專利名稱：用于使抗體片段結(jié)晶的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于使Fab抗體片段結(jié)晶的組合物和方法，及其用途。具體地，本發(fā)明 涉及使抗白細(xì)胞介素18(IL-18)抗體Fab片段結(jié)晶的方法。
背景技術(shù)：
目前在臨床研究2或3期中評(píng)估的單克隆抗體超過100種，單克隆抗體(mAb)市 場被視為最有希望的生物藥物市場之一。因?yàn)檫@些藥物不得不以經(jīng)常超過IOOmg的單次劑 量遞送給患者，所以迫切需要發(fā)現(xiàn)滿足穩(wěn)定性、安全性和患者順應(yīng)性的合適制劑。高度濃縮的液體mAb制劑具有比較不濃縮的制劑更高的粘度，這可以妨礙其通過 更以患者為本(patient-friendly)的高規(guī)格針(high gaugeneedle)的可注射性。此外， mAb分子聚集的趨勢(shì)隨著濃度增加而指數(shù)增加，從而阻止對(duì)安全性和穩(wěn)定性需求的順應(yīng)性。 高mAb劑量的遞送因此局限于大體積，這一般不得不經(jīng)由輸注遞送。然而，這種給藥方式是 成本密集型的并且顯著減少患者順應(yīng)性。由于這個(gè)原因，需要晶形的mAbs用于用作藥品。然而，由于與結(jié)晶條件相關(guān)的不 可預(yù)知性，對(duì)于評(píng)價(jià)這種策略進(jìn)行了很少嘗試。盡管蛋白質(zhì)胰島素已成功結(jié)晶，但大多數(shù)其 他蛋白質(zhì)趨于形成無序沉淀而不是晶體。測定關(guān)于具體蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件因此不是無價(jià)值 的工作。迄今為止，不存在允許人們可靠預(yù)測關(guān)于目的蛋白質(zhì)的成功結(jié)晶條件的基本原則。幾種篩選系統(tǒng)是商購可得的(例如，Hampton 1和2，Wizard I和II)，其允許在微 升規(guī)模上篩選關(guān)于特定蛋白質(zhì)的潛在合適的結(jié)晶條件。然而，使用此種篩選系統(tǒng)獲得的陽 性結(jié)果不一定在更大的工業(yè)可應(yīng)用的分批規(guī)模上轉(zhuǎn)化為成功結(jié)晶(參見Jen等人O001) Pharm. Res. 18(11) :1483)。Baldock 等人((1996) J. Crystal Growth, 168(1-4) :170-174)報(bào)告了關(guān)于微批處 理(micrcAatch)和蒸汽擴(kuò)散用于結(jié)晶條件的起始篩選的比較。6種商購可得的蛋白質(zhì)使 用一組結(jié)晶溶液進(jìn)行篩選。篩選使用常見的蒸汽擴(kuò)散法和微批處理結(jié)晶法的3種變體來執(zhí) 行。在鑒定的58種結(jié)晶條件中，43種(74%)由微批處理得到鑒定，而41種(71%)由蒸 汽擴(kuò)散得到鑒定。26種條件通過2種方法都得到鑒定，并且如果根本未使用微批處理，那么 17種( %)將已錯(cuò)過。這些數(shù)據(jù)顯示在起始結(jié)晶篩選中最常用的蒸汽擴(kuò)散技術(shù)不保證陽 性結(jié)果。因此，不同蛋白質(zhì)的結(jié)晶無法使用限定方法或算法成功執(zhí)行。當(dāng)然，在過去 20-30年中已存在技術(shù)進(jìn)步。例如，A. McPherson提供了關(guān)于用于使大分子結(jié)晶的戰(zhàn)術(shù)、 策略、試劑和設(shè)備的廣泛細(xì)節(jié)。然而，他沒有提供確保任何給定大分子都可以真正地通 過技術(shù)人員以合理成功預(yù)期結(jié)晶的方法。例如，McPherson陳述“無論什么程序，在改 進(jìn)且最佳化系統(tǒng)參數(shù)(溶劑和溶質(zhì)兩者)方面必須不遺余力，以支持且促進(jìn)分子之間的 特定鍵合相互作用且在它們一形成就使其穩(wěn)定。這個(gè)問題的后一方面一般依賴于待結(jié) 晶的具體蛋白質(zhì)或核酸的特定化學(xué)和物理性質(zhì)”。(McPherson (1999) CrystalIization of BioIogicalMacromolecules.Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring HarborLaboratory I^ress，第159頁)。蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛公認(rèn)的是，不存在獲
5得新目的蛋白質(zhì)、應(yīng)用特定過程步驟、且因此獲得所需晶體的算法。由于分子的柔性，抗體特別難以結(jié)晶。然而，免疫球蛋白晶體的例子的確存在， 例如本斯-瓊斯(Bence Jones)蛋白質(zhì)，其是異常Ig輕鏈二聚體的晶體(J0neS(1848) Philosophical Transactions of the RoyalSociety, London,138 :55-62)。 此夕卜，Ig 重鏈寡聚體(von Bonsdorf 等人(1938). Folia Haematologia 59 :184-208)和正常結(jié) 構(gòu)的人免疫球蛋白0條重鏈與2條輕鏈連接)的晶體也已得到描述(Putnam(1955) Science 122 :275-7 ；Terry 等人(1968)Nature 220(164) :239-41 ；Huber 等人(1976) Nature 264(5585) :415-20 ；Rajan 等人(1983)Mol. Immuno 120 (7) :787-99 ；Harris 等人 (1992)Nature 360(6402) :369_72，Nisonoff 等人(1968) Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. 32 :89-93 ;Connell 等人(1973)Canad. J. Biochem. 51 (8) :1137-41 ；Mills 等人(1983) Annals of Int. Med 99(5) :601-4 ；和 Jentoft 等人(1982) Biochem. 21(2) 289-2940例如，Margolin和同事報(bào)告治療用單克隆抗體司徒曼布(Herceptin )可 以進(jìn)行結(jié)晶(Shenoy，等人2002)，并且結(jié)晶司徒曼布懸浮液在小鼠腫瘤模型中在治療 上有效，因此證實(shí)通過結(jié)晶司徒曼布保留生物活性(Yang等人(2003)Proc. Natl. Acad. Scil00(12) :6934-6939)。然而，形成均質(zhì)抗體晶體制劑的可預(yù)測和可靠方法仍未得到描 述。W0-A-02/072636公開了整個(gè)、完整的抗體利妥?，?、英夫單抗和司徒曼布的結(jié)晶。 大多數(shù)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)用具有不明確毒性的化學(xué)制品來執(zhí)行，所述化學(xué)制品例如咪唑、2-環(huán)己 基-乙磺酸酯(CHEQ、甲基戊二醇、硫酸銅和2-嗎啉基-乙磺酸酯(MEQ。在那個(gè)申請(qǐng)中 的許多例子使用晶種以起始結(jié)晶。W0-A-2004/009776公開了抗人TNF α抗體D2E7或一般地阿達(dá)木單抗 (Adalimumab )的晶體，目前在商品名稱HUMIRA 下出售。該申請(qǐng)公開了使用坐滴 (sitting drop)蒸汽擴(kuò)散技術(shù)在微升規(guī)模上的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，其涉及使等量微小體積(Iyl) 的不同結(jié)晶緩沖液和D2E7 F(ab)' 2或Fab片段混合。EP-A-O 260 610公開了一系列鼠類抗hTNF α單克隆抗體，即中和抗體ΑΜ-195，也 指定為ΜΑΚ195，如由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的，作為ECACC 87050801保藏。該抗體的F(ab' )2 片段也在名稱阿非莫單抗TM(Afelim0mabTM)下已知。美國專利申請(qǐng)系列號(hào)60/963,964描述了用于制備批量鼠類抗TNFa抗體 F(ab' )2 片段(例如，MAK-195，Abbott Laboratories)的結(jié)晶條件。美國專利申請(qǐng)系列號(hào)11/977，677描述了關(guān)于人抗TNFa抗體(例如，Humira, Abbott Laboratories)的結(jié)晶條件。美國專利申請(qǐng)系列號(hào)60/920，608描述了關(guān)于人抗IL-12抗體(例如，ABT-874, Abbott Laboratories)的結(jié)晶條件。美國專利申請(qǐng)系列號(hào)09/780，035和10/988，360描述了與白細(xì)胞介素18結(jié)合的 抗體(ABT-325，Abbott Laboratories)，其在治療多種炎性疾病中有用。然而，目前，不存 在提供用于產(chǎn)生抗IL-18抗體或抗IL-ISFab片段晶體的可用技術(shù)教導(dǎo)。因此存在關(guān)于提 供抗IL-18抗體或抗IL-ISFab片段晶體的合適結(jié)晶條件的需要。發(fā)明概述令人驚訝地，上述問題通過本發(fā)明得以解決，本發(fā)明提供了結(jié)晶方法和由此產(chǎn)生
6的晶體、及其用途。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備抗體Fab片段的晶體的方法，該方法包括步驟(a) 獲得Fab片段；(b)使Fab片段與儲(chǔ)庫溶液(reservoirsolution)混合，以制備結(jié)晶混合物， 所述儲(chǔ)庫溶液包括(i)聚乙二醇(PEG)和(ii)緩沖液；和(c)將結(jié)晶混合物置于表面上 直至晶體形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG是在結(jié)晶混合物中約5至20%的濃度的PEG400、 PEG4000或PEG6000。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液是在約4至約11的pH下的HEPES、CAPS、 Tris、二甲胂酸鹽、MES、檸檬酸鹽、bis-tris、磷酸鹽、CHES, MOPS、咪唑、乙酸鹽、N- 二 [羥 乙基]甘氨酸或檸檬酸鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，HEPES緩沖液在約pH7. 5下。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，CAPS緩沖液在約ρΗΙΟ. 5下。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，Tris緩沖液在約pH8. 5下。在一個(gè)實(shí)施方案中，儲(chǔ)庫選自硅化處理的載玻片和坐滴盤。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法在約0°C至約25°C，例如約4°C或約18°C下執(zhí)行。根據(jù)本發(fā)明的方法，將結(jié)晶混合物置于表面上約1至7天以形成晶體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，儲(chǔ)庫溶液進(jìn)一步包括約2至約40%，優(yōu)選約5%濃 度的2，4-甲基戊二醇。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，儲(chǔ)庫溶液進(jìn)一步包括約100至約500mM濃度的磺 基甜菜堿201。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，儲(chǔ)庫溶液進(jìn)一步包括約50至約500mM濃度，優(yōu)選 約 200mM 的 MgCl2。本發(fā)明的方法在使Fab片段結(jié)晶中有用，例如人或非人Fab，例如小鼠Fab，例如與 人或非人IL-18結(jié)合的抗體的Fab片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，IL-18是其中所有半胱氨酸 殘基都突變成丙氨酸殘基的突變IL-18。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了例如與人或非人IL-18結(jié)合的Fab片段的分離的晶 體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括與人或非人IL-18結(jié)合的Fab片段的分離的共晶 (co-crystal)。Fab片段是人或非人的，例如抗體例如125-2H的小鼠Fab片段，或抗體例如 ABT-325的人Fab片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，IL-18是其中所有半胱氨酸殘基都突變成丙氨 酸殘基的突變IL-18。在一個(gè)實(shí)施方案中，ABT_325Fab片段的分離的晶體包括輕鏈序列SEQ ID NO :1和 重鏈序列SEQ ID NO :2。在一個(gè)實(shí)施方案中，ABT-325Fab片段與選自SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的IL-18氨基酸序列結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ABT-325Fab片段與具有選自Asp59-Asp76(SEQ ID NO 7) 和Glul64-Leul69(SEQ ID NO 8)的氨基酸序列的至少一種IL-18肽，或其具有一種或多種 氨基酸取代的類似物結(jié)合，其中IL-18的類似物與抗體ABT-325結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供了包括單克隆抗體125-2H的Fab片段的分離的晶體，其中125-2H Fab片段 包括SEQ ID NO 9的輕鏈序列和SEQ ID NO 10的重鏈序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，125-2H Fab片段與具有選自Lys 176_Argl83 (SEQ ID NO: 5)和Argl40-Lysl48(SEQ ID NO :6)的氨基酸序列的至少一種IL-18肽，或其具有一種或 多種氨基酸取代的類似物結(jié)合，其中類似物與抗體125-2H結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供了用于產(chǎn)生包括與人IL-18結(jié)合的125-2H Fab片段的共晶的方法和組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的分離的晶體的藥物組合物。
附圖簡述本發(fā)明的前述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)以及本發(fā)明自身根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案的下述 描述將得到更全面理解，所述優(yōu)選實(shí)施方案連同附圖一起閱讀，其中

圖1.在IOX放大率下的ABT-325晶體。圖2.在IOX放大率下的125-2H晶體。圖3.在IOX放大率下的125-2H/IL-18共晶。圖4. IL-18嵌合體幫助限定結(jié)合表位。(a)人IL-18和4種人(N末端)/鼠類(C 末端)嵌合體。(b)鼠類IL-18和4種鼠類(N末端)/人(C末端)嵌合體。人序列顯示為 白框，鼠類序列是黑色的。對(duì)于每種嵌合體指出了殘基范圍、在胱天蛋白酶-ι切割后的第 一個(gè)成熟IL-18殘基(藍(lán)色三角)和附加表位。ND 未測試。發(fā)明詳述“使得抗體晶體能夠形成的條件”意指在不攪動(dòng)條件下導(dǎo)致晶體形成的任何溶液 條件。這意指提供包含抗體分子和至少一種結(jié)晶試劑的溶液，所述結(jié)晶試劑的濃度足以在 給定條件例如混合物的PH和溫度下起始晶體形成?！拔⑿∫?guī)模結(jié)晶法”意指其中結(jié)晶混合物的體積在0. 1 μ L禾Π 10 μ L之間的任何結(jié) 晶法，尤其是使得蒸汽擴(kuò)散在結(jié)晶過程中能夠開始生效的任何方法。例如，基于蒸汽擴(kuò)散的 方法包括步驟加入微升范圍的小體積抗體溶液與包含結(jié)晶試劑的儲(chǔ)庫緩沖液，將混合物 的小滴置于與儲(chǔ)庫緩沖液的等分試樣鄰近的密閉容器中，允許小滴和儲(chǔ)庫之間通過蒸汽擴(kuò) 散的溶劑交換，在這個(gè)過程中小滴中的溶劑含量改變，并且如果達(dá)到合適的結(jié)晶條件，那么 可以觀察到結(jié)晶。“結(jié)晶試劑”是支持、增強(qiáng)或促進(jìn)抗體的晶體形成的試劑?！敖Y(jié)晶溶液”包含溶解形式的結(jié)晶試劑。優(yōu)選地，結(jié)晶溶液是水系統(tǒng)，即其液體組成 成分占優(yōu)勢(shì)地由水組成。例如，80至IOOwt.-%、或95至100wt-%、或98至IOOwt.可 以是水。當(dāng)用于通過蒸汽擴(kuò)散技術(shù)的微小規(guī)模結(jié)晶時(shí)，術(shù)語“儲(chǔ)庫溶液”也指“結(jié)晶溶液”?！敖Y(jié)晶混合物”包含抗體或其片段的水溶液和結(jié)晶溶液或儲(chǔ)庫溶液?！熬w”是物質(zhì)例如蛋白質(zhì)的一種固態(tài)形式，其不同于第二種固體形式，即非晶形 狀態(tài)，其基本上作為無定形的異質(zhì)固體存在。晶體具有規(guī)則的三維結(jié)構(gòu)，一般稱為晶格?？?體晶體包括抗體分子的規(guī)則三維陣列。(參見Giege等人，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach,第 2 版，第 1-16 頁，Oxford University Press, NewYork(1999))?！罢麄€(gè)”或“完整”抗體是在體外和/或體內(nèi)能夠識(shí)別其抗原且與其抗原結(jié)合的功 能抗體，所述抗原例如IL-18。抗體可以起始和抗體與其抗原結(jié)合相關(guān)的患者的后續(xù)免疫系 統(tǒng)反應(yīng)，特別是直接細(xì)胞毒性、依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)和依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。 抗體分子一般具有由彼此共價(jià)結(jié)合的2條等同重鏈(MW各約50kDa)和各自與重鏈之一共 價(jià)結(jié)合的2條等同輕鏈(MW各約25kDa)組成的結(jié)構(gòu)。4條鏈以標(biāo)準(zhǔn)“Y”基序排列。每條 重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu) 域——CHU CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒 定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由1個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步再分成稱為互補(bǔ)性，點(diǎn)綴著稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域。每個(gè)VH和VL—般由3個(gè) CDRs和4個(gè)FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下述順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 ⑶R3、FR4。完整抗體分子具有2個(gè)抗原結(jié)合部位，即是“二價(jià)的”。2個(gè)抗原結(jié)合部位對(duì)于 1種IL-18抗原特異，即抗體是“單特異性的”。上述結(jié)構(gòu)在不同物種中可以改變?！皢慰寺】贵w”是衍生自B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)的單個(gè)克隆并且識(shí)別相同抗原決定 簇的抗體。整個(gè)單克隆抗體是具有上述標(biāo)準(zhǔn)分子結(jié)構(gòu)的那些，其包括2條完整重鏈和2條 完整輕鏈。單克隆抗體這樣常規(guī)生產(chǎn)使抗體產(chǎn)生性B細(xì)胞與無限增殖骨髓瘤細(xì)胞融合，以 產(chǎn)生B細(xì)胞雜交瘤，其在細(xì)胞培養(yǎng)中持續(xù)產(chǎn)生單克隆抗體。其他生產(chǎn)方法是可用的，如例如 使用噬菌體展示技術(shù)、酵母展示技術(shù)或RNA展示技術(shù)在細(xì)菌、酵母、昆蟲、真核生物或哺乳 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)單克隆抗體；或在基因修飾動(dòng)物例如牛、山羊、豬、兔、雞或轉(zhuǎn)基因小鼠 中體內(nèi)產(chǎn)生，所述基因修飾動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因小鼠已進(jìn)行修飾以包含且表達(dá)完整人B細(xì)胞基因 組；或在基因修飾植物例如煙草和玉米中產(chǎn)生。來自所有此種來源的抗體或片段可以根據(jù) 本發(fā)明進(jìn)行結(jié)晶。待根據(jù)本發(fā)明結(jié)晶的單克隆抗體包括“嵌合”抗體，其中重和/或輕鏈的部分與衍 生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列等同或同源，而一條或多條 鏈的其余部分與衍生自另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列等 同或同源。小鼠/人嵌合體的例子包含鼠類抗體的可變抗原結(jié)合部分和衍生自人抗體的恒 定部分。非人(例如鼠類)抗體的“人源化”形式也由本發(fā)明包括。這些是包含衍生自非 人免疫球蛋白的最低限度序列的嵌合抗體。對(duì)于大部分，人源化抗體是人免疫球蛋白，其中 來自人免疫球蛋白的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)或高變環(huán)(HVL)的殘基由具有所需功能性的來自 非人物種(例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動(dòng)物)的CDR或HVL的殘基替換。人免疫球蛋 白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基可以由相應(yīng)非人殘基替換，以改善抗原結(jié)合親和力。此外，人源化抗 體可以包括在相應(yīng)人或非人抗體部分中都未發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾可能是必需的，以進(jìn)一 步改善抗體功效?！叭丝贵w”或“全人抗體”是具有這樣的氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列與由人 產(chǎn)生的抗體或重組產(chǎn)生的那種對(duì)應(yīng)。如本文所使用的，術(shù)語“人抗體”意欲包括具有衍生自 人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人種系免疫 球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，在體外通過隨機(jī)或位點(diǎn)專一誘變或在體內(nèi)通過體細(xì) 胞突變引入的突變)，例如，在CDRs且特別是CDR3中。然而，如本文所使用的，術(shù)語“人抗 體”不意欲包括其中衍生自另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種例如小鼠的種系的CDR序列已嫁接到人構(gòu) 架序列上的抗體。如本文所使用的，術(shù)語“重組人抗體”意欲包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或 分離的所有人抗體，例如使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體，從重組、組合 人抗體文庫中分離的抗體，從對(duì)于人免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物(例如小鼠)中分離 的抗體(參見例如，Taylor等人(1992) Nucl. Acids Res. 20 :6觀7_6295)，或通過任何其他 方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，所述任何其他方法涉及人免疫球蛋白基因序列與其他 DNA序列的剪接。此種重組人抗體具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)。然 而，在特定實(shí)施方案中，對(duì)此種重組人抗體實(shí)施體外誘變(或當(dāng)使用對(duì)于人Ig序列轉(zhuǎn)基因
9的動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列， 盡管其衍生自人種系VH和VL序列且與其相關(guān)，但可能在體內(nèi)不天然存在于人抗體種系譜 (repertoire)內(nèi)。如本文所使用的，“中和抗體”(或“中和IL-18活性的抗體”)意指其與IL-18的 結(jié)合導(dǎo)致IL-18生物活性的抑制的抗體?！坝H和力成熟的”抗體是在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)中具有一種或多種改變的抗體，這 導(dǎo)致與親本抗體相比較，抗體對(duì)于抗原的親和力中的改善。親和力成熟的抗體對(duì)于靶抗原 具有納摩爾或甚至皮摩爾的親和力值。親和力成熟的抗體通過本領(lǐng)域已知的程序產(chǎn)生。 Marks等人(1992)Bio/technology 10 :779-783描述了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和 力成熟。CDR和/或構(gòu)架殘基的隨機(jī)誘變?cè)贐arbas等人(1994)Proc. Nat. Acad. Sci USA 91 :3809-3813 ；Scier 等人(1995) Gene 169 :147-155 ；Yelton 等人(1995) J. Immunol. 155 1994-2004 Jackson 等人(1995) J. Immunol. 154(7) :3310-9 ；和 Hawkins 等人(1992) J. Mol Biol. 226 :889-896 中描述。如本文所使用的，“分離的抗體”意指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗 體的抗體(例如，特異性結(jié)合IL-18的分離的抗體基本上不含特異性結(jié)合除IL-18外的抗 原的抗體)。然而，特異性結(jié)合IL-18的分離的抗體可以與其他抗原例如來自其他物種的 IL-18分子具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)制
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ΡΠ O如根據(jù)本發(fā)明結(jié)晶的特定“親本”抗體的“功能等價(jià)物”是這樣的，其顯示相同抗 原特異性，但在氨基酸水平或糖基化水平上與“親本”抗體的分子組成不同。然而，差異可 以僅僅是這樣的，從而使得結(jié)晶條件不偏離如本文所公開的參數(shù)范圍?？贵w晶體的“被囊化(encapsulation) ”指其中晶體通過至少一層包衣材料個(gè)別包 被的制劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此種包被的晶體可以具有持續(xù)溶解速率?？贵w晶體的“包埋”指其中可以是被囊化或未被囊化的晶體以分散方式摻入固體、 液體或半固體載體內(nèi)的制劑。此種包埋的結(jié)晶抗體分子可以以受控的持續(xù)方式從載體中釋 放或溶解。“聚烷撐多元醇類型的結(jié)晶試劑”在下文更詳細(xì)地定義。如根據(jù)本發(fā)明使用的，“聚烷撐多元醇”是直鏈或支鏈特別是直鏈聚C2-C6烷撐多 元醇。聚醚由至少一種類型的多功能脂族醇形成，所述脂族醇攜帶2至6、2至4且特別是2 或3個(gè)優(yōu)選地鄰位羥基，并且具有2至6，特別是2、3或4個(gè)碳原子，優(yōu)選形成線性碳主鏈。 非限制性例子是1，2-乙二醇(乙二醇)、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、以及1，3-正丁二醇和 1，4_正丁二醇。特別優(yōu)選的二醇是乙二醇。術(shù)語“聚烷撐多元醇”也包括其衍生物。非限制性例子是烷基酯和醚，特別是單烷 基醚和二烷基醚。“烷基”特別定義為直鏈或支鏈C1-C6烷基殘基，特別是甲基，乙基，正或異 丙基，正、異、仲或者(Oder)叔丁基，正或異戊基；和正己基。如根據(jù)本發(fā)明使用的，聚烷撐多元醇特別是聚烷撐二醇通過廣泛范圍的分子量進(jìn) 一步表征。分子量范圍陳述為數(shù)目或重量平均分子量，一般為約400至約10，000g/mol，如 例如約 1，000 至約 8，000g/mol、或約 2，000 至約 6，000g/mol、約 3，000 至約 6，000g/mol 或 約 3，200 至約 6，000g/mol，如例如約 3，350 至約 6，000g/mol、約 3，350 至約 5000g/mol、或約 3，800 至約 4，200g/mol，特別是約 4，000g/mol。特別優(yōu)選的聚烷撐多元醇是聚乙二醇(PEGs)和聚丙二醇(PPGs)和相應(yīng)無規(guī)或 嵌段共聚物。合適多元醇的具體例子是PEG 400, PEG2,000 ；PEG 3, 000 ；PEG 3, 350 ；PEG 4，000 ；PEG 5，000 ；和 PEG 6，000。結(jié)晶混合物中的聚烷撐多元醇濃度特別是PEG濃度是約5至約30% (w/v)，如例 如約7至約15% (w/v)、或約9至約16% (w/v)、或約9至約14% (w/v)、或約9至約12% (w/v)。優(yōu)選地，具有約4，000的平均分子量的PEG以在結(jié)晶混合物中在一步過程中約9至 約12% (w/v)或在多步過程中約10至約16% (w/v)的濃度使用。本發(fā)明的聚烷撐多元醇可以由一種單一類型的多元醇或至少2種不同多元醇的 混合物組成，其可以是無規(guī)聚合的或可以作為嵌段共聚物存在。白細(xì)胞介素-18(IL_18)白細(xì)胞介素(IL)-IS是促炎細(xì)胞因子，其參與先天和獲得性免疫的調(diào)節(jié)(Okamura 等人(1995) Nature 378 :88 ；Nakanishi 等人 Q001)Annu. Rev. Immunol. 19 :423)。IL-18 單 獨(dú)或與IL-12協(xié)同作用，以擴(kuò)大促炎和細(xì)胞毒性介質(zhì)例如干擾素(IFN)-Y的誘導(dǎo)。例如，在 IL-18敲除小鼠中，盡管存在IL-12，但I(xiàn)FN- γ和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的水平減少。IL-18活性的 抑制在幾種自身免疫疾病動(dòng)物模型中是有利的，例如膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(Plater-Zyberk， 等人(2001) J Clin. Invest. 108 1825)和結(jié)腸炎(Siegmund 等人(2001)Am. J. Physiol. Regul. Integr· Comp. Physiol. 281 :R1264)。此外，IL-18 表達(dá)通過人自身免疫疾病中 現(xiàn)有的慢性炎癥狀態(tài)急劇增加，所述人自身免疫疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Yamamura 等人 QOODArthritis Rheum 44 :275)、多發(fā)性硬化(Losy 等人 Q001)Acta Neurol. Scand. 104 :171 ；Karni 等人 Q002) J. Neuroimmunol. 125 :134)和 Crohn 氏病(Ludwiczek 等人(2005)Eur. Cytokine Netw. 16 :27)。這些觀察暗示IL-18的阻斷可能是有用的人治 療方式(Bombardieri 等人 Q007)Expert Opin. Biol. Ther. 7 :31)。盡管與IL-I細(xì)胞因子家族的功能分歧，但I(xiàn)L-18與IL-I共享許多相似性。首 先，人IL-18作為生物學(xué)上無活性的M-kDa前體合成。如同IL-I β，IL-18在胱天蛋白 酶-1(和可能地其他蛋白酶)切割后被激活且分泌，所述切割產(chǎn)生成熟的18-kDa多肽。 盡管與IL-I β的低序列同源性(17%)，但I(xiàn)L-18的三維結(jié)構(gòu)緊密類似IL-I β β-三葉 草折疊，如由近期IL-18NMR結(jié)構(gòu)測定顯示的(Kato等人(2003)Nat. Struct. Biol. 10 966)。IL-I和IL-18受體也是同源的JL-18與單獨(dú)的IL_18Ra鏈或異二聚的IL_18Ra / β受體復(fù)合物結(jié)合。IL-18以 20ηΜ的親和力與IL-ISRa結(jié)合，但發(fā)信號(hào)僅在高親和 力(0. 2nM) IL-18Ra /IL-18/IL-18Rβ 三元復(fù)合物形成后發(fā)生(Yoshimoto 等人(1998) J Immunol. 161 :3400 ；Azam 等人 Q003) J. Immunol. 171 :6574)。表面突變分析已鑒定了關(guān)于 IL-18與IL-18Ra結(jié)合的2個(gè)位點(diǎn)，這類似于在IL_1 β/IL-1R α 二元復(fù)合物中觀察到的那 些(Vigers等人(1997) Nature 386 190)，以及對(duì)于與IL-18R β結(jié)合重要的1個(gè)位點(diǎn)(Kato 等人(2003) Nat. Struct. Biol. 10 :966)。在近期研究中，有效的(0. 5nM) IL-18中和鼠類單克隆抗體(mAb) 125-2H抑制 IL-18與單獨(dú)的IL-ISRa結(jié)合，但不抑制與異二聚的IL-18R α / β受體復(fù)合物結(jié)合，盡管致 使與IL-18的三元復(fù)合物無功能(Wu等人(2003) J Immunol. 170 :5571)。關(guān)于125-2H的 罕見性質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)仍不明了 ；該作者提示IL-ISRa中的構(gòu)象變化在IL-ISRa/β受體形
11成后發(fā)生，從而改變與125-2H的相互作用(Wu等人(2003) J Immunol. 170 :5571)。方法和組合物在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了關(guān)于人和非人抗體Fab片段例如抗IL-ISFab片段的晶 體和結(jié)晶條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了全人mAb，ABT-325的Fab片段的晶體， 所述ABT-325結(jié)合獨(dú)特的IL-18表位，如通過生物化學(xué)研究證實(shí)的，由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。 ABT-325正進(jìn)入臨床試驗(yàn)用于多種自身免疫疾病適應(yīng)癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的小鼠抗IL-18抗 體125-2H Fab片段的晶體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括與抗IL-18 125-2H Fab片段結(jié)合的人IL-18的晶體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在使得Fab片段晶體能夠形成的條件下，通過提供 包括Fab片段和儲(chǔ)庫溶液的含水結(jié)晶混合物，用于制備抗體Fab片段晶體的方法，所述儲(chǔ)庫 溶液包括至少一種結(jié)晶試劑。通過將溶液形式或作為固體的結(jié)晶試劑加入包括Fab片段的 儲(chǔ)庫溶液或結(jié)晶溶液中，獲得結(jié)晶混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ab片段是IgG抗體例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體的片 段?？贵w片段可以是多克隆抗體Fab片段或單克隆抗體Fab片段，例如嵌合或非嵌合抗體、 人源化抗體、雙重特異性抗體、雙重可變結(jié)構(gòu)域抗體、非糖基化抗體、人抗體、非人例如小鼠 抗體。在具體實(shí)施方案中，待結(jié)晶的抗體Fab片段是任選進(jìn)一步加工以用于改善抗原結(jié)合 的非嵌合的人抗體Fab片段，或其片段。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于使抗IL-ISFab片段結(jié)晶的結(jié)晶方法，其通過下 述實(shí)現(xiàn)提供包括在儲(chǔ)庫溶液中的Fab片段(例如，以溶解形式)的含水結(jié)晶混合物，所述 儲(chǔ)庫溶液包括至少一種聚烷撐或聚亞乙基多元醇例如聚烷撐或聚乙二醇作為結(jié)晶試劑；并 且使含水結(jié)晶混合物溫育直至形成Fab片段的晶體；其中聚烷撐或聚乙二醇(a)在一個(gè) 步驟中或(b)在超過一個(gè)步驟中提供，其中在步驟中形成的抗體晶體在下一個(gè)步驟前不取 出ο在本發(fā)明的ABT-325結(jié)晶法的一個(gè)實(shí)施方案中，含水結(jié)晶混合物的pH為約pH 8. 5 至約12. 0，特別是約9至約11. 5、或約9. 5至約11. 0、或約10. 0至約10. 5，例如約7. 5。在本發(fā)明的125-2H結(jié)晶法的一個(gè)實(shí)施方案中，含水結(jié)晶混合物的pH為約pH 5. 5 至約9，特別是約6至約8. 5、或約6. 5至約8、或約7. 0至約7. 5，例如約7. 5。在本發(fā)明的125-2H/IL-18復(fù)合物結(jié)晶法的一個(gè)實(shí)施方案中，含水結(jié)晶混合物的 pH為約pH 4. 0至約11、約pH 6. 5至約10. 5，特別是約7至約10、或約7. 5至約9. 5、或約 8至約8. 5，例如約8. 5。儲(chǔ)庫溶液和結(jié)晶溶液都可以是但不必須是緩沖的。原始儲(chǔ)庫溶液中的結(jié)晶試劑 濃度和緩沖劑體積摩爾濃度通常高于在結(jié)晶混合物中，因?yàn)楫?dāng)加入蛋白質(zhì)溶液時(shí)它被稀 釋。在一個(gè)實(shí)施方案中，含水結(jié)晶混合物可以包含至少一種緩沖劑。緩沖劑可以例如包括 乙酸鹽和或檸檬酸鹽組分，或其堿金屬鹽，如例如鈉或鉀鹽，特別地，乙酸鈉和/或檸檬酸 鈉。鹽通過加入酸特別是乙酸或檸檬酸而調(diào)整至所需pH。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖劑例如 是 HEPES、MES、N-二 [羥乙基]甘氨酸、CAPS 或 Tris。在結(jié)晶法的一個(gè)實(shí)施方案中，含水結(jié)晶混合物中的緩沖劑濃度是約0至約0. 5M、 或約0. 05至約0. 400M,如例如約0. 075至約0. 300M、或約0. 200M。
12
在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG在含水結(jié)晶混合物中具有約400至約20，000g/mol的平 均分子量。例如，PEG在結(jié)晶混合物中以約2至約50(w/v)總體積的終濃度存在，約5至約 40%、約10至約30%、約15至約20%，例如約5或約15%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，滿足下述另外結(jié)晶條件中的至少一種(1)溫育執(zhí)行約1小 時(shí)至約30天、或約1/2天至約20天或約1天至約10天，例如約1天至約5天、或約2天 至約3天；⑵溫育在約0°C和約+25°C之間，例如約4°C或約18°C下執(zhí)行；和(3)結(jié)晶混 合物包括以下述濃度的Fab片段約0. 5至約200mg/ml、或約1至約150mg/ml或約2至約 100mg/ml，例如約3. 0至約50mg/ml，特別是約5. 0至約10mg/ml。蛋白質(zhì)濃度可以根據(jù)用 于蛋白質(zhì)測定的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行測定，例如通過測量在合適波長如例如^Onm下的光密度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使產(chǎn)生的晶體干燥的步驟。合適的干燥 法包括蒸發(fā)干燥、噴霧干燥、凍干、真空干燥、流化床干燥、噴霧冷凍干燥、近臨界干燥、超臨 界干燥和氮?dú)飧稍?。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)晶法進(jìn)一步包括例如通過離心、滲濾、超濾或 其他常用緩沖液更換技術(shù)，使結(jié)晶母液與不同液體或緩沖液、或其混合物交換的步驟，所述 不同液體或緩沖液例如包含至少一種聚烷撐多元醇的液體或緩沖液，所述聚烷撐多元醇不 同于用于結(jié)晶的那種，且具有約300至約8，000道爾頓的分子量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣形成ABT_325Fab晶體通過溫育與2 μ L儲(chǔ)庫溶液混合 的在冰上解凍的2 μ L ( 20mg/mL)，所述儲(chǔ)庫溶液由25-30 %聚乙二醇(PEG) 400、1 OOmM CAPS, pH 10. 5組成，并且在4°C下在儲(chǔ)庫上懸浮。桿狀晶體在1天內(nèi)出現(xiàn)。使用纖維環(huán)直 接從其母液中收獲ABT-325 Fab的晶體。隨后通過投入液氮內(nèi)使晶體急驟冷卻并且貯藏于 液氮冰箱中。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣形成125- Fab晶體通過溫育與2 μ L儲(chǔ)庫溶液 混合的在冰上解凍的2 μ L 125-2Η Fab原液( 13mg/mL)，所述儲(chǔ)庫溶液由10%聚乙二醇 (PEG) 6000UOOmM HEPES，pH 7. 5,5% 2,4-甲基戊二醇組成，并且在4°C下在儲(chǔ)庫(硅化處 理的玻璃蓋玻片)上懸浮。桿狀晶體在1天內(nèi)出現(xiàn)。分別在母液+20%丙二醇或25%丙三 醇中收獲125-2H Fab的晶體。隨后通過投入液氮內(nèi)使晶體急驟冷卻并且貯藏于液氮冰箱 中。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣形成IL-18/125-2H Fab共晶通過溫育與1. 8μ L 儲(chǔ)庫溶液和0. 3 μ L 300mM磺基甜菜堿201混合的在冰上解凍的1. 5 μ L IL-18/125-2H Fab 復(fù)合物原液( 20mg/mL)，所述儲(chǔ)庫溶液由 30% PEG 4000、IOOmM Tris, pH 8. 5,0. 2M MgCl2)組成。混合物在18°C下在儲(chǔ)庫(硅化處理的玻璃蓋玻片)上懸浮。桿狀晶體在1周 內(nèi)出現(xiàn)。分別在母液+20%丙二醇或25%丙三醇中收獲IL-18/125-2H Fab復(fù)合物的晶體。 隨后通過投入液氮內(nèi)使晶體急聚冷卻并且貯藏于液氮冰箱中。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了例如抗IL-ISFab片段的晶體、和抗IL-18/IL-18復(fù) 合物的共晶，如通過本文限定的任何方法制備的。在一個(gè)實(shí)施方案中，晶體具有針的形狀。例如，本發(fā)明的晶體的特征可以在于針狀 形態(tài)，具有約2至約500 μ m或約100至約300 μ m的最大長度(1)和約1至約100的長度 /直徑(1/d)比。此種針狀晶體的高度大致是直徑的尺寸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括下述的藥物組合物(a)根據(jù)本文限定的方法制備的抗體或抗體片段的晶體；和(b)穩(wěn)定維持抗體晶體的至少一種藥學(xué)賦形劑；其中組 合物作為固體、半固體或液體制劑提供。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括下述的藥 物組合物(a)根據(jù)本文限定的方法制備的抗體的晶體；和(b)至少一種藥學(xué)賦形劑，其中 賦形劑包埋或包封晶體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體以超過約lmg/ml的濃度存在。在具體實(shí)施方案中，抗 體以超過約200mg/ml的濃度存在，例如約200至約600mg/ml、或約300至約500mg/ml。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是包括約0. 1至約9. 9% (w/w)抗體晶體的固體。在一個(gè)實(shí)施方案中，賦形劑包括至少一種聚合的生物可降解或非生物可降解的載 體和/或至少一種油或脂質(zhì)載體，包括其組合、摻合物和共聚物。示例性聚合載體包括選自下述的至少一種聚合物聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸 酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(酯肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、 聚(β-羥基丁酸酯)(poly(i3-hydrOXybutryate))、聚(己酸內(nèi)酯)、聚(二氧雜環(huán)己酮)、 聚(乙二醇)、聚(羥丙基)甲基丙烯酰胺、聚(有機(jī))磷腈、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、 聚(乙烯吡咯烷酮)、馬來酐烷基乙烯基醚共聚物、普朗尼克多元醇(pluronic polyols)、 清蛋白、藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、寡糖、糖胺聚糖 (glycaminoglycans)和硫酸化多糖。液體載體包括脂肪酸和脂肪酸的鹽，脂肪族醇，脂肪族胺，脂肪酸的甘油單酯、甘 油二酯和甘油三酯，磷脂，糖脂，固醇和蠟及相關(guān)類似物質(zhì)。蠟進(jìn)一步分成天然和合成產(chǎn)物。 天然材料包括得自植物、動(dòng)物或礦物來源的蠟，例如蜂蠟、巴西棕櫚蠟或褐煤蠟。氯化萘和 烯屬聚合物是合成蠟產(chǎn)物的例子。油(或油狀液體)載體包括油(或油狀液體)，例如油質(zhì)杏仁油、玉米油、棉子油、 油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油、輕質(zhì)礦物油、辛基十二醇、橄欖油、花生 油、桃仁油、芝麻油、大豆油、角鯊?fù)?、液體甘油三酯、液體蠟和高級(jí)醇。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括可通過本發(fā)明的方法獲得的抗體或抗體片段晶 體的可注射液體組合物，其中抗體或抗體片段以約10至約400mg/ml、或約50至約300mg/ ml，例如約200mg/ml的濃度存在。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括可通過本發(fā)明的方法獲得的抗體或抗體片段晶 體的晶體漿組合物，其中抗體或抗體片段以超過約100mg/ml的濃度存在，例如約150至約 600mg/ml、或約 200 至約 400mg/ml。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療哺乳動(dòng)物的方法，其包括給哺乳動(dòng)物施用 有效量的可通過本發(fā)明的方法獲得的抗體晶體或組合物的步驟。用于施用晶體及其組合物 的方法可以包括但不限于通過腸胃外途徑、通過經(jīng)口途徑、通過吸入、通過注射或其組合施用。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療受試者中的IL-18相關(guān)病癥的方法，其包 括給受試者施用治療有效量的抗體晶體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗IL-18抗體晶體用于制備用于治療 IL-18相關(guān)疾病的藥物組合物的用途。本發(fā)明還提供了如上文定義的IL-18抗體片段晶體用于在醫(yī)學(xué)中使用。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體蛋白質(zhì)溶液和結(jié)晶溶液以約1 1的比組合。
14因此，在原始結(jié)晶溶液中緩沖試劑/結(jié)晶試劑的體積摩爾濃度是結(jié)晶混合物中的那種的約 2倍。除非另有說明，否則本發(fā)明的結(jié)晶法可應(yīng)用于任何抗體片段，例如Fab片段?？贵w 可以是多克隆抗體，或優(yōu)選地單克隆抗體。抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、非人 抗體如例如小鼠抗體，各自以糖基化或非糖基化形式。抗體是例如雙重特異性抗體(dsAb) 或雙重可變結(jié)構(gòu)域抗體(DVDAb)。除非另有說明，否則本發(fā)明的結(jié)晶法利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)設(shè)備、化學(xué)制品 和方法。然而，如上所述，本發(fā)明基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)特定結(jié)晶條件的選擇，特別是特定結(jié) 晶試劑的選擇，任選與特定PH條件和/或相應(yīng)試劑(緩沖劑、抗體、結(jié)晶試劑)的濃度范圍 進(jìn)一步組合，首次允許制備Fab片段的能再現(xiàn)的穩(wěn)定晶體，這可以進(jìn)一步加工以形成優(yōu)良 的高度有利的藥物組合物的活性成分。用于執(zhí)行結(jié)晶法的原材料通常包括待結(jié)晶抗體的濃縮溶液。蛋白質(zhì)濃度可以例如 為約lmg/ml至約200mg/ml。溶液可以包含使溶解的抗體穩(wěn)定的添加劑。在一個(gè)實(shí)施方案 中，預(yù)先去除添加劑是適當(dāng)?shù)?。這可以通過執(zhí)行本文描述的緩沖液更換步驟來達(dá)到。優(yōu)選地，用于執(zhí)行本發(fā)明的結(jié)晶法的原材料包含在水溶液中的抗體，具有調(diào)整至 約5.0至約12.0的pH。pH可以借助于合適的緩沖液進(jìn)行調(diào)整，所述緩沖液以約1至約 500mM，特別是約IOOmM終濃度存在。溶液可以包含基于溶液的總重量例如約0. 01至約15、 或約0. 1至約5、或約0. 1至約2wt.比例的添加劑，例如鹽、糖、糖醇和表面活性劑，以進(jìn) 一步使溶液穩(wěn)定。賦形劑應(yīng)優(yōu)選選自在藥物制備中常規(guī)應(yīng)用的生理學(xué)上可接受的化合物。 作為非限制性例子，可以提及鹽例如NaCl ；表面活性劑例如聚山梨醇酯80 (Tween 80)和聚 山梨醇酯20(Tween 20)；糖例如蔗糖和海藻糖；冷凍保護(hù)劑例如乙二醇、甘油、丙二醇和蔗 糖；糖醇例如甘露糖醇和山梨糖醇；和緩沖試劑例如基于磷酸鹽的緩沖系統(tǒng)，例如如上定 義的磷酸氫鈉和鉀緩沖液、乙酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、 CAPS緩沖液、TRIS緩沖液、MES緩沖液、N- 二 [羥乙基]甘氨酸緩沖液、馬來酸鹽緩沖液或 琥珀酸鹽緩沖液、和組氨酸緩沖液；和氨基酸例如組氨酸、精氨酸和甘氨酸。緩沖液更換可以借助于常規(guī)方法來執(zhí)行，例如通過透析、滲濾或超濾。若需要，則將使溶液達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)晶條件。特別地，溫度將調(diào)整至約4°C至約 37°C。若需要或有利，則溫度無需保持恒定，例如溫度可以改變，并且在結(jié)晶過程中可以應(yīng) 用提供所需形狀的晶體的溫度概況。任選地以與抗體溶液相同的方式預(yù)先調(diào)節(jié)的，包含合適濃度的結(jié)晶試劑的結(jié)晶溶 液隨后加入抗體溶液中，以形成結(jié)晶混合物。根據(jù)進(jìn)一步實(shí)施方案，本發(fā)明的結(jié)晶法也可以這樣執(zhí)行，從而使得在步驟a)中獲 得的結(jié)晶混合物可以補(bǔ)充有合適量的預(yù)先存在的抗體晶體，如例如抗IL-18抗體結(jié)合片段 晶體，作為晶種以起始或加強(qiáng)結(jié)晶。結(jié)晶溶液的添加可以連續(xù)或不連續(xù)執(zhí)行，任選在輕輕攪動(dòng)下以促進(jìn)2種液體的混 合。優(yōu)選地，在其中蛋白質(zhì)溶液在攪動(dòng)下提供并且結(jié)晶溶液(或以其固體形式的試劑)以 受控方式加入的條件下執(zhí)行添加。通過應(yīng)用如上定義的聚烷撐多元醇，特別是聚烷撐二醇，且優(yōu)選聚乙二醇(PEG)， 或如上定義的至少2種不同聚烷撐多元醇的混合物作為結(jié)晶試劑，起始抗體晶體的形成。結(jié)晶混合物包含這樣濃度的試劑，所述濃度足以提供聚烷撐多元醇在結(jié)晶混合物中約5至 約30% (w/v)的終濃度。也可以應(yīng)用如上文已描述的聚烷撐多元醇的濃度梯度。優(yōu)選地，結(jié)晶溶液另外包含酸性緩沖液，即不同于抗體溶液的那種，其濃度適合于 允許結(jié)晶混合物的PH調(diào)整為約4至約6。在已完成給結(jié)晶溶液添加結(jié)晶試劑后，混合物可以進(jìn)一步溫育約1小時(shí)至約1年， 以獲得最高得率的抗體晶體。若合適，則混合物可以例如進(jìn)行攪動(dòng)、輕輕攪拌、滾動(dòng)或以本 領(lǐng)域已知的方式移動(dòng)。如果需要另外控制晶體大小，那么基于在受控條件(如上文已解釋 的)下的攪動(dòng)的大小控制結(jié)晶法可以補(bǔ)充到本發(fā)明的分批結(jié)晶法內(nèi)。所獲得的晶體可以通過已知方法例如過濾或離心進(jìn)行分離，如例如通過在約200 至約20，OOOrpm、優(yōu)選約500至約2，OOOrpm下在約4°C的室溫下離心。剩余母液可以棄去， 或例如通過添加另外的結(jié)晶試劑進(jìn)一步加工。若需要，則分離的晶體可以進(jìn)行洗滌且隨后干燥，或母液可以用適合于其中懸浮 抗體的貯藏和最終使用的不同溶劑系統(tǒng)取代。根據(jù)本發(fā)明形成的抗體晶體在其形狀方面可以不同，如上文已描述的。對(duì)于治療 施用，晶體的大小將依賴于施用途徑而改變，例如對(duì)于皮下施用，晶體的大小可以大于用于 靜脈內(nèi)施用。晶體的形狀可以通過將特定的另外添加劑加入結(jié)晶混合物中加以改變，如先 前已對(duì)于蛋白質(zhì)晶體以及低分子量有機(jī)和無機(jī)分子晶體描述的。若需要，則可以驗(yàn)證晶體事實(shí)上是抗體的晶體?？贵w的晶體可以用顯微鏡術(shù)就雙 折射進(jìn)行分析。一般而言，除非具有立方體內(nèi)部對(duì)稱性，晶體將使偏振光的偏振面旋轉(zhuǎn)。在 另外一種方法中，晶體可以進(jìn)行分離、洗滌、再溶解且通過SDS-PAGE進(jìn)行分析，并且任選 地，用檢測抗體進(jìn)行染色。任選地，再溶解的抗體也可以利用標(biāo)準(zhǔn)測定就與其抗原的結(jié)合進(jìn) 行測試。根據(jù)本發(fā)明獲得的晶體也可以彼此交聯(lián)。此種交聯(lián)可以增強(qiáng)晶體的穩(wěn)定性。用于 使晶體交聯(lián)的方法在例如美國專利號(hào)5，849，296中描述。晶體可以使用雙功能試劑例如戊 二醛進(jìn)行交聯(lián)。一旦交聯(lián)，晶體就可以進(jìn)行凍干且貯藏，以用于例如在診斷或治療應(yīng)用中使用。在一些情況下，可能希望使晶體干燥。借助于惰性氣體如氮?dú)狻⒄婵蘸嫦涓稍?、?干、蒸發(fā)、盤式干燥、流化床干燥、噴霧干燥、真空干燥或輥筒干燥，可以使晶體干燥。合適方 法是本領(lǐng)域眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明形成的晶體可以維持在原始結(jié)晶混合物中，或它們可以進(jìn)行洗滌且與 其他物質(zhì)例如惰性載體或成分組合，以形成包括本發(fā)明晶體的組合物或制劑。此種組合物 或制劑可以例如用于治療和診斷應(yīng)用中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使合適載體或成分與本發(fā)明的晶體組合，從而使得制劑的晶 體由賦形劑包埋或包封。合適載體可以得自下述非限制性組聚(丙烯酸)，聚(氰基丙烯 酸酯)，聚(氨基酸)，聚(酐)，聚(酯肽)，聚(酯)，聚(乳酸)，乳酸-乙醇酸共聚物或 PLGA，聚(β-羥基丁酸酯)，聚(己酸內(nèi)酯)，聚(二氧雜環(huán)己酮)，聚(乙二醇)，聚(羥 丙基)甲基丙烯酰胺，聚(有機(jī))磷腈，聚(原酸酯)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)， 馬來酐烷基乙烯基醚共聚物，普朗尼克多元醇，清蛋白，藻酸鹽，纖維素和纖維素衍生物，膠 原，纖維蛋白，明膠，透明質(zhì)酸，寡糖，糖胺聚糖，硫酸化多糖，其摻合物和共聚物，SAIB，脂肪
16酸和脂肪酸的鹽，脂肪族醇，脂肪族胺，脂肪酸的甘油單酯、甘油二酯和甘油三酯，磷脂，糖 脂，固醇和蠟及相關(guān)類似物質(zhì)。蠟進(jìn)一步分成天然或合成產(chǎn)物。天然材料包括得自植物、動(dòng) 物或礦物來源的蠟，例如蜂蠟、巴西棕櫚蠟或褐煤蠟。氯化萘和烯屬聚合物是合成蠟產(chǎn)物的 例子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括與至少一種載體和/或賦形劑組合的抗體結(jié)晶 的組合物和制劑。制劑可以是固體、半固體或液體。本發(fā)明的制劑以適合于貯藏和/或使用的形式進(jìn)行制備，其通過使具有所需純度 的抗體與生理學(xué)上可接受的添加劑以懸浮液的形式混合來實(shí)現(xiàn)，所述添加劑例如載體、賦 形劑和 / 或穩(wěn)定劑(參見例如,Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 16 版，Osol， Α.編輯(1980))，或是凍干的或以另一種方式進(jìn)行干燥的。任選地，也可以摻入進(jìn)一步的活 性成分例如不同抗體、生物分子、或化學(xué)或酶促合成的低分子量分子?？山邮艿奶砑觿┦窃谒捎玫膭┝亢蜐舛认聦?duì)于接受者無毒的。它的非限制性例 子包括-酸化劑，例如乙酸、檸檬酸、延胡索酸、鹽酸、蘋果酸、硝酸、磷酸、稀磷酸、硫酸和 酒石酸；-氣溶膠推進(jìn)劑，例如丁烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷、異丁烷、丙烷和三氯氟 甲烷；-空氣排代，例如二氧化碳和氮；-醇變性劑，例如甲基異丁基酮和蔗糖蔗糖八乙酸酯；-堿化劑，例如氨溶液、碳酸銨、二乙醇胺、二異丙醇胺、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、硼酸 鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉和三乙醇胺(trolamine)；-消泡劑，例如聚二甲基硅氧烷和西甲硅油(simethicone)；-抗微生物防腐劑，例如苯扎氯銨、苯扎氯銨溶液、氯化芐乙氧銨(benzelthonium chloride)、苯甲酸、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、西吡氯銨、三氯叔丁醇、氯甲酚、甲酚、脫氫 乙酸、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸甲酯鈉、苯酚、苯乙醇、乙酸苯 汞、硝酸苯汞、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯鈉、苯甲酸鈉、脫 氫乙酸鈉、丙酸鈉、山梨酸、硫柳汞和麝香草酚；-抗氧化劑，例如抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚、丁化羥基甲 苯、次磷酸、一硫代甘油、掊酸丙酯、甲醛合次硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、二氧化 硫、生育酚和生育酚賦形劑；-緩沖試劑，例如乙酸、碳酸銨、磷酸銨、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸、檸檬酸鉀、偏 磷酸鉀、一堿價(jià)磷酸鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉溶液、磷酸氫二鈉、一堿價(jià)磷酸鈉和組氨 酸；-螯合劑例如依地酸二鈉、乙二胺四乙酸和鹽、和依地酸；-包衣試劑，例如羧甲基纖維素鈉、乙酸纖維素、纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯、乙基 纖維素、明膠、藥用釉料、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸 酯、甲基丙烯酸共聚物、甲基纖維素、聚乙二醇、普外撲、紫膠、蔗糖、二氧化鈦、巴西棕櫚蠟、 微晶蠟、玉米醇溶蛋白、聚氨基酸、其他聚合物例如PLGA等和SAIB ；-著色劑，例如氧化鐵；
-絡(luò)合劑，例如乙二胺四乙酸和鹽(EDTA)、依地酸、2，5-二羥基苯甲酸乙醇酰胺 (ethanolamide)和羥喹啉硫酸鹽；-干燥劑，例如氯化鈣、硫酸鈣和二氧化硅；-乳化劑和/或加溶劑，例如阿拉伯膠、膽固醇、二乙醇胺(添加劑)、單硬脂酸甘 油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、甘油單酯和甘油二酯、單乙醇胺(添加劑)、油酸(添加劑)、油醇 (穩(wěn)定劑)、泊洛沙姆、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯(p0ly0Xyl)35蓖麻(caster)油、聚 氧乙烯40氫化蓖麻油、聚氧乙烯10油醚、聚氧乙烯20十六烷基十八烷基醚、聚氧乙烯40 硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇二乙酸酯、 丙二醇單硬脂酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鈉、失水山梨糖醇單月桂酸酯、失水山梨糖醇 (soritan)單油酸酯、失水山梨糖醇單棕櫚酸酯、失水山梨糖醇單硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇 胺和乳化蠟；-助濾劑，例如粉狀纖維素和精制硅藻土；-食用香料和香料，例如茴香腦、苯甲醛、乙基香蘭素、薄荷醇、水楊酸甲酯、谷氨酸 一鈉、橙花油、薄荷、薄荷油、歐薄荷醑、玫瑰油、濃玫瑰水、麝香草酚、吐魯香脂酊、香子蘭、 香子蘭酊和香蘭素；-助流劑和/或防結(jié)塊劑，例如硅酸鈣、硅酸鎂、膠態(tài)二氧化硅和滑石；-濕潤劑，例如丙三醇、己二醇、丙二醇和山梨糖醇；-軟膏基質(zhì)，例如羊毛脂、無水羊毛脂、親水軟膏、白軟膏、黃軟膏、聚乙二醇軟膏、 礦脂、親水礦脂、白礦脂、玫瑰水軟膏和角鯊?fù)椋?增塑劑，例如蓖麻油、羊毛脂、礦物油、礦脂、苯甲基苯甲基(benyl)甲酸酯、三氯 叔丁醇、鄰苯二甲酸(pthalate) 二乙酯、山梨糖醇、二乙酰甘油單酯、鄰苯二甲酸二乙酯、
丙三醇、甘油、單和二乙酰甘油單酯、聚乙二醇、丙二醇、甘油三乙酸酯、檸檬酸三乙酯和乙-多肽，例如低分子量(小于約10個(gè)殘基)；-蛋白質(zhì)，例如血清清蛋白、明膠和免疫球蛋白；-聚合物膜，例如乙酸纖維素膜；-溶劑，例如丙酮、醇、稀醇、戊烯水合物、苯甲酸芐酯、丁醇、四氯化碳、氯仿、玉米 油、棉子油、乙酸乙酯、丙三醇、己二醇、異丙醇、甲醇、二氯甲烷、甲基異丁基酮、礦物油、花 生油、聚乙二醇、碳酸異丙烯酯、丙二醇、芝麻油、注射用水、無菌注射用水、無菌沖洗用水、 凈化水、液體甘油三酯、液體蠟和高級(jí)醇；-吸著劑，例如粉狀纖維素、木炭、精制硅藻土、二氧化碳吸著劑、氫氧化鋇石灰和 堿石灰；-硬化劑，例如氫化蓖麻油、十八醇十六醇混合物、十六醇、十六烷基酯蠟、硬脂、石 蠟、聚乙烯賦形劑、十八烷醇、乳化蠟、白蠟和黃蠟；-栓劑基質(zhì)，例如可可脂、硬脂和聚乙二醇；-懸浮劑和/或增粘劑，例如阿拉伯膠、瓊脂、藻酸、單硬脂酸鋁、皂土、精制皂土、 稠液皂土、卡波姆934p、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈉12、角叉菜聚 糖、微晶和羧甲基纖維素鈉纖維素、糊精、明膠、瓜耳膠、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙 基甲基纖維素、硅酸鋁鎂、甲基纖維素、果膠、聚環(huán)氧乙烷、聚乙烯醇、聚烯吡酮、藻酸丙二酯、二氧化硅、膠態(tài)二氧化硅、藻酸鈉和黃蓍膠、黃原膠；-甜味劑，例如阿斯巴甜、葡聚糖結(jié)合劑、葡萄糖、賦形劑葡萄糖、果糖、甘露糖醇、 糖精、糖精鈣、糖精鈉、山梨糖醇、山梨糖醇溶液、蔗糖、可壓縮糖、糖果店的糖和糖漿；-片劑粘合劑，例如阿拉伯膠、藻酸、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、糊精、乙基纖維 素、明膠、液體葡萄糖、瓜耳膠、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚環(huán)氧乙烷、聚烯吡酮、預(yù) 膠凝淀粉和糖漿；-片劑和/或膠囊稀釋劑，例如碳酸鈣、二代磷酸鈣、三代磷酸鈣、硫酸鈣、微晶纖 維素、粉狀纖維素、葡聚糖結(jié)合劑、糊精、葡萄糖賦形劑、果糖、高嶺土、乳糖、甘露糖醇、山梨 糖醇、淀粉、預(yù)膠凝淀粉、蔗糖、可壓縮糖和糖果店的糖；-片劑崩解劑，例如藻酸、微晶纖維素、交聯(lián)甲羧纖維素鈉、聚乙烯聚吡咯烷酮 (corspovidone)、波拉克林鉀(polacrilin potassium)、羥基乙酸淀粉鈉、淀粉和預(yù)膠凝淀 粉。-片劑和/或膠囊潤滑劑，例如硬脂酸鈣、山崳酸甘油酯、硬脂酸鎂、輕質(zhì)礦物油、 聚乙二醇、硬脂酰延胡索酸鈉、硬脂酸、精制硬脂酸、滑石、氫化植物油和硬脂酸鋅；-張力試劑，例如葡萄糖、丙三醇、甘露糖醇、氯化鉀、氯化鈉；-媒介物，例如調(diào)味和/或增甜芳香酏劑、復(fù)合苯甲醛酏、等醇酏、薄荷水、山梨糖 醇溶液、糖漿和吐魯香脂糖漿；-媒介物，例如油質(zhì)杏仁油、玉米油、棉子油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸 異丙酯、礦物油、輕質(zhì)礦物油、肉豆蔻醇、辛基十二醇、橄欖油、花生油、桃仁油、芝麻油、大豆 油、角鯊?fù)?；固體載體糖球；無菌制菌注射用水、制菌氯化鈉注射液、液體甘油三酯、液體蠟 和高級(jí)醇。-防水劑，例如環(huán)甲基硅酮、聚二甲基硅氧烷和西甲硅油；和-濕潤劑和/或加溶劑，例如苯扎氯銨、氯化芐乙氧銨、西吡氯銨、多庫酯鈉、壬基 酚聚氧乙烯(9)醚、壬基酚聚氧乙烯(10)醚、辛基酚聚氧乙烯(9)醚、泊洛沙姆、聚氧乙烯 35蓖麻油、聚氧乙烯40氫化蓖麻油、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯10油醚、聚氧乙烯20 十六烷基十八烷基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯 60、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸鈉、失水山梨糖醇單月桂酸酯(monolaureate)、失水山梨 糖醇單油酸酯、失水山梨糖醇單棕櫚酸酯、失水山梨糖醇單硬脂酸酯和泰洛沙泊。晶體可以與聚合載體組合以提供穩(wěn)定性和/或持續(xù)釋放。此種聚合物包括生物相 容和生物可降解的聚合物。聚合載體可以是單一聚合物類型或它可以由聚合物類型的混合 物組成。聚合載體的非限制性例子已在上文提供。優(yōu)選成分或賦形劑的例子包括-氨基酸例如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯 氨酸和組氨酸的鹽；-單糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖和核糖；-二糖，例如乳糖、海藻糖、麥芽糖和蔗糖；-多糖，例如麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉和糖原；-糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、拉克替醇(Iactitol)和山梨糖醇；
-葡糖醛酸和半乳糖醛酸；
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-環(huán)糊精，例如甲基環(huán)糊精、羥丙基-(3-環(huán)糊精)；-無機(jī)鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、鈉和鉀的磷酸鹽、硼酸碳酸銨和磷酸銨；-有機(jī)鹽，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽和乳酸鹽；-乳化劑或加溶劑，例如阿拉伯膠、二乙醇胺、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、單乙醇胺、 油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸、失水山梨糖醇單月桂酸酯、失 水山梨糖醇單硬脂酸酯、及其他失水山梨糖醇衍生物、聚氧乙烯(polyoxyl)衍生物、蠟、聚 氧乙烯衍生物、失水山梨糖醇衍生物；和-增粘試劑，例如瓊脂、藻酸及其鹽、瓜耳膠、果膠、聚乙烯醇、聚環(huán)氧乙烷、纖維素 及其衍生物碳酸異丙烯酯、聚乙二醇、己二醇和泰洛沙泊。本文描述的制劑還包括有效量的結(jié)晶抗體。特別地，本發(fā)明的制劑可以包括“治療 有效量”或“預(yù)防有效量”的本發(fā)明的抗體晶體?！爸委熡行Я俊敝冈谒鑴┝亢蜁r(shí)間段有效 達(dá)到所需治療結(jié)果的量?？贵w晶體的“治療有效量”可以根據(jù)下述因素而改變，所述因素例 如疾病狀態(tài)，個(gè)體的年齡、性別和重量，和抗體在個(gè)體中引發(fā)所需應(yīng)答的能力。治療有效量 也是其中抗體的任何毒性或有害作用被治療有利效應(yīng)超過的量?！邦A(yù)防有效量”指在所需劑 量和時(shí)間段有效達(dá)到所需預(yù)防結(jié)果的量。一般地，因?yàn)轭A(yù)防劑量在疾病前或在疾病的較早 階段時(shí)在受試者中使用，所以預(yù)防有效量將小于治療有效量。合適劑量可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法容易地確定?？贵w適當(dāng)?shù)匾淮位蛟谝幌盗兄委熎陂g 施用于患者。依賴于上述因素，約1 μ g/kg至約50mg/kg，如例如約0. 1至約20mg/kg抗體 是用于施用于患者的初始候選劑量，無論例如是通過一次或多次分開施用還是通過連續(xù)輸 注。一般的每日或每周劑量可以為約ι μ g/kg至約20mg/kg或更多，依賴于狀況，重復(fù)治療 直至出現(xiàn)疾病癥狀的所需抑制。然而，其他劑量方案也可以是有用的。在一些情況下，當(dāng)再 溶解時(shí)，制劑包括至少約lg/L或更大的抗體濃度。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)再溶解時(shí)，抗體濃 度是至少約lg/L至約100g/L?？贵w的晶體或包括此種晶體的制劑可以單獨(dú)或作為藥物制劑的部分進(jìn)行施用。本 發(fā)明的晶體可以通過經(jīng)口、腸胃外、肺、鼻、耳、肛門、皮、眼、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、 粘膜、舌下、皮下、經(jīng)皮、局部或顱內(nèi)途徑施用，或例如施用到口腔內(nèi)。施用技術(shù)的具體例子 包括肺吸入、損傷內(nèi)應(yīng)用、針注射、干粉吸入、皮膚電穿孔、氣溶膠遞送和無針注射技術(shù)，包 括無針皮下施用。IL-18相關(guān)病癥可以選自下述疾病列表表1:IL_18相關(guān)疾病
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獲得性免疫缺陷病綜合征_
獲得性免疫缺陷相關(guān)病_
獲得性惡性貧血_
急、'I"生冠月永鄉(xiāng)宗合征(Acute coronary syndromes) 急性和慢性疼痛(不同形式的疼痛)
急性特發(fā)性多神經(jīng)炎_
與器官移植相關(guān)的急性免疫性疾病 與器官移植相關(guān)的急性或慢性免疫性疾病 急性炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根性神經(jīng)病
急性缺血_
急性肝病_
急性風(fēng)濕熱_
急性橫貫性脊髓炎_
Addison 氏病_
成人(急性)呼吸窘迫綜合征_
成人Still氏病_
酒精性肝硬化_
酒精誘導(dǎo)的肝損傷_
變應(yīng)性疾病_
變態(tài)反應(yīng)_
禿頂_
斑殼_
阿爾茨海默氏病_
過敏反應(yīng)_
強(qiáng)直性脊柱炎_
強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的肺病_
抗磷脂抗體綜合征_
再生障礙性貧血_
動(dòng)脈硬化_
關(guān)節(jié)病
2權(quán)利要求
1.一種制備抗體Fab片段的晶體的方法，所述方法包括步驟(a)獲得Fab片段；(b)使所述Fab片段與包括聚乙二醇和緩沖液的儲(chǔ)庫溶液混合，以制備結(jié)晶混合物；和(c)將所述結(jié)晶混合物置于表面上直至晶體形成。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚乙二醇選自聚乙二醇6000、聚乙二醇400和聚乙二 醇4000、聚乙二醇8000、聚乙二醇MME 5000和聚乙二醇20，000)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚乙二醇為約5至約40%的濃度。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述緩沖液選自HEPES、CAPS、Tris、二甲胂酸鹽、MES、檸檬 酸鹽、bis-tris、磷酸鹽、CHES、M0PS、咪唑、乙酸鹽、N-二 [羥乙基]甘氨酸和檸檬酸鹽。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述緩沖液在約pH6. 5至約pH 11. 0下。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述HEPES緩沖液在約pH7.5下。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述CAPS緩沖液在約ρΗΙΟ.5下。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述Tris緩沖液在約pH8.5下。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述儲(chǔ)庫選自硅化處理的載玻片和坐滴孔。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法在約0°C至約25°C下執(zhí)行。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法在約4°C下執(zhí)行。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法在約18°C下執(zhí)行。
13.權(quán)利要求1的方法，其中將結(jié)晶混合物置于表面上約1至7天以形成晶體。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述儲(chǔ)庫溶液進(jìn)一步包括2，4-甲基戊二醇。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述2，4-甲基戊二醇為約2至約10%的濃度。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fab片段與IL-18結(jié)合。
17.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括約50至約500mM濃度的MgCl2。
18.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括約100至約500mM濃度的磺基甜菜堿201。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fab片段是人Fab片段。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fab片段是非人Fab片段。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fab片段是小鼠Fab片段。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fab片段結(jié)合非人IL-18。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fab片段結(jié)合人IL-18。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述IL-18是其中所有半胱氨酸殘基都突變成丙氨酸的突 變 IL-18。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fab片段包括輕鏈序列SEQIDNO 1和重鏈序列SEQ ID NO :2。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fab片段結(jié)合包括SEQID No :9的氨基酸序列的蛋 白質(zhì)。
27.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fab片段包括輕鏈序列SEQIDNO 3和重鏈序列SEQ ID NO :4。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述Fab片段結(jié)合包括SEQID No 10的氨基酸序列的蛋 白質(zhì)。
29.一種分離的晶體，其包括與IL-18結(jié)合的Fab片段。
30.權(quán)利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段是人Fab片段。
31.權(quán)利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段是非人Fab片段。
32.權(quán)利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段是小鼠Fab片段。
33.權(quán)利要求四的分離的晶體，其中所述IL-18是人IL-18。
34.權(quán)利要求四的分離的晶體，其中所述IL-18是非人IL-18。
35.權(quán)利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段包括輕鏈序列SEQID N0:1和重鏈 序列 SEQ ID NO :2。
36.權(quán)利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段結(jié)合包括SEQIDNo :9的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
37.權(quán)利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段包括輕鏈序列SEQID N0:3和重鏈 序列 SEQ ID NO :4。
38.權(quán)利要求四的分離的晶體，其中所述Fab片段結(jié)合包括SEQIDNo 10的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
39.一種分離的共晶，其包括與IL-18結(jié)合的Fab片段。
40.權(quán)利要求39的分離的共晶，其中所述Fab片段是人Fab片段。
41.權(quán)利要求39的分離的共晶，其中所述Fab片段是非人Fab片段。
42.權(quán)利要求41的分離的共晶，其中所述Fab片段是小鼠Fab片段。
43.權(quán)利要求39的分離的共晶，其中所述IL-18是人IL-18。
44.權(quán)利要求39的分離的共晶，其中所述IL-18是非人IL-18。
45.權(quán)利要求39的分離的共晶，其中所述Fab片段是單克隆抗體125-2H的Fab片段。
46.權(quán)利要求39的分離的晶體，其中所述Fab片段包括輕鏈序列SEQID N0:3和重鏈 序列 SEQ ID NO :4。
47.權(quán)利要求39的分離的晶體，其中所述Fab片段結(jié)合包括SEQIDNo 10的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
48.一種分離的晶體，其包括單克隆抗體ABT-325的Fab片段。
49.權(quán)利要求48的分離的晶體，其中所述ABT-325Fab片段包括輕鏈序列SEQID NO: 1和重鏈序歹Ij SEQ ID NO :2ο
50.權(quán)利要求四或48的分離的晶體，其中所述Fab片段與具有選自Asp59-Asp76(SEQ ID NO 7)和Glul64-Leul69(SEQ ID NO 8)的氨基酸序列的至少一種IL-18肽，或其具有 一種或多種氨基酸取代的類似物結(jié)合，其中所述類似物與抗體ABT-325結(jié)合。
51.一種分離的晶體，其包括單克隆抗體125-2H的Fab片段。
52.權(quán)利要求52的分離的晶體，其中所述125-2HFab片段包括輕鏈序列SEQ ID NO 3和重鏈序歹Ij SEQ ID NO :4。
53.權(quán)利要求52的分離的晶體，其中所述Fab片段與具有選自Lysl76-Argl83(SEQID NO 5)和Argl40-Lysl48(SEQ ID NO 6)的氨基酸序列的至少一種IL-18肽，或其具有一種 或多種氨基酸取代的類似物結(jié)合，其中所述類似物與抗體125-2H結(jié)合。
54.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求四或48的分離的晶體。
55.一種用于治療受試者的疾病或病癥的方法，其通過給所述受試者施用權(quán)利要求56 的晶體，從而使得達(dá)到治療。
56.權(quán)利要求58的方法，其中所述疾病選自表1中列出的疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于使抗體及其片段結(jié)晶的方法，以及由此產(chǎn)生的晶體。更具體而言，本發(fā)明提供了使抗體的人和非人Fab片段結(jié)晶的方法，單獨(dú)或作為與其靶配體的共晶。例如，提供了包括抗體125-2H的鼠類Fab片段或抗體ABT-325的人Fab片段的晶體，以及與IL-18結(jié)合的鼠類Fab片段的共晶，所述抗體125-2H和ABT-325與IL-18結(jié)合。ABT-325和125-2H在組合位點(diǎn)特征和構(gòu)造方面顯著不同，從而解釋了其在不同表位處同時(shí)結(jié)合IL-18的能力。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102065892SQ200980111073
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月30日
發(fā)明者C·吳, D·W·博爾哈尼, M·A·阿吉里亞迪, T·加于爾, T·向 申請(qǐng)人:雅培制藥有限公司