遞送呼腸孤病毒至皮下，建立了 B16腫瘤(圖3)。然而，在該試驗(yàn)中使用的高劑量的呼腸孤病毒(3. 75x109TCID50)導(dǎo)致產(chǎn)生毒性。因此，PC-61或CPA(其模擬PC-61的效果)+IL_2+呼腸孤病毒的處理效果被測(cè)試，其中呼腸孤病毒的病毒劑量減至IxIO8TCID5tl/注射。在這些條件下，使用PC-61+IL-2或CPA+IL-2在這樣的水平下觀察皮下B16腫瘤的等同處理，該水平明顯好于任一種對(duì)照處理(P < O. 01 ;圖4A)。用預(yù)處理方案和靜脈呼腸孤病毒處理的鼠中均未表現(xiàn)毒性。盡管沒(méi)有觀察到毒性，然而呼腸孤病毒從用CPA+IL-2+呼腸孤病毒處理的鼠的肺部和心臟回收。這和用PC-61+IL-2+呼腸孤病毒處理的鼠相反，其中病毒只從肺部而不從心臟回收。因此，用CPA+IL-2預(yù)處理增強(qiáng)了靜脈遞送呼腸孤病毒至這樣的水平的系統(tǒng)遞送所產(chǎn)生的治療，該水平和由PC-61+IL-2誘導(dǎo)的水平?jīng)]有區(qū)別。之前表明高劑量的CPA(150mg/kg)可調(diào)節(jié)針對(duì)呼腸孤病毒的Nab的水平，從而允許重復(fù)施用病毒(Qiao et al.，Clin. Cancer Research 14:259-69(2008))。因此，盡管對(duì)于呼腸孤病毒的Nab并未表明在治療效果上具有任何抑制作用(在圖4A的病毒-幼C57B1/6鼠中觀察)，但是測(cè)試了它們的血清的Nab水平。如所期望的那樣，只用呼腸孤病毒處理的鼠的血清含有針對(duì)呼腸孤病毒的高水平的中和活性(圖4B)。用IL-2或PC-61預(yù)處理表明有在血清中增加中和活性水平的趨勢(shì)，盡管這些值非常易變。在呼腸孤病毒施用前用CPA預(yù)處理明顯地降低了該中和活性(P<0.01)，其在CPA+IL-2聯(lián)合時(shí)得以保持(圖4B)。在只用呼腸孤病毒處理的鼠中觀察到的那些，Treg缺失PC-61+IL-2的聯(lián)合維持中和水平(圖4B)。因此和IL-2+呼腸孤病毒聯(lián)合使用CPA不僅增強(qiáng)抗腫瘤治療(圖4A)，而且調(diào)節(jié)抗呼腸孤病毒抗體的水平。 概言之，這些數(shù)據(jù)表明和只用PBS/呼腸孤病毒處理的鼠相比，PC-61+IL-2使系統(tǒng)地遞送的呼腸孤病毒的瘤內(nèi)定位增加2至3個(gè)log值。這是由于在腫瘤位點(diǎn)IL-2誘導(dǎo)的血管滲漏，這增強(qiáng)了系統(tǒng)地遞送的病毒定位到建立的腫瘤中的能力。另外，數(shù)據(jù)表明CPA-介導(dǎo)的Treg修飾(IL-2和低劑量呼腸孤病毒)針對(duì)建立的腫瘤有治療性。
權(quán)利要求
1.一種在受試者中治療增生性疾病的方法，該方法包括下列步驟 (a)在所述受試者中降低間隙壓力；以及 (b)向所述受試者施用一種或多種溶瘤病毒。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中將約IO3至IO12個(gè)空斑形成単位(PFU)的所述溶瘤病毒施用至所述受試者。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中將約IO8至IO12的空斑形成單位(PFU)的所述溶瘤病毒施用至所述受試者。
4.權(quán)利要求I所述的方法，其中將約IO8至IO12的TCID5tl的所述溶瘤病毒施用至所述受試者。
5.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述步驟(a)通過(guò)向所述受試者施用降低間隙壓力的試劑來(lái)實(shí)施。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中將約5至1000mg/m2的所述降低間隙壓力的試劑施加至所述受試者。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中將約O.001-10, 000mg/kg體重的所述降低間隙壓力的試劑施加至所述受試者。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述降低間隙壓力的試劑增加血管滲透性。
9.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述降低間隙壓力的試劑是紫杉烷。
10.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述紫杉烷選自由萊龍?zhí)┧?、紫杉醇和多西他賽?gòu)成的組。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中將約40-300mg/m2的所述紫杉烷施用至所述受試者。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中將約130-225mg/m2的所述紫杉烷施用至所述受試者。
13.權(quán)利要求10所述的方法，其中將約175-200mg/m2的所述紫杉醇施用至所述受試者。
14.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述試劑選自由下列物質(zhì)構(gòu)成的組白細(xì)胞間介素-I (IL-I)、干擾素-K(IFN-K)、P物質(zhì)、蛋白酶抑制劑、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、硝化甘油、5-羥色胺、血漿激肽、血小板激活因子(PAF)、前列腺素El (PGEl)、組織胺、伊馬替尼、封閉帶毒素(ZOT)、白細(xì)胞間介素_2、一氧化氮抑制劑和人生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是N-α-甲苯磺?；?L-賴氨?；?氯甲酮(TLCK)、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)、或亮抑酶肽。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述血漿激肽是緩激肽。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述ー氧化氮抑制劑是L-N-單甲基精氨酸(L-NMMA)或L-N-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)。
18.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述(a)通過(guò)向所述受試者施用低鈣離子濃度的流體來(lái)實(shí)施。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述流體包含50Tmol/L至200Tmol/L的鈣離子濃度。
20.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述步驟(a)通過(guò)在所述增生性疾病的位點(diǎn)處或附近除去過(guò)量的間隙液來(lái)實(shí)施。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述過(guò)量的間隙液通過(guò)人工淋巴系統(tǒng)(ALS)除去。
22.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述步驟(a)通過(guò)向所述受試者施用滲透性光動(dòng)力學(xué)治療劑來(lái)實(shí)施。
23.權(quán)利要求I至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟(a)在所述步驟(b)的同吋、之前或之后實(shí)施。
24.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述降低間隙壓力的試劑在所述溶瘤病毒之前施用。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述試劑在所述溶瘤病毒之前I至12小時(shí)施用。
26.權(quán)利要求I至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述病毒以多劑量施用。
27.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述降低間隙壓力的試劑以多劑量施用。
28.權(quán)利要求5所述的方法，還包括向所述受試者施用抑制促炎細(xì)胞因子的試劑的步驟。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述試劑抑制促炎細(xì)胞因子，但不抑制或最低程度地抑制NARA的產(chǎn)生。
30.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述抑制促炎細(xì)胞因子的試劑是鉬化合物。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述鉬化合物選自由順鉬、卡鉬和奧沙利鉬構(gòu)成的組。
32.權(quán)利要求30所述的方法，其中將約5-1000mg/m2的所述鉬化合物施用至所述受試者。
33.權(quán)利要求31所述的方法，其中2至7mg/mL分鐘(AUC)的所述卡鉬施用至所述受試者。
34.權(quán)利要求31所述的方法,其中5或6mg/mL分鐘(AUC)的所述卡鉬施用至所述受試者。
35.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述降低間隙壓力的試劑是紫杉醇，所述抑制促炎細(xì)胞因子的試劑是卡鉬，并且所述溶瘤病毒是呼腸孤病毒。
36.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述降低間隙壓力的試劑首先在施用所述溶瘤病毒之前4小時(shí)的時(shí)間施用，并且其中所述抑制促炎細(xì)胞因子的試劑其次在施用所述溶瘤病毒之前I小時(shí)的時(shí)間施用。
37.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述病毒具有ー個(gè)或多個(gè)突變或缺失，以不抑制所述雙鏈RNA激活的蛋白激酶(PKR)。
38.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述溶瘤病毒選自由呼腸孤病毒、辛德畢斯病毒、Delta24、水泡性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、牛痘病毒、腦炎病毒、帯狀皰疹病毒、肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒和麻疹病毒構(gòu)成的組。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述呼腸孤病毒是哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒。
40.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述呼腸孤病毒是人類(lèi)呼腸孤病毒。
41.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述人類(lèi)呼腸孤病毒選自由血清型I呼腸孤病毒、血清型2呼腸孤病毒和血清型3呼腸孤病毒構(gòu)成的組。
42.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述人類(lèi)呼腸孤病毒是血清型3呼腸孤病毒。
43.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述呼腸孤病毒具有IDAC登陸No.190907-01。
全文摘要
本文中提供在受試者中治療增生性疾病的方法，該方法包括在受試者中降低間隙壓力和/或增加血管滲透性，以及向所述受試者施用溶瘤病毒。這些方法改善了溶瘤病毒的遞送和分布。
文檔編號(hào)A61K31/675GK102695520SQ200980119155
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者B·G·唐普森, H·潘達(dá), M·C·科菲 申請(qǐng)人:昂科利蒂克斯生物科技公司