專利名稱：溶解結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建體及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合構(gòu)建體，使用融合構(gòu)建體的方法以及治療不良的或異常的細(xì)胞增 殖或高度增殖疾病(例如非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性贅生瘤(neoplasias)、癌癥、腫瘤和惡性腫瘤) 的方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)考慮癌癥患者的五年存活率時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)開(kāi)發(fā)治療原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的新型 療法的需求是顯而易見(jiàn)的當(dāng)診斷出遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移性疾病時(shí)，僅有10-40%的患有肺、結(jié)腸直 腸、乳腺和前列腺癌的患者能存活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明至少部分基于融合或連接至結(jié)合部分的溶解結(jié)構(gòu)域(在此稱為融合構(gòu)建 體)。細(xì)胞與溶解結(jié)構(gòu)域的接觸被認(rèn)為會(huì)引起細(xì)胞膜的破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該結(jié)合部 分靶向被該溶解結(jié)構(gòu)域破壞的細(xì)胞，包括不良的或異常的增殖細(xì)胞或高度增殖細(xì)胞，例如 非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性贅生瘤、癌癥、腫瘤和惡性腫瘤。一些非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性贅生瘤、癌癥、腫 瘤和惡性細(xì)胞過(guò)量表達(dá)受體或配體。例如，許多非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性贅生瘤、癌癥、腫瘤和惡 性腫瘤表達(dá)可用作該融合構(gòu)建體的結(jié)合部分的激素(例如，促黃體激素/絨毛膜促性腺激 素(LH/CG)或促黃體激素釋放激素(LHRH)等)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、抗體等的受體.融合構(gòu)建體可被設(shè)計(jì)為靶向表達(dá)該結(jié)合部分的結(jié)合位點(diǎn)的任意細(xì)胞或細(xì)胞群。結(jié) 合部分如配體、抗體及其片段、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等可被連接至溶解結(jié)構(gòu)域靶向殺死表達(dá) 或包含受體、抗原、抗體、配體等的細(xì)胞，從而減少或抑制細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)。融合構(gòu)建體不需要細(xì)胞分裂以殺死靶細(xì)胞。進(jìn)一步地，融合構(gòu)建體不太可能具有 免疫原性，因?yàn)樗鼈兛杀恢苽錇榫哂邢鄬?duì)較小的大小。此外，融合構(gòu)建體可殺死多重耐藥細(xì) 胞。此外，融合構(gòu)建體就抗細(xì)胞增殖活性或殺傷活性和低溶血活性(HA5tl)而言具 有更大的細(xì)胞毒活性(低IC5tl),從而使IC5tl HA5tl的比例(IC5tZHA5tl)低于具有該活 性的其它化合物。例如，融合構(gòu)建體通過(guò)更低的IC5tl值確定具有比W!0r21-i3CG-ala、 Phor21-GSGGS-3 CG-ala、Phor21-ASAAS-β CG-ala 或 Phorl4_ β CG-ala 更高的抗細(xì)胞增 殖活性；具有比 Phor21-3 CG-ala、Phor21_GSGGS-β CG-ala、Phor21-ASAAS-β CG-ala 或 PhorH-β CG-ala 更低的 IC50AiA50 比例；或者具有小于約 0. 02,0. 01 或 0. 005 的 IC50AiA50 比例。根據(jù)本發(fā)明，提供了包含第一和第二結(jié)構(gòu)域的融合構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體包含由包含選自例如KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、 KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的Jft序列的 12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、 26,27或28殘基L-或D-氨基酸序列組成的第一結(jié)構(gòu)域以及包含靶向或結(jié)合部分或由其 組成的第二結(jié)構(gòu)域，或由該第一和第二結(jié)構(gòu)域組成。在另一實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體包含 由選自 KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、 KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的 L-或D-氨基酸序列組成的第一結(jié)構(gòu)域和包含靶向或結(jié)合部分或者由其組成的第二結(jié) 構(gòu)域，或由該第一和第二結(jié)構(gòu)域組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體包含由選 自 KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、 KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的 L-或 D-氨基酸序列組成的第一結(jié)構(gòu)域和由不同于所述第一結(jié)構(gòu)域的1-25L-或D-氨基酸序列 (例如，靶向或結(jié)合部分)組成的第二結(jié)構(gòu)域，或由該第一和第二結(jié)構(gòu)域組成。根據(jù)本發(fā)明，還提供了包含第一結(jié)構(gòu)域或由其組成的分離或純化的肽。在 不同的實(shí)施方式中，分離或純化的肽為KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、 KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 或 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA。在附加的實(shí)施方式中，分離或純化的肽為KFAKFAKKFAKFAKK、 KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA，其中一個(gè)或多個(gè)K殘基被F或L殘基的任意一個(gè)所替換，一個(gè)或多 個(gè)F殘基被K、A或L殘基的任意一個(gè)所替換，或者一個(gè)或多個(gè)A殘基被K、F或L殘基的任 意一個(gè)所替換。融合構(gòu)建體包含結(jié)合受體、配體或抗原的結(jié)合部分。結(jié)合部分還可包括配體、抗原 或抗體。配體包括結(jié)合受體的分子(如受體激動(dòng)劑或拮抗劑)，或由其組成。結(jié)合部分可包 括線性或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，或由其組成。結(jié)合部分的特定的非限制性范例包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，肽、多肽、蛋白)、 核酸和碳水化合物。結(jié)合部分的特定的非限制性類別包括結(jié)合受體的激素、激素類似物以 及激素和激素類似物的片段、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、抗體等。激素的特定非限制性范例包括 促性腺激素-釋放激素或其類似物、促黃體激素β鏈、促黃體激素、絨毛膜促性腺激素、絨 毛膜促性腺激素亞單位、促黑色素細(xì)胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、乳鐵蛋白、多巴胺、生 長(zhǎng)激素抑制素或其類似物、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮質(zhì)激素、雌激素、睪丸激素、雄烯二 酮、二氫睪丸激素、脫氫表雄酮、雄性激素、黃體酮、甲狀腺刺激激素(TSH)、胰島素、兒茶酚 胺、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、血管緊縮素、抗利尿素、降血鈣素、縮膽囊肽、蛙皮素、促腎上 腺皮質(zhì)激素-釋放激素、促胃液素、饑餓激素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素釋放激素及其類似物、 抑制素、食欲素、KiSS肽(GPR54)、kissp印tin、泌乳刺激素、泌乳刺激素釋放激素、生長(zhǎng)激 素、Herf/neu、葉酸、維生素H、鐵蛋白、副甲狀腺激素、松弛激素、分泌素、促甲狀腺素釋放 激素、內(nèi)皮素、腎素、促脂解素、褪黑素等。生長(zhǎng)激素的特定非限制性范例為表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)、胰島素-樣生長(zhǎng)因子-1和2(IGF-l、IGF-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因 子(NGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α和β (TGFa、TGFi3、血小板衍生生 長(zhǎng)因子(PDGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血漿銅藍(lán)蛋白等。細(xì)胞因子或配體的非限制性類別
11為白細(xì)胞介素(例如白介素2、白介素17、CD154、Fas配體等)、腫瘤壞死因子(TNFs)、干擾素等。結(jié)合部分可任選地在細(xì)胞上表達(dá)?？杀磉_(dá)結(jié)合部分(例如，受體、配體、抗原、抗 體)或者可根據(jù)本發(fā)明的方法靶向的細(xì)胞包括高度增殖細(xì)胞。表達(dá)受體、配體或抗原或 者可根據(jù)本發(fā)明的方法靶向的細(xì)胞還包括乳腺、卵巢、子宮、子宮頸、前列腺、睪丸、胰腺、皮 膚、血液細(xì)胞、腎上腺、腦垂體和子宮內(nèi)膜細(xì)胞。在細(xì)胞上表達(dá)的結(jié)合部分的特定的非限制 性類別為激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子(例如EGF受體、Herf/neiuRORl)、鐵蛋白、鐵傳遞蛋白 受體、細(xì)胞粘附分子等的受體。在可被抗體或其片段靶向的增殖細(xì)胞上表達(dá)的抗原的特定 非限制性范例為 CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、CD154、 類免疫球蛋白受體等。其它的抗原包括，例如，前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜 抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、α-胎兒球蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、癌癥抗原 125(CA-125)以及結(jié)合此處披露的配體的其它受體分子。第一和第二結(jié)構(gòu)域可以包括氨基酸或氨基酸序列，或由其組成。在特定的方面，第 一或第二結(jié)構(gòu)域具有約 1-10、10-20、15-20 (i. e.、15、16、17、18、19 或 20 氨基酸)、20_30、 30-40、40-50、60-70、70-80、80-90、90-100 或更多的氨基酸殘基。在特定的方面，第一結(jié)構(gòu)域包括兩親α -螺旋結(jié)構(gòu)，或由其組成。在其它特定的方 面，第二結(jié)構(gòu)域包括如SYAVALSAQAALARR或QHWSYGLRPG所列的氨基酸序列，或由其組成。第一和第二結(jié)構(gòu)域可定位在相對(duì)彼此的NH-末端或C-末端。因此，在一個(gè)實(shí)施方 式中，該第一(溶解肽)結(jié)構(gòu)域定位在相對(duì)于第二(結(jié)合部分或配體)結(jié)構(gòu)域的NH-末端， 而在另一實(shí)施方式中，該第二(結(jié)合部分或配體)結(jié)構(gòu)域定位在相對(duì)于該第一(溶解肽) 結(jié)構(gòu)域的C-末端。第一和第二結(jié)構(gòu)域可包括一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸，或由其組成。在特定的方面，第 一結(jié)構(gòu)域例如在K、F或A殘基任意一個(gè)上具有D-氨基酸。第一和第二結(jié)構(gòu)域可通過(guò)共價(jià)鍵連接。例如，第一和第二結(jié)構(gòu)域可通過(guò)肽或非肽 接頭連接。在特定的方面，第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)具有約1-25個(gè)氨基酸殘基或具有線性碳 鏈的肽序列連接。在更特定的方面，第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)包括一個(gè)或多個(gè)A、S或G氨基 酸殘基或由其組成的肽序列連接。在其它特定的方面，第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)肽序列連接， 第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)包含GSGGS、ASAAS或CCCCCC或由其組成的肽序列連接。第一和第二結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步包括額外的結(jié)構(gòu)域或由其組成。因此，在不同的方面， 融合構(gòu)建體包含第三、第四、第五、第六、第七結(jié)構(gòu)域等。融合構(gòu)建體包含分離或純化的形式或由其組成。融合構(gòu)建體還包含混合物或由 其組成。該種混合物包括組合物，例如融合構(gòu)建體和適于施用至對(duì)象或與對(duì)象體內(nèi)接觸的 藥學(xué)可接受的載體或賦形劑的混合物，或者融合構(gòu)建體和抗細(xì)胞增殖或免疫刺激劑的混合 物。 融合構(gòu)建體包含單位劑型或由其組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體是其數(shù)量 可有效治療患有不良細(xì)胞增殖或高度增殖紊亂的對(duì)象的單位劑型。在另一實(shí)施方式中，融 合構(gòu)建體是其數(shù)量可有效治療患有贅生瘤、腫瘤或癌癥的對(duì)象的單位劑型。在額外的實(shí)施 方式中，融合構(gòu)建體是其數(shù)量可有效減少對(duì)象生育力的單位劑型。
融合構(gòu)建體可包括在試劑盒內(nèi)，該試劑盒可選地具有實(shí)施方法的說(shuō)明。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含融合構(gòu)建體以及說(shuō)明書(shū)，其用于減少或抑制細(xì)胞增殖、減少或抑制高 度增殖細(xì)胞的增殖、減少或抑制贅生瘤、腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖、治療患有高度增殖紊亂的 對(duì)象、治療患有贅生瘤、腫瘤或癌癥的對(duì)象或者減少動(dòng)物的生育力。根據(jù)本發(fā)明，還提供了編碼融合構(gòu)建體的核酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸編 碼融合構(gòu)建體，該融合構(gòu)建體包含由包含選自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、 KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的肽序列的 12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、 對(duì)、25、沈、27或觀殘基1^-或0-氨基酸序列組成的第一結(jié)構(gòu)域以及包含靶向或結(jié)合 部分或由其組成的第二結(jié)構(gòu)域，或由該第一和第二結(jié)構(gòu)域組成。在另一實(shí)施方式中，核 酸編碼融合構(gòu)建體，該融合構(gòu)建體包含由選自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、 KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列組成的第一結(jié)構(gòu)域和包含 靶向或結(jié)合部分或者由其組成的第二結(jié)構(gòu)域，或由該第一和第二結(jié)構(gòu)域組成。在進(jìn)一 步的實(shí)施方式中，核酸編碼融合構(gòu)建體，該融合構(gòu)建體包含由選自KFAKFAKKFAKFAKK、 KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的 L-或 D-氨基酸序列組成的 第一結(jié)構(gòu)域和由不同于所述第一結(jié)構(gòu)域的1-25L-或D-氨基酸序列(例如，靶向或結(jié)合部 分)組成的第二結(jié)構(gòu)域。核酸可被包含在載體中，例如在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)編碼融合構(gòu)建體的表達(dá)載體。宿主 細(xì)胞可被載體中的核酸轉(zhuǎn)化，從而使該細(xì)胞表達(dá)由該核酸編碼的融合構(gòu)建體。融合構(gòu)建體可用于，例如，減少或抑制細(xì)胞的增殖、減少或抑制細(xì)胞增殖、減少或 抑制高度增殖細(xì)胞的增殖、減少或抑制贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞的增殖以及治療不良 或異常細(xì)胞增殖(例如高度增殖細(xì)胞或高度增殖紊亂)。高度增殖紊亂的非限制性范例包 括良性增生、非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性贅生瘤、癌癥和惡性腫瘤(例如，實(shí)體或液態(tài)瘤、骨髓瘤、淋 巴瘤、白血病、癌、肉瘤、黑素瘤、神經(jīng)的、網(wǎng)狀內(nèi)皮的和造血的瘤)。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供了減少或抑制細(xì)胞的增殖的方法；減少或抑制細(xì)胞增殖 的方法；減少或抑制高度增殖細(xì)胞的增殖的方法；以及減少或抑制贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡 性細(xì)胞增殖的方法。在不同的實(shí)施方式中，一種方法包括了將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑 制細(xì)胞的增殖的融合構(gòu)建體相接觸；將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制細(xì)胞增殖的融合構(gòu)建 體相接觸；將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制高度增殖細(xì)胞的增殖的融合構(gòu)建體相接觸；以 及將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞的增殖的融合構(gòu)建體相 接觸。根據(jù)本發(fā)明，此外提供了選擇性減少或抑制表達(dá)受體或抗原的細(xì)胞的增殖的方 法；選擇性減少或抑制表達(dá)受體或抗原的高度增殖細(xì)胞的增值的方法；以及選擇性減少或 抑制表達(dá)受體或抗原的贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞的增殖的方法。在不同的實(shí)施方式 中，一種方法包括將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制細(xì)胞的增值的融合構(gòu)建體相接觸，其中 所述肽的結(jié)合部分結(jié)合該細(xì)胞所表達(dá)的受體、配體或抗原；將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑 制高度增殖細(xì)胞的增殖的融合構(gòu)建體相接觸，其中所述肽的結(jié)合部分結(jié)合高度增殖細(xì)胞表 達(dá)的受體、配體和抗原；以及將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞的增殖的融合構(gòu)建體相接觸，其中所述融合構(gòu)建體的結(jié)合部分結(jié)合該細(xì)胞表達(dá)的受體、 配體或抗原。根據(jù)本發(fā)明的方法靶向的細(xì)胞包括表達(dá)受體或抗原(例如激素受體，例如，性或 性腺類固醇激素或者性或性腺類固醇激素受體)的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法靶向的細(xì)胞 還包括表達(dá)受體的細(xì)胞，其中該受體結(jié)合促性腺激素釋放激素I、促性腺激素釋放激素II、 八目鰻I(yíng)II促黃體激素釋放激素、促黃體激素β鏈、促黃體激素、絨毛膜促性腺激素、絨毛 膜促性腺激素β-亞單位、促黑色素細(xì)胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生長(zhǎng)激素抑制 素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮質(zhì)激素、雌激素、睪丸激素、雄烯二酮、二氫睪丸激素、脫氫 表雄酮、黃體酮、雄性激素、泌乳刺激素、泌乳刺激素釋放激素、抗利尿素、血管緊縮素、兒 茶酚胺、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、類胰島素生長(zhǎng)因子-1和2(IGF-1、IGF-2)、生長(zhǎng)激素(GH)、 Herf/neu、維生素H、葉酸、鐵傳遞蛋白、甲狀腺刺激激素(TSH)、副甲狀腺激素(PTH)、內(nèi)皮 素、蛙皮素、腎素、促脂解素、褪黑素激素、松弛激素、分泌素、生長(zhǎng)激素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)、血管活性腸肽、乳鐵蛋白、整合素(例如，α_5β3或α-5 β 1整合素)、神經(jīng)生長(zhǎng) 因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α和β (TGF-α和β)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGF)、CD-33、CD19、CD20、CD40、RORl、IGF-I、癌胚抗原(CEA)、α-胎兒球蛋白(AFP)、前列 腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、癌抗原125(CA-125)、白介素17、⑶154、 可溶性白介素-2 (IL-2)受體、酪氨酸酶、MAGE-I、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-l、糖蛋 白(gp)75、gplOO、β -連環(huán)蛋白、PRAME、MUM-U ZFP161、泛素-1、H0X-B6、YB-I、骨粘連蛋 白、ILF3、葉酸或其衍生物、腫瘤壞死因子(TNF)家族成員、TNF-α ,TNF-β (淋巴細(xì)胞毒素、 LT)、TRAIL、Fas, LIGHT、41BB、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、胰島素、血漿銅藍(lán)蛋白、 HIV-tat、包含RGD序列基序的肽或蛋白、單糖、二糖、寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、巖藻糖或 乙酰神經(jīng)氨酸。除了別的以外，實(shí)施的方法包括，接觸需要抑制、減少或預(yù)防細(xì)胞(例如，高度增 殖細(xì)胞或不良增殖細(xì)胞)的增殖、存活、分化、死亡或活性的對(duì)象。示范性的對(duì)象包括患有 或可能罹患不良或異常細(xì)胞增殖的對(duì)象；患有或可能罹患良性增生的對(duì)象；或者非轉(zhuǎn)移性 或轉(zhuǎn)移性贅生瘤、癌癥、重量或惡性腫瘤(例如，實(shí)體或液態(tài)瘤，骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、 癌、肉瘤、黑素瘤、神經(jīng)的、網(wǎng)狀肉皮的和造血的贅生瘤)。根據(jù)本發(fā)明，額外提供了治療患有高度增殖紊亂的對(duì)象的方法和治療患有贅生 瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤(轉(zhuǎn)移性、非轉(zhuǎn)移性或良性)的對(duì)象的方法。在不同的實(shí)施方式 中，一種方法包括，向?qū)ο笫┯脭?shù)量上足以治療高度增殖紊亂的融合構(gòu)建體；以及向?qū)ο笫?用數(shù)量上足以減少或抑制贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤的增殖的融合構(gòu)建體。這些方法包括治療患有或可能罹患轉(zhuǎn)移瘤的對(duì)象。例如，可有效減少或抑制腫瘤、 癌癥或贅生瘤擴(kuò)散或散播至對(duì)象體內(nèi)的其它位點(diǎn)、局部或區(qū)域的一定量的融合構(gòu)建體。在 不同的實(shí)施方式中，一種方法減少或抑制原發(fā)腫瘤或癌癥轉(zhuǎn)移至一個(gè)或多個(gè)其它位點(diǎn)、轉(zhuǎn) 移瘤在一個(gè)或多個(gè)其它位點(diǎn)、局部或區(qū)域形成或確立(establishment)，從而減少或抑制腫 瘤或癌癥復(fù)發(fā)或者腫瘤或癌癥的進(jìn)展。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，一種方法減少或抑制潛在 或者已經(jīng)形成轉(zhuǎn)移的腫瘤或癌癥細(xì)胞(例如，散播腫瘤細(xì)胞)的生長(zhǎng)、增殖、遷移或侵染； 減少或抑制由原發(fā)腫瘤或癌癥產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移瘤在不同于該原發(fā)腫瘤或癌癥的位點(diǎn)、局部或區(qū) 域的形成或確立；減少或抑制轉(zhuǎn)移瘤形成或確立之后該轉(zhuǎn)移瘤在不同于該原發(fā)腫瘤或癌癥的一個(gè)或多個(gè)其它位點(diǎn)、局部或區(qū)域的生長(zhǎng)或增殖；或者減少或抑制該轉(zhuǎn)移瘤形成或確立 之后其它轉(zhuǎn)移瘤的形成或確立。在仍然另一實(shí)施方式中，一種方法減少或抑制了贅生瘤、腫 瘤、癌癥或惡性腫瘤的復(fù)發(fā)或進(jìn)展。根據(jù)本發(fā)明，還進(jìn)一步提供了減少或抑制贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移至其 它位點(diǎn)或者轉(zhuǎn)移性贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤在遠(yuǎn)離原發(fā)贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫 瘤的其它位點(diǎn)的形成或確立的方法。在不同的實(shí)施方式中，一種方法包括向?qū)ο笫┯米阋?減少或抑制贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移至其它位點(diǎn)或者轉(zhuǎn)移性贅生瘤、腫瘤、癌癥 或惡性腫瘤在遠(yuǎn)離原發(fā)贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤的其它位點(diǎn)的形成或確立的一定量 的融合構(gòu)建體?？筛鶕?jù)本發(fā)明治療的贅生瘤、腫瘤、癌癥和惡性腫瘤包括實(shí)體細(xì)胞量、造血細(xì)胞或 癌、肉瘤(例如，淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤或纖維肉 瘤)、淋巴瘤、白血病、腺瘤、腺癌、黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、 成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤、間皮瘤、網(wǎng)狀內(nèi)皮的、淋巴的或造血的(例 如，骨髓瘤、淋巴瘤或白血病)贅生瘤、腫瘤、癌癥和惡性腫瘤。可根據(jù)本發(fā)明治療的贅生瘤、腫瘤、癌癥和惡性腫瘤包括可存在于或感染肺(小 細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌)、甲狀腺、頭或頸、鼻咽、喉、鼻或竇、腦、脊柱、乳腺、腎上腺、腦垂 體腺、甲狀腺、淋巴腺、胃腸的(嘴、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸(小腸)、結(jié)腸、直腸)、 泌尿生殖道(子宮、卵巢、子宮頸、子宮內(nèi)膜、膀胱、睪丸、陰莖、前列腺)、腎、胰腺、肝、骨、骨 髓、淋巴腺、血液、肌肉、皮膚或干細(xì)胞贅生瘤、腫瘤、癌癥和惡性腫瘤。這些方法可與其它的治療或療法(例如，手術(shù)切除、放射療法、電離或化學(xué)放射療 法、化學(xué)療法、免疫療法、局部或區(qū)域熱(高熱)療法或疫苗接種)一起實(shí)施。該種治療或 療法可在施用融合構(gòu)建體之前、同時(shí)(單獨(dú)或在混合物中)或之后施用。在一個(gè)實(shí)施方式 中，一種方法包括施用抗細(xì)胞增殖、抗贅生瘤、抗腫瘤、抗癌癥或免疫增強(qiáng)治療或療法。在進(jìn) 一步的實(shí)施方式中，一種方法包括施用烷化劑、抗代謝物、植物提取物、植物生物堿、亞硝基 脲、激素、核苷酸或核苷酸類似物；環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素A、強(qiáng)的松龍、苯丙氨酸氮 芥、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、、 5-氮胞苷(5-AZC)和5-氮胞苷相關(guān)化合物、博來(lái)霉素、放射菌素D、光神霉素、絲裂霉素C、 卡氮芥、環(huán)己亞硝脲、司莫司汀、鏈脲菌素、羥脲、順式鉬氨、卡鉬、草酸鉬、米托坦、甲基芐 胼、氮烯唑胺、紫杉酚、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、阿霉素或二溴甘露醇、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、(依 立替康、托泊替康、依托泊甙、替尼泊甙)、吉西他濱、培美曲塞等。細(xì)胞或免疫療法包括淋巴 細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)狀細(xì)胞、T-細(xì)胞、NK細(xì)胞或B-細(xì)胞；抗體、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞 存活因子、細(xì)胞分化因子、細(xì)胞因子或趨化因子(范例為白細(xì)胞介素IL-2、IL_1 α ,IL-I β、 IL-3、IL-6、IL-7、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GMCSF)、IFNi、IL-12、TNF-α、 TNFβ ,MIP-ΙαMIP-I β、RANTES、SDF-1、MCP-1、MCP_2、MCP_3、MCP_4、嗜酸粒細(xì)胞親合素、 嗜酸粒細(xì)胞親合素 _2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-I、HCC-2、HCC-3、LARC/MIP-3 α、PARC、TARC、 CKβ、0(β 6、CK3 7、CK3 8、CK3 9、CK3 ΙΙΧΚβ 12、C10、IL_8、GR0 α、GR0 3、ENA_78、GCP_2、 PBP/CTAPIII β -TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-l 或淋巴細(xì)胞趨化因子)等。其它適用于融合構(gòu)建體的藥劑為靶向藥物或者生物藥劑如抗體或小分子。單 克隆抗體的非限制性范例包括利妥昔單抗(Rituxan )、曲妥單抗(Herceptin)、貝伐單抗(Avastin)、西妥昔單抗(Erbitux)、阿侖單抗(Campath)、帕木單抗(Vectibix)、替伊 莫單抗(Zevalin)、托西莫單抗(Bexxar)等，其可特別與本發(fā)明的融合構(gòu)建體聯(lián)用。適 合與該融合構(gòu)建體聯(lián)用的其它靶向藥物為伊馬替尼(Gleevec)、吉非替尼(Iressa)、硼替 佐米(Velcade)、拉帕替尼(Tykerb)、舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nevaxar)、尼羅替尼 (Tasigna)等。本發(fā)明的方法包括向?qū)ο筇峁┮嫣?。在特定的?shí)施方式中，一種治療方法導(dǎo)致了 贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞量、體積、大小或細(xì)胞數(shù)量的破壞，刺激、誘導(dǎo)或增加贅生瘤、 腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞壞死、溶解或凋亡，減少贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤體積大小、細(xì) 胞量，抑制或防止贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤體積、量、大小或細(xì)胞數(shù)量的進(jìn)展或增加， 或者延長(zhǎng)壽命；導(dǎo)致與該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤相關(guān)或由其引起的不良癥狀或并發(fā) 癥的嚴(yán)重性、持續(xù)時(shí)間或頻率的減少或下降；導(dǎo)致疼痛、不適、惡心、虛弱或嗜睡的減少或下 降；或者導(dǎo)致更高的精力、食欲、改善的靈活性或心理狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明，還額外提供了減少動(dòng)物生育力的方法；治療或減少子宮內(nèi)膜異位、兩 性前列腺增生、纖維瘤或息肉的方法。在不同的實(shí)施方式中，一種方法包括向動(dòng)物(例如， 哺乳動(dòng)物，如人)施用足以減少生育力的一定量的融合構(gòu)建體；向動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物，如 人)施用足以治療或減少子宮內(nèi)膜異位的一定量的融合構(gòu)建體；向動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物， 如人)施用足以治療或減少良性前列腺增生的一定量的融合構(gòu)建體；以及向動(dòng)物(例如，哺 乳動(dòng)物，如人)施用足以治療或減少纖維瘤或息肉的一定量的融合構(gòu)建體。可根據(jù)該方法治療的對(duì)象包括哺乳動(dòng)物。在特定的實(shí)施方式中，該對(duì)象為人。


圖1顯示了 LHRH_Phor21比Phor21_ β CG_ala更快殺死癌癥細(xì)胞。人乳腺癌細(xì)胞 (MDA-MB-435S. luc，不同傳代次數(shù))與 Phor21_ β CG-ala 或 LHRH_Phor21 進(jìn)行孵育。圖2顯示了與Phor21_ β CG-ala相比，在溶解結(jié)構(gòu)域具有21 (Phor21)、 18 (Phorl8 (338983) = CLIP71)和15(Phorl5)個(gè)氨基酸的融合構(gòu)建體對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。圖3顯示了 β CG-ala和LHRH融合構(gòu)建體對(duì)MDA-MB-435S. Iuc細(xì)胞的細(xì)胞毒性 (微摩爾IC5tl)。融合構(gòu)建體比圖右所列的Wior21-0CG-ala對(duì)MDA-MB-435S. Iuc細(xì)胞更具 毒性。圖4顯示了 LHRH融合構(gòu)建體對(duì)MDA_MB_435S. Iuc細(xì)胞的細(xì)胞毒性(微摩爾 IC50)。該融合構(gòu)建體為323033 = Phor21-β CG-ala、337479 = LHRH_Phor21、337480 = Phor21-LHRH、338611 = D-ala-Phor21_LHRH、338612 = Phor18-ASAAS-LHRH,338613 = Phor 18-LHRH、339385 = D-ala-Phorl8_LHRH 和 339347 = Phorl8-柳菩林。圖5顯示了相比Wior21-0CG_ala，β CG_ala和LHRH融合構(gòu)建體對(duì)人紅細(xì)胞 的急性溶血活性(微摩爾HA50)。除7 LHRH-Phor21、Phor21-LHRH和Phor 18-柳菩林 (QHWSY(D-Leu)LRPNEt =柳菩林)，所有的融合構(gòu)建體具有明顯低于Wior21_ β CG-ala的溶 血活性。圖6顯示了細(xì)胞毒性和溶血活性的比較。箭頭所指的肽比Phor21_i3 CG-ala對(duì)細(xì) 胞更具毒性。圖7是一個(gè)治療計(jì)劃綱要。
圖8A-8J是以3個(gè)β CG結(jié)合物相比未結(jié)合的Phor21、未結(jié)合的Phorl8 (338983) =(CLIP71)以及(KKKFAFA) 3結(jié)合物(338984)在治療過(guò)程中和研究終點(diǎn)的腫瘤 狀態(tài)綜述。融合構(gòu)建體代碼 33 = Phor21 β -CG-ala ；76 = Phorl8-β CG-ala ； 81 = D-ala-Phor21-β CG-ala ；85 = D-ala-Phorl8-LHRH ；47 = Phorl8-柳菩林； 13 = Phorl8-LHRH ； 11 = D-ala-Phor21_LHRH ； 12 = Phor18-ASAAS-LHRH ；71 = Phorl5-0 CG-ala ；以及74 = Phorl5-C6_ β CG-ala，代碼之后是本研究中所用的構(gòu)建體的 量。圖9A-9H顯示了在最多30天的指定時(shí)間段內(nèi)A) Phor21_ β CG-ala (33) ；B) D-ala-Phor21-LHRH(ll) ；C)Phorl8-柳菩林(47) ；D)Phor18-ASAAS-LHRH(12) ；Ε) Phorl8-LHRH(13) ；F) (KKKFAFA) 3"LHRH ；G) D-ala-Phor 18-LHRH(85)相對(duì)鹽水和基線值以及 H)相對(duì)于基線的治療組腫瘤體積。圖10A-10E顯示了采用5種LHRH結(jié)合物相比Phor21_ β CG-ala在研究終點(diǎn) 對(duì)A)腫瘤重量、B)相比基線的腫瘤重量變化、C)活腫瘤細(xì)胞總數(shù)、D)相比基線的活腫 瘤細(xì)胞總數(shù)變化以及E)體重的腫瘤狀態(tài)的綜述。338614 = (KKKFAFA)3LHRH、338612 = Phorl8-ASAAS-LHRH、338613 = Phorl8_LHRH和 339385 = D-ala-Phorl8_LHRH。圖11顯示了與上升濃度的Wior21_i3 CG-ala在指定量的阿霉素存在下孵育的具 有多重耐藥性的卵巢癌細(xì)胞(0VCAR 3)以及在最高阿霉素濃度下由該組合得到的因子為 200的細(xì)胞殺死增毒作用。圖12顯示了 LHRH和Phor21以及β CG和Phor21融合構(gòu)建體對(duì)CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵 巢)和TM4細(xì)胞的細(xì)胞毒性，與對(duì)MDA-MB-435S. Iuc細(xì)胞的細(xì)胞毒性相比。TM4細(xì)胞為L(zhǎng)HRH 受體陰性，CHO細(xì)胞為CG受體陰性，MDA-MB-435S. Iuc細(xì)胞表達(dá)LHRH和CG受體。發(fā)明詳述本發(fā)明至少部分基于融合構(gòu)建體，該融合構(gòu)建體包括連接或融合至第二結(jié)構(gòu)域結(jié) 合部分的第一結(jié)構(gòu)域溶解部分。在一個(gè)典型的結(jié)構(gòu)中，融合構(gòu)建體第一結(jié)構(gòu)域包括溶解部 分，其直接或間接對(duì)細(xì)胞具有毒性，從而可以減少細(xì)胞增殖或存活或者刺激、誘導(dǎo)、增加或 促進(jìn)細(xì)胞死亡、殺死或凋亡；而融合構(gòu)建體第二結(jié)構(gòu)域包括靶向細(xì)胞的部分，稱為結(jié)合部分 實(shí)體。根據(jù)本發(fā)明，提供了融合構(gòu)建體，其包括第一“溶解”結(jié)構(gòu)域或由其組成，且包括了 第二 “靶向”或“結(jié)合”結(jié)構(gòu)域或由其組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體包含由包含選 自例如 KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、 KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的 肽序列(選自氨基酸，例如賴氨酸=K、苯丙氨酸=F，丙氨酸=A)的12、13、15、16、17、 18、19、20、22、23、24、25、26、27或觀殘基L-或D-氨基酸序列組成的第一結(jié)構(gòu)域以及 包含靶向或結(jié)合部分或由其組成的第二結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體包含 第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，第一結(jié)構(gòu)域由選自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、 KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的L-或D-氨基酸序列組成，第二結(jié)構(gòu)域包含靶向或結(jié) 合部分或者由其組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體包含由選自KFAKFAKKFAKFAKK、 KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF,KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的 L-或 D-氨基酸序列組成的 第一結(jié)構(gòu)域和由不同于所述第一結(jié)構(gòu)域的1-25L-或D-氨基酸序列(例如，靶向或結(jié)合部 分)組成的第二結(jié)構(gòu)域，或由該第一和第二結(jié)構(gòu)域組成。此處所用的術(shù)語(yǔ)“融合”或“嵌合”及其語(yǔ)法上的變體在指代構(gòu)建體時(shí)表示該構(gòu)建 體包含從彼此不同且在自然界中一般不同時(shí)存在的兩個(gè)分子實(shí)體所衍生、獲得、分離、基于 其獲得或者構(gòu)造的部分。即，例如，融合構(gòu)建體的一個(gè)部分包含溶解部分或由其組成，且該 融合構(gòu)建體的第二部分包含靶向部分(例如具有結(jié)合能力的部分)或由其組成，第一和第 二結(jié)構(gòu)域的每個(gè)結(jié)構(gòu)上不同。融合構(gòu)建體還可被稱為“結(jié)合物”，其中結(jié)合物包含第一結(jié)構(gòu) 域溶解部分和第二結(jié)構(gòu)域靶向或結(jié)合部分，或者由其組成。融合構(gòu)建體的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域包括氨基酸序列(肽、多肽、蛋白、凝集 素)、核酸(DNA、RNA)和碳水化合物(糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、乙酰神經(jīng)氨酸 等)，或由其組成。術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”、“蛋白”、“多肽”和“肽”可互換使用，表示通過(guò)酰 胺鍵或同等方式共價(jià)連接的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸或“殘基”?？赏ㄟ^(guò)非天然和非酰胺化學(xué)鍵 連接的氨基酸序列包括，例如，以戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來(lái)酰亞胺或N， N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)形成的氨基酸序列。非酰胺鍵包括，例如，南五味子酮、氨基 亞甲基、烯烴、醚、硫醚等(參見(jiàn)，例如 Spatola in Chemistry andBiochemistry of Amino Acids, Perptides and Proteins, Vpl.7, pp267~357(1983) , "Peptide and Backbone Modifications, "MarcelDecker, NY)。融合構(gòu)建體或嵌合體的第一和第二結(jié)構(gòu)域包括L-氨基酸序列、D-氨基酸序列和 具有L-氨基酸和D-氨基酸混合物的氨基酸序列。第一和第二結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可具有 線性或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合至不同的部分(例如，第三、第四、第五、第六、第七等結(jié)構(gòu)域)，形成 分子內(nèi)或分子間二硫鍵，且還可形成具有相同或不同氨基酸序列或其它分子的更高的多聚 體或低聚體。示范性的融合構(gòu)建體的長(zhǎng)度為從約5至15，20至25，25至50，50至100，100至 150，150至200或200至300或更多個(gè)氨基酸殘基。在特定的實(shí)施方式中，第一和第二結(jié) 構(gòu)域包含約 1-10、10-20、15-20、20-30、30-40、40-50、60-70、70-80、80-90、90-100 或更多
殘基的氨基酸序列，或由其組成。在更特定的實(shí)施方式中，第一結(jié)構(gòu)域由15、16、17、18、19、 20,28或更多個(gè)殘基的氨基酸序列組成。融合構(gòu)建體第一結(jié)構(gòu)域單獨(dú)地或與第二結(jié)構(gòu)域聯(lián)合形成兩親α-螺旋。兩親 α-螺旋在該α-螺旋一側(cè)主要包含親水氨基酸，而在另一側(cè)主要包含疏水氨基酸。由于 α -螺旋中每3. 6個(gè)殘基形成一個(gè)完全的旋轉(zhuǎn)，兩親α -螺旋的氨基酸序列每3-4個(gè)殘基進(jìn) 行親水和疏水殘基的交替。ΡΝΝΡΝΝΡ重復(fù)模式或基序預(yù)計(jì)形成兩親α-螺旋，其中P代表帶 正電氨基酸殘基，而N代表中性氨基酸殘基。ΡΝΝΡΝΝΡ重復(fù)模式為溶解肽結(jié)合至帶負(fù)電荷細(xì) 胞膜提供了陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)，并為膜相互作用/穿透提供了疏水位點(diǎn)。融合構(gòu)建體從而包 含可形成兩親α -螺旋的具有一個(gè)或多個(gè)未中斷ΡΝΝΡΝΝΡ重復(fù)模式或基序或者一個(gè)或多個(gè) 中斷的ΡΝΝΡΝΝΡ重復(fù)模式或基序的第一結(jié)構(gòu)域。例如，具有未中斷和中斷的ΡΝΝΡΝΝΡ重復(fù) 基序的 15 或 18 殘基氨基酸序列(如 KFAKFAKKFAKFAKK 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAK)。融合構(gòu)建體第二結(jié)構(gòu)域，例如靶向或結(jié)合部分，包括配體、抗體(或其抗原結(jié)合 片段)、抗原、整合素、整合素受體(例如，包含“RGD”序列基序的蛋白或肽，以及胞外基質(zhì)
18(ECM)中的成分，例如單糖、二糖或寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、乙酰神經(jīng)氨酸)、生 長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子以及能結(jié)合受體、抗體、抗原、整合素、整合素受體(例如，包含 “RGD”序列基序的蛋白或肽，以及胞外基質(zhì)(ECM)中的成分，例如單糖、二糖或寡糖、涎酸、 半乳糖、甘露糖、巖藻糖、乙酰神經(jīng)氨酸)、生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞因子受體以及趨化因子受體 的靶向和結(jié)合部分，或由其組成?！笆荏w”通常存在于細(xì)胞上(例如，膜受體)或細(xì)胞內(nèi)。受體可以結(jié)合在細(xì)胞膜表 面上或者跨域細(xì)胞膜。例如，受體蛋白可具有跨細(xì)胞膜的跨膜結(jié)構(gòu)域，可選地具有細(xì)胞質(zhì) 部分或胞外部分或者兩者。因此受體包括具有包含胞外、跨膜或細(xì)胞質(zhì)部分的全長(zhǎng)完整天 然受體，及其截短形式或片段(例如，單獨(dú)的胞外、跨膜或細(xì)胞質(zhì)部分或受體子序列或其組 合)。例如，可溶性受體通常缺失跨膜部分，且可選地還可缺失所有或部分的天然胞外或細(xì) 胞質(zhì)區(qū)域(如存在于天然受體)。該種截短的受體形式和片段可至少保留部分對(duì)配體的結(jié)
I=I O特別或非特別地，融合結(jié)構(gòu)域的靶向和結(jié)合部分結(jié)構(gòu)域包含結(jié)合至受體的任意實(shí) 體(稱為受體配體)，或由其組成。靶向或結(jié)合部分的非限制性范例因而包括激素、激素類 似物、結(jié)合至激素受體的激素或激素類似物片段、生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子類似物、結(jié)合至受體 的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子類似物片段、結(jié)合至激素或激素受體的激素受體或配體，以及結(jié)合 至激素、激素類似物、結(jié)合至激素受體的激素或激素類似物片段、結(jié)合至激素或激素受體的 激素受體或配體、生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子類似物、結(jié)合至受體的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子類似物片 段、結(jié)合至生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體的生長(zhǎng)因子受體或配體的靶向和結(jié)合部分?？捎米鹘Y(jié)合部分的示范性激素包括促性腺激素釋放激素I、促性腺激素釋放激素 II、八目鰻I(yíng)II促黃體激素釋放激素、促黃體激素β鏈、促黃體激素(LH)、絨毛膜促性腺激 素(CG)、絨毛膜促性腺激素β -亞單位(β -或β -CG)、促黑色素細(xì)胞激素、雌二醇、乙烯雌 酚、多巴胺、生長(zhǎng)激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮質(zhì)激素、雌激素、睪丸激素、雄烯 二酮、二氫睪丸激素、脫氫表雄酮、黃體酮、雄性激素及其衍生物?？捎米鹘Y(jié)合部分的示范性 激素受體包括促性腺激素釋放激素I受體、促性腺激素釋放激素II受體、八目鰻I(yíng)II促黃 體激素釋放激素受體、促黃體激素受體、絨毛膜促性腺激素受體、促黑色素細(xì)胞激素受體、 雌二醇受體、多巴胺受體、生長(zhǎng)激素抑制素受體、促卵泡成熟激素(FSH)受體、表皮生長(zhǎng)因 子(EGF)受體、生長(zhǎng)激素(GH)受體、Her2-neU受體、糖皮質(zhì)激素激素受體、雌激素受體、睪 丸激素受體、黃體酮受體和雄性激素受體。示范性生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、生長(zhǎng)激素(GH)和Herf-neu。示范性生 長(zhǎng)因子受體包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體、生長(zhǎng)激素(GH)受體和Her2-neu受體、IGF-I。靶向或結(jié)合部分的特定非限制性范例包括LHRH、LHRH功能性(結(jié)合)片段、 LHRH類似物以及i3CG、β CG功能性(結(jié)合)片段和β CG類似物。LHRH是一種全功能配 體，并可通過(guò)配體受體相互作用產(chǎn)生藥理作用，例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化。β CG-ala是 能夠結(jié)合至細(xì)胞膜而不會(huì)導(dǎo)致任何藥理作用的hCG片段。靶向或結(jié)合部分的特定非限制 性范例包括如下包含或列舉的氨基酸序列，或由該氨基酸序列組成SYAVALSAQAALARR ； SYAVALSAQAALARRA,其為 β CG 的片段，以及 QHWSYGLRPG，其為 LHRH 序列。靶向和結(jié)合部分進(jìn)一步包括特別或優(yōu)先在贅生瘤、腫瘤或癌癥細(xì)胞或者與贅生 瘤、腫瘤或癌癥細(xì)胞相關(guān)的淋巴管或血管中表達(dá)的配體的抗原。該種抗原可被統(tǒng)稱為“腫瘤相關(guān)抗原”或“TAA”，并包括癌胚抗原(CEA)、α-胎兒球蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原 (PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、CA-125(殘留上皮卵巢癌)、可溶性白介素-2(IL-2)受 體、RAGE-1、酪氨酸酶、MAGE-l、MAGE-2、NY-ES0-l、Melan-A/MART-l、糖蛋白(gp) 75、gplOO、 3-連環(huán)蛋白、？肌1^、]\0\1-1、2卩卩161、類泛素-1、!1( -86、￥8-1、骨粘連蛋白以及ILF3、IGF_1 等等。可被靶向的其它抗原為 CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、 ⑶70、⑶154、類免疫球蛋白受體等。靶向和結(jié)合部分還包括鐵傳遞蛋白、葉酸及其衍生物(例如，葉酸)以及腫瘤壞死 因子(TNF)家族成員和TNF受體，例如TNF-α、TNF-β (淋巴細(xì)胞毒素、LT)、TRAIL、Fas、 LIGHT、41BB。第二結(jié)構(gòu)域包含靶向或結(jié)合結(jié)構(gòu)域或由其組成的融合構(gòu)建體可以結(jié)合至生成或 表達(dá)能結(jié)合該第二結(jié)構(gòu)域的抗原、受體或配體、整合素、抗體或抗原或者TAA的細(xì)胞。細(xì)胞 的非限制性范例包括高度增殖細(xì)胞和顯示異?；虿涣几叨仍鲋车募?xì)胞。在特定的非限制性 范例中，該種細(xì)胞包括非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性贅生瘤、癌癥、腫瘤和惡性細(xì)胞，以及散播的贅生 瘤、癌癥、腫瘤和惡性細(xì)胞以及休眠的贅生瘤、癌癥、腫瘤和惡性細(xì)胞。以相對(duì)于正?；蛘?非高度增殖細(xì)胞的升高水平表達(dá)抗原、受體、配體、整合素、TAA等的細(xì)胞為該種細(xì)胞提供了 選擇性。因此，靶向或結(jié)合部分可結(jié)合至在高度增殖細(xì)胞(例如，非轉(zhuǎn)移性或轉(zhuǎn)移性贅生 瘤、癌癥、腫瘤和惡性腫瘤，以及散播和休眠的贅生瘤、癌癥、腫瘤和惡性細(xì)胞)中表達(dá)或由 該高度增殖細(xì)胞生成的，但在正?；蚍歉叨仍鲋臣?xì)胞中不可測(cè)表達(dá)或者以相對(duì)更低的水平 生成或表達(dá)的抗原、受體、配體、整合素或TAA，從而優(yōu)選靶向高度增殖細(xì)胞。表達(dá)抗原、受 體、配體、整合素或TAA的非限制性示范細(xì)胞和組織類型包括乳腺、卵巢、子宮、子宮頸、前 列腺、睪丸、腎上腺、腦垂體、胰腺、肝臟、胃腸的、皮膚、肌肉或子宮內(nèi)膜細(xì)胞。結(jié)合部分的其它范例包括抗體和抗體片段。“抗體”指任意單克隆或多克隆免疫球 蛋白分子，例如IgM、IgG、IgA、IgE、IgD及任意其亞類。IgG的示范性亞類為IgG1UgG2UgG3 及IgG4。抗體包括由細(xì)胞(例如B細(xì)胞)生成或表達(dá)的抗體?？贵w片段或子序列指相對(duì)于全 長(zhǎng)抗體至少保留部分抗原結(jié)合能力的全長(zhǎng)抗體的部分。示范性的抗體片段包括Fab、Fab’、 F(ab，)2、Fv、Fd、單鏈 Fv(scFv)、二硫鍵連接的 Fvs (sdFv)、Vl、Vh、三特異性(Fab3)、雙特異 性(Fab2)、雙特異抗體((Vl-Vh) 2或(Vh-Vl) 2)、三特異抗體(三價(jià))、四特異抗體(四價(jià))、微 抗體((scFv_Ch3)2)、雙特異性單鏈 Fv(Bis-scFv)、IgGdeltaCH2、scFv-Fc、(ScFv)2-Fc 或完 整免疫球蛋白的其它抗原結(jié)合片段。融合構(gòu)建體包括在氨基末端具有第一結(jié)構(gòu)域和在羧基末端具有第二結(jié)構(gòu)域的那 些。融合構(gòu)建體還包括在羧基末端具有第一結(jié)構(gòu)域和在氨基末端具有第二結(jié)構(gòu)域的那些。 當(dāng)存在額外的結(jié)構(gòu)域(例如，第三、第四、第五、第六、第七等結(jié)構(gòu)域)時(shí)，第一結(jié)構(gòu)域相對(duì)于 第二結(jié)構(gòu)域定位在NH2-末端，或者第二結(jié)構(gòu)域相對(duì)于第一結(jié)構(gòu)域定位在NH2-末端。 還包括此處列舉的各種氨基酸序列，例如KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、 KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK或結(jié)合部分的子序列和氨基酸替換。在特定的實(shí)施方 式中，第一或第二結(jié)構(gòu)域的子序列具有至少5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35或更 多個(gè)氨基酸殘基。 因此，本發(fā)明包括了修飾或替換，例如對(duì)第一或第二結(jié)構(gòu)域或者第一和第二結(jié)構(gòu)域兩者的替換、添加或刪除。因而，包含肽序列第一或第二結(jié)構(gòu)域的融合構(gòu)建體可結(jié)合任意 數(shù)量的保守或非保守氨基酸替換，只要該種替換不破壞第一或第二結(jié)構(gòu)域的活性(溶解或 結(jié)合)。因此，例如，修飾的溶解部分(第一結(jié)構(gòu)域)可保留未修飾第一結(jié)構(gòu)域的至少部分 溶解活性，例如細(xì)胞殺死或凋亡，而修飾的結(jié)合部分或其類似物可保留未修飾結(jié)合部分的 至少部分結(jié)合活性?！氨Ｊ靥鎿Q”是一個(gè)氨基酸被生物、化學(xué)或結(jié)構(gòu)類似的殘基所替換。生物類似表示 該替換與生物活性(例如，溶解活性)相容。結(jié)構(gòu)類似表示該氨基酸具有類似長(zhǎng)度的側(cè)鏈， 如丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，或者具有類似的大小，或者保留了第一、第二或附加結(jié)構(gòu)域的 結(jié)構(gòu)(例如兩親α螺旋)。化學(xué)類似表示該殘基具有相同的電荷或均為親水或疏水。特定 的范例包括用一個(gè)疏水殘基(例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)替換另一個(gè)疏水殘 基，或者用一個(gè)極性殘基替換另一個(gè)極性殘基，例如用精氨酸替換賴氨酸，谷氨酸替換天冬 氨酸，或者用谷氨酰胺替換天冬酰胺，絲氨酸替換蘇氨酸等。常規(guī)測(cè)定可用于確定融合構(gòu)建 體變體是否具有活性，例如，溶解活性或結(jié)合活性。特定的范例包括肽第一或第二結(jié)構(gòu)域中一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，1-3、3_5、 5-10、10-20或更多個(gè))殘基的替換或刪除。修飾的融合構(gòu)建體可具有與參考序列 (例如，第一結(jié)構(gòu)域，例如 KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、 KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 或 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 或者第 二結(jié)構(gòu)域如結(jié)合部分)具有 50 %、60 %、70 %、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或更高一致性的肽序列。在特定的實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體包含肽第一結(jié)構(gòu)域，該肽第一結(jié)構(gòu)域包含了具 有選自 KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、 KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 以及 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的 肽的 12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27 或 28 個(gè)殘基的 L-或 D-氨基酸序列 或由其組成，其中一個(gè)或多個(gè)K殘基被F或L殘基的任意一個(gè)所替換，一個(gè)或多個(gè)F殘基 被K、A或L殘基的任意一個(gè)所替換，或者一個(gè)或多個(gè)A殘基被K、F或L殘基的任意一個(gè) 所替換。在另一特定的實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體包含肽第一結(jié)構(gòu)域，該肽第一結(jié)構(gòu)域由具 有選自 KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、 KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的 L-或D-氨基酸序列組成，其中一個(gè)或多個(gè)K殘基被F或L殘基的任意一個(gè)所替換，一 個(gè)或多個(gè)F殘基被K、A或L殘基的任意一個(gè)所替換，或者一個(gè)或多個(gè)A殘基被K、F或 L殘基的任意一個(gè)所替換；該融合構(gòu)建體還包含具有結(jié)合部分或由其組成的肽第二結(jié)構(gòu) 域。在進(jìn)一步的特定實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體包含肽第一結(jié)構(gòu)域，該肽第一結(jié)構(gòu)域由具有 選自 KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、 KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的 L-或 D-氨基酸序列組成，其中一個(gè)或多個(gè)K殘基被F或L殘基的任意一個(gè)所替換，一個(gè)或多個(gè) F殘基被K、A或L殘基的任意一個(gè)所替換，或者一個(gè)或多個(gè)A殘基被K、F或L殘基的任意 一個(gè)所替換；該融合構(gòu)建體還包含具有不同于該第一結(jié)構(gòu)域的1-25個(gè)L-或D-氨基酸序列 (例如，結(jié)合部分)組成的肽第二結(jié)構(gòu)域，或者該融合構(gòu)建體由該肽第一結(jié)構(gòu)域和肽第二結(jié) 構(gòu)域組成。
術(shù)語(yǔ)“一致性”和“同源性”及其語(yǔ)法變化指兩個(gè)或多個(gè)所指的實(shí)體相同。因此， 當(dāng)兩個(gè)氨基酸序列為一致時(shí)，它們具有相同的氨基酸序列。“一致的范圍、區(qū)域或結(jié)構(gòu)域”表 示兩個(gè)或多個(gè)所指實(shí)體中的部分相同。因此，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)序列區(qū)域的兩個(gè)氨基酸序列一 致或同源時(shí)，它們?cè)谶@些區(qū)域具有一致性。術(shù)語(yǔ)”互補(bǔ)性”在指核酸序列時(shí)表示參考區(qū)域具 有100%互補(bǔ)性，即，顯示了沒(méi)有錯(cuò)配的100%堿基配對(duì)。由于在結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)蛋白之間序列保留數(shù)量的變化，保留功能或活性所需的序 列一致性的數(shù)量依賴于該蛋白、區(qū)域和該區(qū)域的功能或活性(例如，溶解或結(jié)合)。例如，對(duì) 于溶解肽序列，可存在多個(gè)PNNPNNP序列重復(fù)模式或基序，但不需要存在一個(gè)或多個(gè)中斷 或未中斷PNNPNNP序列重復(fù)模式或基序兩個(gè)序列之間的一致性程度可通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序和數(shù)學(xué)算法得以 確定。該種計(jì)算序列一致性(同源性)百分比的算法通常可說(shuō)明比較區(qū)域的序列間隙 和錯(cuò)配。例如，BLAST(例如，BLAST 2.0)檢索算法(例如，參見(jiàn)Altschul等人，J. MoI. Biol. 215 :403(1990)，可從NCBI上公開(kāi)獲取)具有如下示范性檢索參數(shù)錯(cuò)配2 ；間隙開(kāi) 口 5 ；間隙延伸2。對(duì)于多肽序列比對(duì)，BLASTP算法通常組合使用計(jì)分矩陣，例如PAM100、 PAM 250、BLOSUM 62 或 BLOSUM 50。FASTA (例如，F(xiàn)ASTA2 和 FASTA3)禾口 SSEARCH 序列 比對(duì)程序同樣用于對(duì)一致性程度的定量(Pearson等人，Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85: 2444(1988) ；Pearson, Methods MoI Biol. 132 :185(2000)；以及 Smith 等人，J. MoI. Biol. 147 :195(1981))。采用基于Delaimay的拓?fù)溆成涞牡鞍捉Y(jié)構(gòu)相似性定量程序已被開(kāi) 發(fā)(Bostick 等人，Biochem Biophys Res Commun. 304 :320 (2003))。單獨(dú)的殘基和第一、第二和附加結(jié)構(gòu)域可通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵連接。共價(jià)鍵的 非限制性范例為酰胺鍵、非天然和非酰胺化學(xué)鍵(其包括，例如，戊二醛，N-羥基琥珀酰亞 胺酯、雙功能馬來(lái)酰亞胺、N, N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或N，N’ - 二異丙基碳二亞胺 (DIC))。替代酰胺鍵的連接基團(tuán)包括，例如，南五味子酮(例如，-C( = 0)-CH2-或-C(= 0) -NH-)、氨基亞甲基(CH2-NH)、亞乙基、烯烴(CH = CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑 (CN4-)、噻唑、反酰胺(retroamide)、硫酰胺或酯(例如，參見(jiàn)Spatola(1983)于Chemistry and Biochemistryof Amino Acids, Peptides and Proteins.第 7 卷， 第 267-357 頁(yè)，“Peptide and Backbone Modifications, " Marcel Decker, NY)。第一和第二結(jié)構(gòu)域可通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵直接融合或結(jié)合在一起。第一和第二結(jié) 構(gòu)域可通過(guò)位于第一和第二結(jié)構(gòu)域之間的居間序列(例如鉸鏈、間隔子或接頭)分隔。在 一個(gè)實(shí)施方式中，第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)碳鏈連接。多碳鏈包括羧酸(例如二羧酸)如戊 二酸、琥珀酸和己二酸。在另一實(shí)施方式中，第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)該第一和第二結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸、 肽或非肽鉸鏈、間隔子或接頭連接。肽鉸鏈、間隔子或接頭序列可具有任意長(zhǎng)度，但通常在 約1-10、10-20、20-30、30-40或40-50氨基酸范圍內(nèi)。在特定的實(shí)施方式中，第一和第二結(jié) 構(gòu)域之間的肽鉸鏈、間隔子或接頭具有1-25個(gè)L-或D-氨基酸殘基或1-6個(gè)L-或D-氨基 酸殘基。包含在該第一和第二結(jié)構(gòu)域之間的序列中的特定氨基酸殘基包括C、A、S或G氨基 酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)。該第一和第二結(jié)構(gòu)域之間的肽的特定非限制性范例包括如下列舉 或包含的序列GSGGS、ASAAS或CCCCCC。氨基酸和肽的衍生物可位于該第一和第二結(jié)構(gòu)域 之間。氨基酸衍生物的特定非限制性范例為賴氨酸衍生物或6碳接頭如α-氨基-己酸。
具有或不具有鉸鏈、間隔子或接頭或者第三、第四、第五、第六、第七等結(jié)構(gòu)域的融 合構(gòu)建體可完全由合成、非天然氨基酸或氨基酸類似物組成或者可包含衍生形式。在不同 的實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體的第一或第二結(jié)構(gòu)域中包含一個(gè)或多個(gè)替換L-氨基酸的D-氨 基酸、D-氨基酸和L-氨基酸混合物或完全由D-氨基酸殘基組成的序列。融合構(gòu)建體可包含非天然結(jié)構(gòu)成分的任意組合，其通常來(lái)自三個(gè)結(jié)構(gòu)基團(tuán)a)非 天然酰胺鍵(“肽鍵”)連接的殘基連接基團(tuán)；b)代替天然存在氨基酸殘基的非天然殘基； 或者c)誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)擬態(tài)即，誘導(dǎo)或穩(wěn)定化二級(jí)結(jié)構(gòu)例如，α螺旋構(gòu)型的殘基。融合構(gòu)建 體包含環(huán)狀結(jié)構(gòu)例如分子的氨基和羧基末端之間的端至端酰胺鍵或者分子內(nèi)或分子間二 硫鍵。融合構(gòu)建體可被體外或體內(nèi)修飾，例如，通過(guò)翻譯后修飾以包含，例如，糖或碳水化合 物殘基、磷酸基團(tuán)、脂肪酸、脂質(zhì)等。添加的特定范例包括第三、第四、第五、第六或第七結(jié)構(gòu)域。具有第一和第二結(jié)構(gòu) 域的融合構(gòu)建體因而包含與其共價(jià)連接的一個(gè)或多個(gè)附加結(jié)構(gòu)域(第三、第四、第五、第 六、第七等)，從而賦予不同的或者補(bǔ)充的功能或活性。示范性的附加結(jié)構(gòu)域包括有助分離 的結(jié)構(gòu)域，其包括，例如，金屬鰲合肽(例如可支持在固定化金屬上純化的聚組氨酸束和組 氨酸-色氨酸模塊，可支持在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白A區(qū)域，以及可在FLAGS伸展 /親和純化系統(tǒng)使用的區(qū)域(Immunex Corp,Seattle WA))。在純化結(jié)構(gòu)域和融合構(gòu)建體間 可選地包含裂解序列如fe因子或腸激酶以用于幫助純化。例如，表達(dá)載體可包含連接至六 組氨酸殘基的編碼融合構(gòu)建體的核酸序列，后接硫氧還蛋白和腸激酶裂解位點(diǎn)。組氨酸殘 基促進(jìn)融合構(gòu)建體的檢測(cè)和純化，而腸激酶裂解位點(diǎn)提供從蛋白的剩余部分純化該構(gòu)建體 的手段(例如，參見(jiàn) Kroll，DNA Cell. Biol. 12 441 (1993)) 融合構(gòu)建體活性被各種因素影響，因此，融合構(gòu)建體可通過(guò)考慮一種或多種這些 因素進(jìn)行設(shè)計(jì)或優(yōu)化。該種因素包括，例如，融合構(gòu)建體的長(zhǎng)度，這可影響對(duì)細(xì)胞的毒性。具 體而言，Phor21-0 CG-ala和Phor21相比Phorl4_ β CG_ala可觀察到更高的細(xì)胞毒性。形 成溶解肽結(jié)構(gòu)域的α螺旋的細(xì)胞殺死活性還可依賴于該螺旋的穩(wěn)定性。鉸鏈和間隔子可 影響第一結(jié)構(gòu)域和肽溶解結(jié)構(gòu)域的螺旋結(jié)構(gòu)的膜相互作用。例如，更短的融合構(gòu)建體，例如 可選地包含間隔子或鉸鏈的小于21個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域，可由于更高的螺旋穩(wěn)定性而顯示 更高的細(xì)胞毒性。具體而言，間隔子如ASAAS和6氨基己酸可能會(huì)提高更短融合結(jié)構(gòu)域的 毒性。溶解肽結(jié)構(gòu)域的電荷(部分通過(guò)該結(jié)構(gòu)域中存在的特定氨基酸進(jìn)行確定)同樣影響 細(xì)胞殺死能力。該結(jié)合部分相對(duì)于該溶解結(jié)構(gòu)域的位置(N-或C-末端)也會(huì)影響融合構(gòu)建體的 細(xì)胞殺死活性。例如，相對(duì)于溶解結(jié)構(gòu)域處在C-末端的結(jié)合部分比相對(duì)溶解結(jié)構(gòu)域處在 N-末端時(shí)具有更大的細(xì)胞殺死活性。融合構(gòu)建體體內(nèi)半衰期可通過(guò)以一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸或衍生物構(gòu)建 融合構(gòu)建體肽結(jié)構(gòu)域以得到提高。例如，具有D-氨基酸的融合構(gòu)建體(例如，所有殘基中 高達(dá)30%或更多的殘基為D-對(duì)應(yīng)異構(gòu)體)耐受血清蛋白水解，因此可被激活更長(zhǎng)時(shí)間，從 而提高體內(nèi)效力。此外，用一個(gè)或多個(gè)非天然存在氨基酸或衍生物構(gòu)建融合構(gòu)建體肽結(jié)構(gòu) 域可以減少溶血活性。該種具有D-對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的融合構(gòu)建體還更容易在溶液中成為單體， 它們不會(huì)明顯聚集。根據(jù)本發(fā)明，提供了通過(guò)更低的IC5tl值(其代表了實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性所需的融合構(gòu)建體的量)確定的比Phor21- β CG-ala、Phor21-GSGGS- β CG_ala、 Phor21-ASAAS- β CG-ala或Wior 14- β CG-ala的一種或多種具有更大抗細(xì)胞增殖活性 的融合構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明，還提供了比Wior21-β CG-ala、Phor21-GSGGS-β CG-ala, Phor21-ASAAS-0CG-ala 或 Phor 14-β CG-ala 具有以 IC5(1/HA5(1 (溶血活性)比例表示的更 小溶血活性的融合構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供了以IC5tZHA5tl(溶血活性)比例表示小 于約0. 02,0. 01或0. 005的溶血活性的融合構(gòu)建體。實(shí)施例1中列舉了測(cè)定細(xì)胞毒性和溶 血活性的代表性測(cè)定條件。肽和類肽物(ρ印tidomimetics)可采用本領(lǐng)域已知的方法生成和分離。肽可通 過(guò)本領(lǐng)域已知的化學(xué)方法完全或部分合成(例如，參見(jiàn)Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215 ；Hom(1980) ；and Banga, Α. K. , Therapeutic Peptides and Proteins, FormulationProcessinR and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co., Lancaster，PA)。肽合成可通過(guò)多種固相技術(shù)實(shí)施(例如，參見(jiàn)Roberge Science 269 202(1995) ；Merrifield, Methods Enzymol. 289 :3 (1997))，而自動(dòng)合成可通過(guò)如 ABI 431A 肽合成儀(Perkin Elmer)根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明得以實(shí)現(xiàn)。肽和肽模擬物還可采用組合方法合 成。合成的殘基和多肽結(jié)合類似物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種步驟和方法合成(例如，參見(jiàn) OrRanic Syntheses Collective Volumes, Gilman,等人(Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY)。修飾的肽可通過(guò)化學(xué)修飾方法生成(例如，參見(jiàn)Belousov，Nucleic Acids Res. 25 3440(1997) ；Frenkel,Free Radic. Biol. Med. 19:373(1995) ；and Blommers,Biochemistry 33 :7886(1994)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼本發(fā)明的融合構(gòu)建體的核酸以及包含編碼融合 構(gòu)建體的核酸的載體。在特定的實(shí)施方式中，核酸編碼融合構(gòu)建體，其由第一和第 二結(jié)構(gòu)域組成，該第一結(jié)構(gòu)域由包含選自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、 KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的肽序列的 12、13、15、16、17、18、19、20、22、23、24、 25、26、27或28殘基氨基酸序列組成，第二結(jié)構(gòu)域包含靶向或結(jié)合部分或由其組成。在 另一實(shí)施方式中，核酸編碼融合構(gòu)建體，融合構(gòu)建體包含由選自KFAKFAKKFAKFAKK、 KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF、 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK 的氨基酸序列組成的第一 結(jié)構(gòu)域和包含靶向或結(jié)合部分或者由其組成的第二結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中， 核酸編碼融合構(gòu)建體，該融合構(gòu)建體包含由選自KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、 KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 和KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK的氨基酸序列組成的第一結(jié)構(gòu)域和由不同于所述第一 結(jié)構(gòu)域的1-25氨基酸序列(例如，靶向或結(jié)合部分)組成的第二結(jié)構(gòu)域，或由該第一和第 二結(jié)構(gòu)域組成。核酸，在此也可稱為基因、多聚核苷酸、核苷酸序列、引物、寡聚核苷酸或探針，表 示天然或修飾的任意長(zhǎng)度的含嘌呤和嘧啶聚合物，指多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸或 者混合的多核糖-多脫氧核糖核苷酸及其α-異構(gòu)形式。兩個(gè)或多個(gè)含嘌呤和嘧啶聚合物 通常通過(guò)磷酸酯鍵或其類似物進(jìn)行連接。這些術(shù)語(yǔ)可互換使用以表示所有形式的核酸，包 括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸可以是單鏈、雙鏈或三鏈，呈線性或環(huán)狀。核酸包括遺傳DNA、cDNA和反義。RNA核酸可以是剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA或反 義。核酸包括天然存在的、合成的以及核苷酸類似物和衍生物。作為遺傳密碼簡(jiǎn)并的結(jié)果，核酸包括針對(duì)編碼本發(fā)明的融合構(gòu)建體的序列簡(jiǎn)并的 序列。因此，提供了編碼融合構(gòu)建體的簡(jiǎn)并核酸序列。核酸可通過(guò)多種已知的標(biāo)準(zhǔn)克隆和化學(xué)合成方法生成，并可通過(guò)定點(diǎn)突變或本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的其它重組技術(shù)進(jìn)行有義的修飾。多聚核苷酸的純度可通過(guò)測(cè)序、凝膠電 泳、UV光譜測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)。核酸可被插入核酸構(gòu)建體，其中該核酸的表達(dá)受到表達(dá)控制元件”(在此稱為“表 達(dá)盒”)的影響或調(diào)節(jié)。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)控制元件”指調(diào)節(jié)或影響與之可操作連接的核酸序列表 達(dá)的一種或多種核酸序列元件。表達(dá)控制元件可在蛋白編碼基因前適當(dāng)?shù)匕▎?dòng)子、增 強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、基因沉默、起始密碼子(例如，ATG)等?？刹僮鞯剡B接至核酸序列的表達(dá)控制元件控制核酸序列轉(zhuǎn)錄，并適當(dāng)?shù)胤g核酸 序列。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指一種毗鄰(juxtaposition)，其中涉及的成分所處的關(guān)系允 許它們以其預(yù)期的方式作用。通常表達(dá)控制元件毗鄰在基因的5'或3'端，但也可以是內(nèi) 含子。表達(dá)控制元件包括可誘導(dǎo)(即，需要外部信號(hào)進(jìn)行激活)或可脫阻抑(即，需要 信號(hào)關(guān)閉激活；當(dāng)該信號(hào)不再存在時(shí)，轉(zhuǎn)錄被激活或“脫阻抑”)的組成性激活轉(zhuǎn)錄的元件。 本發(fā)明的表達(dá)盒中還包含了足以賦予基因表達(dá)針對(duì)特定細(xì)胞類型或組織的可控性的控制 元件(即，組織特異性控制元件)。該種元件通常位于編碼序列的上游或下游(即，5'和 3')。啟動(dòng)子通常位于編碼序列的5'。通過(guò)重組DNA或合成技術(shù)生成的啟動(dòng)子可用于提 供本發(fā)明的多聚核苷酸的轉(zhuǎn)錄?！皢?dòng)子”表示足以引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列元件。核酸可被插入質(zhì)粒以增殖進(jìn)入宿主細(xì)胞和進(jìn)行所需的后續(xù)遺傳操作。質(zhì)粒是能在 宿主細(xì)胞中穩(wěn)定增殖的核酸；質(zhì)?？梢钥蛇x地包含表達(dá)控制元件，以驅(qū)動(dòng)該核酸的表達(dá)。此 處所用的載體與質(zhì)粒同義，并可包含針對(duì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制元件。質(zhì)粒和載體 通常包含至少用以在細(xì)胞內(nèi)增殖的復(fù)制起始區(qū)和啟動(dòng)子。因此質(zhì)粒和載體可用于融合構(gòu)建 體編碼核酸的遺傳操作，生成融合構(gòu)建體或反義核酸，以及在宿主細(xì)胞或有機(jī)體中表達(dá)該 融合構(gòu)建體。細(xì)菌系統(tǒng)啟動(dòng)子包括T7和可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如噬菌體λ的pL、plac、ptrp、 ptac(ptrp-lac雜交啟動(dòng)子)以及四環(huán)素應(yīng)答啟動(dòng)子。昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)啟動(dòng)子包括組成的或 是可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(例如，蛻化素)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞組成型啟動(dòng)子包括SV40、RSV、牛乳頭瘤 病毒(BPV)和其它病毒啟動(dòng)子，或者由哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，金屬硫蛋白HA啟動(dòng)子；熱休克 啟動(dòng)子)或哺乳動(dòng)物病毒(例如，腺病毒晚期啟動(dòng)子；可誘導(dǎo)的小鼠乳房腫瘤病毒長(zhǎng)末端重 復(fù))的基因組獲得的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。替代性地，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可被遺傳修飾，以導(dǎo)入適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞并引導(dǎo)融合構(gòu)建體的表達(dá)。表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步包括經(jīng)設(shè)計(jì)在體內(nèi)使用的載體。特定的非限制性范例包括腺病毒 載體(美國(guó)專禾IJ 5，700, 470和5，731，172)，腺病毒相關(guān)載體(美國(guó)專利5，604，090)，單純 皰疹病毒載體(美國(guó)專利5，501，979)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(美國(guó)專利5，624，820，5，693，508 和5，674，703)，BPV載體(美國(guó)專利5，719，054)以及CMV載體(美國(guó)專利5，561，063)。酵母載體包含組成型和可誘導(dǎo)啟動(dòng)子(例如，參見(jiàn)Ausubel等人，In =CurrentProtocols in Molecular Biology, Vol.2，Ch. 13，ed.，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，1988 ；Grant 等 人 Methods in Enzymology,153 :516 (1987)， eds. Wu & Grossman :BitterMethods in Enzymology,152 :673 (1987)，eds.Berger & Kimmel, Acad. Press, N. Y.以及 Strathera 等人，The Molecular Bioloey of the YeastSaccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press，第 I 禾口 II 卷)?？墒褂媒M 成型酵母啟動(dòng)子如ADHesive或LEU2，或使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子如GAL(R. Rothstein In :DNA Clonina, A Practical Approach, Vol. 11，Ch. 3，ed. D. M. Glover, IRL Press，Wash.，D. C.， 1986)。通過(guò)同源性重組等方式促進(jìn)外源核酸序列整合進(jìn)入酵母染色體的載體已為本領(lǐng)域 所知。當(dāng)插入的多聚核苷酸對(duì)于常規(guī)載體而言過(guò)大時(shí)(例如，大于約12Kb)，?？墒褂媒湍?人工染色體(YAC)。表達(dá)載體還可包含賦予對(duì)選擇性壓力的耐受性或可鑒定標(biāo)記(例如，beta-半乳 糖苷酶)的選擇性標(biāo)記，從而允許細(xì)胞具有待選擇、生長(zhǎng)和擴(kuò)增的載體。替代性地，選擇性 標(biāo)記可位于伴隨含有編碼融合構(gòu)建體的核酸的第一載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞的第二載體 上。選擇系統(tǒng)包括但不限于可分別應(yīng)用于tk-，hgprt-或aprt-細(xì)胞的單純皰疹 病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11 :223 (1977))，次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (Szybalska 和 kybalski，Proc. Natl. Acad. Sci USA 48 :2026 (1962)),以及腺嘌呤磷酸核 糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人.，Cell 22 :8171980)基因。此外，抗代謝產(chǎn)物耐受可作為對(duì)可賦予 對(duì)氨甲喋呤的耐受性的 dhfr(0' Hare 等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 78:1527(1981))； 可賦予對(duì)霉酚酸耐受性的gpt基因(Mulligan等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 2072(1981))；可賦予對(duì)氨基糖苷G-418的耐受性的新霉素基因(Colberre-Garapin等 人，J. MoI. Biol. 150 :1(1981))；嘌呤霉素；以及可賦予對(duì)潮霉素耐受性的潮霉素基因 (Santerre等人，Gene 30:147(1984)選擇性的基礎(chǔ)。其它的選擇性基因包括trpB，其允 許細(xì)胞取代色氨酸利用吲哚；hisD，其允許細(xì)胞取代組氨酸利用histinol (Hartman等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :8047 (1988))；以及ODC (鳥(niǎo)氨酸脫羧酶)，其賦予對(duì)鳥(niǎo)氨酸脫 羧酶抑制劑，2-( 二氟甲基)-DL-鳥(niǎo)氨酸，DFMO的耐受性(McConlogue (1987) In =Current Communications in Molecular Biology, Cold SpringHarbor Laboratory)。還提供了表達(dá)融合構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，用編碼融合構(gòu)建體的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞 以及包含了編碼融合構(gòu)建體的核酸的載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。在 另一實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。在不同的方面，該真核細(xì)胞為酵母或哺乳動(dòng)物(例 如，人，靈長(zhǎng)動(dòng)物等)細(xì)胞。此處所用的“宿主細(xì)胞”是導(dǎo)入了核酸且能被增殖、表達(dá)轉(zhuǎn)錄或編碼核酸構(gòu)建體的 細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)還包括該宿主細(xì)胞的任意子代或亞克隆。宿主細(xì)胞包括表達(dá)融合構(gòu)建體的細(xì) 胞以及不表達(dá)融合構(gòu)建體的細(xì)胞。不表達(dá)融合構(gòu)建體的宿主細(xì)胞被用于增殖包含了編碼融 合構(gòu)建體或反義的核酸或載體。宿主細(xì)胞包括但不限于微生物(如細(xì)菌和酵母)，以及植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì) 胞。例如，以重組噬菌體核酸、質(zhì)粒核酸或粘粒核酸表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；以重組酵母表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化的酵母；以重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV ；煙草花葉病毒，TMV) 或以重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；以重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)，以重組病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，牛 痘病毒)感染的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，或經(jīng)過(guò)工程改造可瞬時(shí)或穩(wěn)定增殖或表達(dá)的轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞 系統(tǒng)。融合構(gòu)建體、編碼融合構(gòu)建體的核酸、表達(dá)融合構(gòu)建體或者以編碼融合構(gòu)建體編 碼的核酸轉(zhuǎn)化的載體和宿主細(xì)胞以及反義包括分離和純化的形式。術(shù)語(yǔ)“分離的”在修飾 本發(fā)明的組合物時(shí)表示該組合物通過(guò)人工制備或者基本完全或至少部分從天然存在的體 內(nèi)環(huán)境中分離。一般而言，分離的組合物基本不含一種或多種通常與之天然伴隨的物質(zhì)，例 如，一種或多種蛋白、核酸、脂質(zhì)、碳水化合物、細(xì)胞膜。術(shù)語(yǔ)“分離的”不排除該組合物的替 代物理形式，例如多聚體/低聚體、變體、修飾或衍生形式或由人工生成的宿主細(xì)胞中表達(dá) 的形式。術(shù)語(yǔ)“分離的”還不排除其組合中的任意一個(gè)由人工制備的形式(例如，藥物制劑 和組合物)。當(dāng)不含部分、大量、基本所有通常與之天然相伴的物質(zhì)時(shí)，“分離的”組合物也可以 是”純化的”。因此，基本純的分離的融合構(gòu)建體不包含數(shù)百萬(wàn)種其它序列的多肽或多聚核 苷酸，例如在蛋白庫(kù)中的蛋白或在基因組或cDNA庫(kù)中的核酸?！凹兓摹苯M合物可結(jié)合一種 或多種其它分子。根據(jù)本發(fā)明，提供了融合構(gòu)建體的混合物或組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，混合物包 含一種或多種融合構(gòu)建體以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。在另一實(shí)施方式中，混合物包 含一種或多種融合構(gòu)建體和抗細(xì)胞增殖、抗腫瘤、抗癌或抗贅生瘤的治療或藥劑。在進(jìn)一步 的實(shí)施方式中，混合物包含一種或多種融合構(gòu)建體和免疫增強(qiáng)劑。還提供了例如一種或多 種融合構(gòu)建體在藥學(xué)可接受的載體或賦形劑中與一種或多種抗細(xì)胞增殖、抗腫瘤、抗癌或 抗贅生瘤的治療或藥劑以及免疫增強(qiáng)的治療或藥劑的組合。本發(fā)明的融合構(gòu)建體(例如包含具有第一溶解結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合部分結(jié)構(gòu)域的 氨基酸序列的多肽)可用于靶細(xì)胞的溶解、細(xì)胞死亡或凋亡。該種細(xì)胞可被選擇性靶向。例 如，表達(dá)受體、配體、抗原或抗體的細(xì)胞可被融合構(gòu)建體靶向，從而相對(duì)于表達(dá)更少受體、配 體、抗體或抗體的細(xì)胞更優(yōu)先被殺死。根據(jù)本發(fā)明，提供了減少或抑制細(xì)胞的增殖的方法，以及減少或抑制細(xì)胞增殖的 方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種方法包括將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制該細(xì)胞的增殖的 融合構(gòu)建體相接觸。在另一實(shí)施方式中，一種方法包括將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制細(xì) 胞增殖的融合構(gòu)建體相接觸。還提供了減少或抑制高度增殖細(xì)胞的增殖的方法，以及減少或抑制高度增殖細(xì)胞 的增殖的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種方法包括將高度增殖細(xì)胞(一種或多種)與數(shù)量 上足以減少或抑制增殖的融合構(gòu)建體相接觸。進(jìn)一步提供了減少或抑制非轉(zhuǎn)移性或轉(zhuǎn)移性贅生瘤、癌癥、腫瘤和惡性細(xì)胞的增 殖的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種方法包括將贅生瘤、癌癥、腫瘤或惡性細(xì)胞與數(shù)量上足 以減少或抑制該細(xì)胞的增殖的融合構(gòu)建體相接觸。還進(jìn)一步提供了減少或抑制休眠或非分裂非轉(zhuǎn)移性或轉(zhuǎn)移性贅生瘤、癌癥、腫瘤 和惡性細(xì)胞的增殖的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種方法包括將休眠或非分裂贅生瘤、癌 癥、腫瘤或惡性細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制該休眠或非分裂細(xì)胞的增殖的融合構(gòu)建體相 接觸。
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此外提供了選擇性減少或抑制表達(dá)受體、配體、抗體或抗原的細(xì)胞(例如，高度增 殖細(xì)胞)的增殖的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種方法包括將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑 制該細(xì)胞(例如，高度增殖細(xì)胞)的增殖的融合構(gòu)建體相接觸，其中所述肽的結(jié)合部分結(jié)合 至由該細(xì)胞表達(dá)的受體、配體、抗體或抗原。還額外提供了選擇性減少或抑制表達(dá)受體、配體、抗體或抗原的贅生瘤、腫瘤、癌 癥或惡性細(xì)胞的增殖的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種方法包括將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少 或抑制該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞的增殖的融合構(gòu)建體相接觸，其中所述融合構(gòu)建體 的結(jié)合部分結(jié)合至由該細(xì)胞表達(dá)的受體、配體、抗體或抗原。術(shù)語(yǔ)“接觸”表示兩個(gè)或更多個(gè)實(shí)體之間(例如，融合構(gòu)建體和細(xì)胞之間)的直接 或間接結(jié)合或相互作用。此處所用的接觸包括在溶液中、固相中、體外、間接體內(nèi)、細(xì)胞中以 及體內(nèi)接觸。體內(nèi)接觸可被稱為施用。被靶向以非選擇性或選擇性減少或抑制增殖的細(xì)胞包括表達(dá)任意被該融合結(jié)構(gòu) 域的結(jié)合部分結(jié)合的分子的細(xì)胞。示范性的細(xì)胞包括表達(dá)受體(例如，激素受體、生長(zhǎng)因子 受體、細(xì)胞因子受體、趨化因子受體)、配體(例如，激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子)或 者抗體或抗原或整合素或整合素受體(含“RGD”序列基序的肽)或存在于胞外介質(zhì)(ECM) 中的成分如單糖、二糖或寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、乙酰神經(jīng)氨酸、含“RGD”序列 基序的肽等的細(xì)胞。靶細(xì)胞包括表達(dá)性或性腺類固醇激素或者性或性腺類固醇激素受體的細(xì)胞。靶細(xì) 胞還包括表達(dá)受體的細(xì)胞，其中該受體結(jié)合至促性腺激素釋放激素I、促性腺激素釋放激素 II、八目鰻I(yíng)II促黃體激素釋放激素、促黃體激素、絨毛膜促性腺激素、促黑色素細(xì)胞激素、 雌二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生長(zhǎng)激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮質(zhì)激素、雌激素、 睪丸激素、雄烯二酮、二氫睪丸激素、脫氫表雄酮、黃體酮、雄性激素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、 Herf/neu、維生素H、葉酸或其衍生物(例如，葉酸)、鐵傳遞蛋白、甲狀腺刺激激素(TSH)、 內(nèi)皮素、蛙皮素、生長(zhǎng)激素、血管活性腸肽、乳鐵蛋白、整合素(例如，α-5β3或α_5β1整 合素)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、 CD154、類免疫球蛋白受體、RORU IGF-1、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺 特異性膜抗原(PSMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、胰島素-樣生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子、胰島素、血漿銅藍(lán)蛋白或HIV-tat。靶細(xì)胞進(jìn)一步包括表達(dá)結(jié)合性或性腺類固醇激素或者性或性腺類固醇激素受體 的受體的細(xì)胞。靶細(xì)胞還包括表達(dá)受體的細(xì)胞，所述受體結(jié)合至促性腺激素釋放激素I、促 性腺激素釋放激素II、八目鰻I(yíng)II促黃體激素釋放激素、促黃體激素β鏈、促黃體激素、 絨毛膜促性腺激素、絨毛膜促性腺激素亞單位、促黑色素細(xì)胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、 多巴胺、生長(zhǎng)激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素、雌激素、睪丸激 素、雄烯二酮、二氫睪丸激素、脫氫表雄酮、黃體酮、雄性激素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、Her2/ neu、維生素H、葉酸或其衍生物(例如，葉酸)、鐵傳遞蛋白、甲狀腺刺激激素(TSH)、內(nèi)皮素、 蛙皮素、生長(zhǎng)激素、血管活性腸肽、乳鐵蛋白、整合素(例如，α-5β3ΟΓ α_5β1整合素)、 神經(jīng)生長(zhǎng)因子、CD19、CD20、CD23、CD27、CD28、CD30、CD33、CD40、CD52、CD56、CD70、CD154、 類免疫球蛋白受體、R0R1、IGF-1、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性 膜抗原(PSMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、胰島素、血漿銅藍(lán)蛋白、HIV-tat或其類似物(例如，米非司酮、氟他胺、柳菩林、zxoladex、醋酸組氨瑞林、synatel曲普瑞林、布舍 瑞林、西曲瑞克、加尼瑞克、阿巴瑞克、安肽、替維瑞克或地加瑞克(Fe200486))。被靶向以非選擇性或選擇性減少或抑制增殖的細(xì)胞額外包括表達(dá)“腫瘤相關(guān)抗 原”如癌胚抗原(CEA)、α-胎兒球蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜 抗原(PSMA)、CA 125(殘留上皮卵巢癌)、可溶性白介素-2 (IL-2)受體、RAGE-1、酪氨酸酶、 MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-UMelan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gpl00、3 -連環(huán)蛋白、PRAME、 MUM-1、ZFP161、類泛素-1、H0X-B6、YB-1、骨粘連蛋白和ILF3的細(xì)胞。被靶向以非選擇性 或選擇性減少或抑制增殖的細(xì)胞還額外包括表達(dá)鐵傳遞蛋白、葉酸及其衍生物(例如，葉 酸)和腫瘤壞死因子(TNF)家族成員例如TNF-α ,TNF-β (淋巴細(xì)胞毒素、LT)、TRAIL、Fas、 LIGHT和41BB以及受體的細(xì)胞。本發(fā)明的融合構(gòu)建體和方法還可適用于治療不良或異常的細(xì)胞增殖和高度增殖 紊亂。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了治療不良或異常細(xì)胞增殖和高度增殖紊亂的方法。在一個(gè) 實(shí)施方式中，一種方法包括向(需要治療的)對(duì)象施用數(shù)量上足以治療不良或異常細(xì)胞增 殖或高度增殖紊亂的融合構(gòu)建體。術(shù)語(yǔ)“高度增殖紊亂”指任意不良的、異常的細(xì)胞存活(例如，未進(jìn)行程序性細(xì)胞 死亡或凋亡)、生長(zhǎng)和增殖。該種疾病包括增生、非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性贅生瘤、癌癥、腫瘤和惡 性腫瘤。不良的、異常細(xì)胞增殖和高度增殖紊亂可影響對(duì)象中的任意細(xì)胞、組織、器官。不 良的或異常的細(xì)胞增殖和高度增殖紊亂可局部、區(qū)域或系統(tǒng)地存在于對(duì)象中。高度增殖紊 亂可由多個(gè)組織或器官發(fā)生，該組織或器官包括但不限于乳腺、肺(例如，小細(xì)胞或非小細(xì) 胞)、甲狀腺、頭和頸、腦、鼻咽、喉、鼻或竇、淋巴、腎上腺、腦垂體腺、甲狀腺、淋巴腺、胃腸的 (嘴、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸(小腸)、結(jié)腸、直腸)、泌尿生殖道(子宮、卵巢、陰道、 子宮頸、子宮內(nèi)膜、輸卵管、膀胱、睪丸、陰莖、前列腺)、腎、胰腺、肝、骨、骨髓、淋巴腺、血液、 肌肉、皮膚和干細(xì)胞，其可以或不可以轉(zhuǎn)移至其它次級(jí)位點(diǎn)、區(qū)域或位置。本發(fā)明的融合構(gòu)建體和方法還適用于任意細(xì)胞、器官或組織來(lái)源的轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn) 移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤。該種紊亂可實(shí)際上影響任意細(xì)胞或組織類型，例如， 癌，肉瘤，黑素瘤，神經(jīng)的和網(wǎng)狀內(nèi)皮的或造血的贅生紊亂(例如，骨髓瘤，淋巴瘤或白血 病)。術(shù)語(yǔ)“贅生瘤”和“腫瘤”表示生長(zhǎng)、增殖或存活大于普通的對(duì)應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖 或存活的細(xì)胞或細(xì)胞群體，例如，細(xì)胞增殖或分化疾紊亂。腫瘤是形成了明顯胞塊和生長(zhǎng)的 贅生瘤?！鞍┌Y”和“惡性腫瘤”指可侵入臨近空間、組織或器官的贅生瘤或腫瘤?！稗D(zhuǎn)移瘤” 指從其原發(fā)位點(diǎn)散播或擴(kuò)散至對(duì)象體內(nèi)一個(gè)或多個(gè)次級(jí)位點(diǎn)、位置或區(qū)域的贅生瘤、腫瘤、 癌癥或惡性腫瘤，其中該位點(diǎn)、位置或區(qū)域不同于原發(fā)腫瘤或癌癥。(轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性)贅生瘤、腫瘤、癌癥和惡性細(xì)胞包括休眠或殘留贅生瘤、腫 瘤、癌癥和惡性細(xì)胞。該種細(xì)胞通常由未分裂(G0-G1停滯)的殘余腫瘤細(xì)胞組成。這些細(xì) 胞可存留在原發(fā)位點(diǎn)或作為散播的贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞成為微小殘留疾病。這些 休眠的贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞保持為頓挫型(imsymptomatic)，但當(dāng)這些休眠細(xì)胞 增殖時(shí)可形成嚴(yán)重的癥狀和死亡。本發(fā)明可用于減少或抑制休眠贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性 細(xì)胞的增殖，這可進(jìn)而抑制或減少腫瘤或癌癥的方法或者腫瘤或癌癥的轉(zhuǎn)移或進(jìn)展。根據(jù)本發(fā)明，提供了治療具有轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種方法包括向(有治療需要的)對(duì)象施用數(shù)量上足以治療(例 如，減少或抑制增殖)轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤的融合構(gòu)建體。該轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤可處于任意階段，例如，早期 或晚期，例如I、II、III、IV或V階段腫瘤。該轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅 生瘤可經(jīng)過(guò)預(yù)先處理或被穩(wěn)定化(非進(jìn)展)或緩解。就轉(zhuǎn)移性而言，本發(fā)明的方法可用于減少或抑制原發(fā)腫瘤或癌癥轉(zhuǎn)移至其它位點(diǎn) 或者轉(zhuǎn)移性腫瘤或癌癥在遠(yuǎn)離原發(fā)性腫瘤或癌癥的其它位點(diǎn)的形成或確立，從而抑制或減 少腫瘤或癌癥方法或者腫瘤或癌癥進(jìn)展。因此，除了其它作用，本發(fā)明的方法可1)減少或 抑制潛在或者已經(jīng)形成轉(zhuǎn)移的腫瘤或癌癥細(xì)胞(例如，散播腫瘤細(xì)胞，DTC)的生長(zhǎng)、增殖、 遷移或侵染；2)減少或抑制由原發(fā)腫瘤或癌癥產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移瘤在不同于該原發(fā)腫瘤或癌癥 的位點(diǎn)、局部或區(qū)域的形成或確立；幻減少或抑制轉(zhuǎn)移瘤形成或確立之后該轉(zhuǎn)移瘤在不同 于該原發(fā)腫瘤或癌癥的一個(gè)或多個(gè)其它位點(diǎn)、局部或區(qū)域的生長(zhǎng)或增殖；以及4)者減少或 抑制該轉(zhuǎn)移瘤形成或確立之后其它轉(zhuǎn)移瘤的形成或確立。轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤的細(xì)胞可聚集在“實(shí)體”細(xì)胞塊 中或者可被分散或擴(kuò)散。“實(shí)體”腫瘤指通常具體在一起并形成胞塊的癌癥、贅生瘤或惡性 腫瘤。特定的非限制性范例包括內(nèi)臟腫瘤如黑素瘤、乳腺、胰腺、子宮和卵巢癌、睪丸癌(包 括精細(xì)胞瘤)、胃結(jié)腸癌、肝癌、腎上腺、直腸和膀胱癌、肺、頭和頸癌以及腦腫瘤/癌癥。癌(其指上皮或內(nèi)分泌腺組織的惡性腫瘤)包括呼吸系統(tǒng)癌、胃腸系統(tǒng)癌、泌尿生 殖系統(tǒng)癌、睪丸癌、乳腺癌、前列腺癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌和黑素瘤。示范性的癌包括由子宮、子 宮頸、肺、前列腺、乳腺、頭和頸、結(jié)腸、胰腺、睪丸、腎上腺、腎、食道、胃、肝和卵巢形成的癌。 該術(shù)語(yǔ)還包括癌肉瘤，例如，包括由癌和肉瘤組織構(gòu)成的惡性腫瘤。腺癌包括腺組織的癌， 或者腫瘤形成腺狀結(jié)構(gòu)的癌。肉瘤指間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤。示范性的肉瘤包括，例如，淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、 骨肉瘤、軟骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤和纖維肉瘤。神經(jīng)贅生瘤包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞 瘤、星形細(xì)胞瘤和少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤。“液態(tài)瘤”表示具有分散或擴(kuò)散性質(zhì)的贅生瘤，因?yàn)樗鼈兺ǔ２恍纬晒腆w團(tuán)塊。特 定的范例包括網(wǎng)狀內(nèi)皮組織或造血系統(tǒng)的贅生瘤，如淋巴瘤、骨髓瘤和白血病。白血病的非 限制性范例包括急性和慢性成淋巴細(xì)胞、成髓細(xì)胞白血病以及多發(fā)性骨髓瘤。通常而言，該 種疾病源自于分化較差的急性白血病，例如，成紅細(xì)胞白血病和急性成巨核細(xì)胞白血病。特 定的骨髓疾病包括，但不限于，急性早幼粒白血病(APML)，急性骨髓性白血病(AML)以及慢 性骨髓性白血病(CML)。淋巴惡性腫瘤包括，但不限于，急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，其包 括B系A(chǔ)LL和T系A(chǔ)LL，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，幼淋巴細(xì)胞白血病(PLL)，毛細(xì)胞白血 病(HLL)以及特發(fā)性巨球蛋白血癥(WM)。特定的惡性淋巴瘤包括，非Hodgkin淋巴瘤及變 體、周邊T細(xì)胞淋巴瘤、成年T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)、大顆 粒淋巴細(xì)胞白血病(LGF)、Hodgkin疾病和Reed-Sternberg疾病。此處所披露的不良或異常細(xì)胞增殖或高度增殖紊亂可發(fā)生于子宮、乳腺、陰道、子 宮頸和輸卵管。子宮內(nèi)膜異位發(fā)生于子宮的細(xì)胞生長(zhǎng)于子宮外并進(jìn)入氣體區(qū)域(例如，卵 巢、膀胱或腸)時(shí)。纖維瘤和息肉可影響子宮、乳腺、陰道、子宮頸和輸卵管。
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因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了治療子宮內(nèi)膜異位和纖維瘤或息肉的方法。在一個(gè)實(shí)施 方式中，一種方法包括向?qū)ο笫┯脭?shù)量上足以治療子宮內(nèi)膜異位的融合構(gòu)建體。在另一實(shí) 施方式中，一種方法包括向?qū)ο笫┯脭?shù)量上足以治療纖維瘤或息肉的融合構(gòu)建體。靶細(xì)胞包括參與生殖或生育力或者生殖或生育力所需的細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明， 提供了減少動(dòng)物生育力的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種方法包括向?qū)ο笫┯脭?shù)量上足以 減少生育力或減少受孕可能性或者減少雄性哺乳動(dòng)物精子生成的融合構(gòu)建體。同樣如此處披露，不良或異常細(xì)胞增殖或高度增殖紊亂可發(fā)生于前列腺。因此，根 據(jù)本發(fā)明，提供了治療良性前列腺增生或轉(zhuǎn)移性前列腺贅生瘤的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中， 一種方法包括向?qū)ο笫┯脭?shù)量上足以治療良性前列腺增生或轉(zhuǎn)移性前列腺贅生瘤的融合 構(gòu)建體。任意具有抗細(xì)胞增殖活性或效果的組合物、治療、方案、療法或用藥法可與融合構(gòu) 建體聯(lián)用或者與本發(fā)明的方法聯(lián)用。本發(fā)明的融合構(gòu)建體和方法因此包括抗增殖、抗腫瘤、 抗癌癥、抗贅生瘤以及抗轉(zhuǎn)移瘤的治療、方案、療法，其包括任意其它抑制、減少、阻礙、減 緩、降低或防止高度增殖紊亂(例如腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤)的生長(zhǎng)、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、增 殖或存活或者在體外或體內(nèi)惡化的組合物、治療、方案或治療方案?？乖鲋?例如，腫瘤)療 法的特定非限制性范例包括化學(xué)療法、免疫療法、放射療法(電離或化學(xué))、局部熱(高熱) 療法、手術(shù)切除和疫苗接種。融合構(gòu)建體可施用于該抗細(xì)胞增殖、抗贅生瘤、抗腫瘤、抗癌、 抗轉(zhuǎn)移瘤或免疫增強(qiáng)治療或療法施用之前、施用同時(shí)或施用之后。融合構(gòu)建體可作為與抗 細(xì)胞增殖、抗贅生瘤、抗腫瘤、抗癌癥、抗轉(zhuǎn)移瘤或免疫增強(qiáng)治療或療法的組合施用，以治療 轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤?？乖鲋场⒖官樕?、抗腫瘤、抗癌癥和抗轉(zhuǎn)移瘤組合物、療法、計(jì)劃、或治療包括能 夠防止、破壞、中斷、抑制或延緩細(xì)胞周期進(jìn)展或細(xì)胞增殖；刺激或增強(qiáng)凋亡或細(xì)胞死亡，抑 制核酸或蛋白合成或代謝，抑制細(xì)胞分化或減少、降低或抑制細(xì)胞存活，或必要的細(xì)胞存活 因子、生長(zhǎng)因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(胞外或胞內(nèi))的生成和利用的組合物、療法、計(jì)劃或治療。 具有抗細(xì)胞增殖、抗贅生瘤、抗腫瘤、抗癌癥和抗轉(zhuǎn)移瘤活性的化學(xué)劑類別的非限制性范例 包括烷化劑、抗代謝物、植物提取物、植物生物堿、亞硝基脲、激素、核苷酸和核苷酸類似物。 具有抗細(xì)胞增殖、抗贅生瘤、抗腫瘤、抗癌癥和抗轉(zhuǎn)移瘤活性的藥物的特定范例包括環(huán)磷酰 胺、硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素A、強(qiáng)的松龍、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、氨甲蝶呤、 6-巰基嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、AZT、5-氮胞苷(5-AZC)和5-氮胞苷相關(guān)化 合物如如地西他濱(5-氮雜-2'脫氧胞苷)、阿糖胞苷、1-β-D-阿拉伯呋喃糖-5-氮胞嘧 啶和二氫-5-氮雜胞苷、博來(lái)霉素、放射菌素D、光神霉素、絲裂霉素C、卡氮芥、環(huán)己亞硝脲、 司莫司汀、鏈脲菌素、羥脲、順式鉬氨、米托坦、甲基芐胼、氮烯唑胺、紫杉酚、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春 新堿、阿霉素和二溴甘露醇等。適用于融合構(gòu)建體和方法的其它藥劑已為本領(lǐng)域所知且可被采用。例如，生物制 品如抗體、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞存活因子、細(xì)胞分化因子、細(xì)胞因子和趨化因子可被施用。 單克隆抗體的非限制性范例包括利妥昔單抗(Rituxan )、曲妥單抗(Herceptin)、貝伐 單抗(Avastin)、西妥昔單抗(Erbitux)、阿侖單抗(Campath)、帕木單抗(Vectibix)、替 伊莫單抗(Zevalin)、托西莫單抗(Bexxar)等，其可特別與本發(fā)明的融合構(gòu)建體聯(lián)用。適 于與該融合構(gòu)建體聯(lián)用的其它靶向藥物為伊馬替尼(Gleevec)、吉非替尼(Iressa)、硼替佐米(Velcade)、拉帕替尼(Tykerb)、舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nevaxar)、尼羅替尼 (Tasigna)等。細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞存活因子、細(xì)胞分化因子、細(xì)胞因子和趨化因子的非限 制性范例包括IL-2、IL-I α、IL-I β、IL_3、IL_6、IL_7、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子 (GMCSF)、IFN- y、IL—12、TNF- α、TNF β ,MIP-Ια MIP-I β、RANTES, SDF—l、MCP_1、MCP_2、 MCP-3、MCP-4、嗜酸粒細(xì)胞親合素、嗜酸粒細(xì)胞親合素-2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-l、HCC-2、 HCC-3、LARC/MIP-3a、PARC、TARC、CK β、CK β 6、CK β 7、CK β 8、CK β 9、CK β 11、CK β 12,C10, IL-8、GRO α、GRO β、ΕΝΑ-78、GCP-2、PBP/CTAPIII β -TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1 和淋巴細(xì) 胞趨化因子。額外的非限制性范例包括免疫增強(qiáng)治療和療法，其包括基于細(xì)胞的療法。具體而 言，免疫增強(qiáng)治療和療法包括施用淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)狀細(xì)胞、NK細(xì)胞和B-細(xì) 胞。提供了治療轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、贅生瘤或惡性腫瘤的方法，由于患有或 易患有轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤而有此需要的對(duì)象的治療方法，以 及提高抗增殖、抗腫瘤、抗癌癥、抗贅生瘤或抗惡性腫瘤的療法的效力或?qū)ζ涓倪M(jìn)的方法。 在各自的實(shí)施方式中，一種方法包括向患有或易患轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤 或贅生瘤的對(duì)象施用數(shù)量上足以治療該轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤 的融合構(gòu)建體；向?qū)ο笫┯脭?shù)量上足以治療該對(duì)象的融合構(gòu)建體；以及向正經(jīng)歷或已經(jīng)經(jīng) 歷轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤療法的對(duì)象施用數(shù)量上足以提高該抗 增殖、抗腫瘤、抗癌癥、抗贅生瘤或抗惡性腫瘤療法的效果的融合構(gòu)建體。本發(fā)明的方法可在不良或異常細(xì)胞增殖或高度增殖紊亂、疾病或病癥開(kāi)始的證據(jù) (例如，一種或多種癥狀)出現(xiàn)之前(即，預(yù)防)、同時(shí)或之后進(jìn)行施用。在不良或異常細(xì)胞 增殖或高度增殖紊亂的癥狀形成之前、同時(shí)或之后立即施用融合構(gòu)建體可減少該對(duì)象的不 良或異常細(xì)胞增殖或高度增殖紊亂、疾病或病癥的一種或多種癥狀的發(fā)生、頻率、嚴(yán)重性、 進(jìn)展或持續(xù)時(shí)間。此外，在不良或異常細(xì)胞增殖或高度增殖紊亂的一種或多種癥狀形成之 前、同時(shí)或之后立即施用融合構(gòu)建體可抑制、減少或防止高度增殖細(xì)胞(例如，轉(zhuǎn)移瘤)擴(kuò) 散或散播至對(duì)象體內(nèi)其它位點(diǎn)、區(qū)域、組織或器官或者高度增殖細(xì)胞(例如，轉(zhuǎn)移瘤)在對(duì) 象體內(nèi)其它位點(diǎn)、區(qū)域、組織中形成。本發(fā)明的融合構(gòu)建體和方法(例如治療方法)可向?qū)ο筇峁┛蓹z測(cè)或可測(cè)量治療 效果或改進(jìn)。治療效果或改進(jìn)是任意可測(cè)量或可檢測(cè)的、客觀的或主觀的、瞬時(shí)的、臨時(shí)的、 或者更長(zhǎng)期的對(duì)對(duì)象的效果或?qū)?duì)象的組織、器官、細(xì)胞或細(xì)胞群中任意程度的狀況、紊亂 或疾病、有害癥狀、后果或基本病因的改進(jìn)。治療效果和改進(jìn)包括，但不限于，減少或降低與 紊亂、疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀或并發(fā)癥的發(fā)作、頻率、嚴(yán)重性、進(jìn)展或期限，或者 減少或降低紊亂、疾病或病癥的發(fā)病原因或后續(xù)作用。本發(fā)明的融合構(gòu)建體和方法因而包 括向?qū)ο筇峁┲委熜Ч透倪M(jìn)。在治療效果和改進(jìn)作為期望的結(jié)果的本發(fā)明的一種方法中，本發(fā)明的融合構(gòu)建體 可以充分量或有效量施用至需要的對(duì)象?！俺浞至俊被颉坝行Я俊敝敢詥为?dú)或多重劑量、單用 或與一種或多種其它組合物(治療劑，例如化療或免疫刺激藥物)、治療、計(jì)劃或治療方案 聯(lián)用時(shí)，可向?qū)ο筇峁┤我鈺r(shí)間長(zhǎng)度(長(zhǎng)期或短期)的可測(cè)應(yīng)答、任意可測(cè)量或可檢測(cè)程度 的或是任意時(shí)間長(zhǎng)度(例如，持續(xù)小時(shí)、天、月、年或治愈)的預(yù)期結(jié)果或效果的數(shù)量。用于治療(例如，提供治療效果或改進(jìn))的劑量或“充分量”或“有效量”通常能夠以可測(cè)量的程 度有效改善紊亂、疾病或病癥，或者該紊亂、疾病或病癥的一種、多種或所有的有害癥狀、后 果或并發(fā)癥，盡管減少或阻止該紊亂、疾病或病癥或癥狀的進(jìn)展或惡化被認(rèn)為是理想結(jié)果。術(shù)語(yǔ)“改善”表示對(duì)于對(duì)象病癥的可檢測(cè)的客觀或主觀改進(jìn)?？蓹z測(cè)的改進(jìn)包括 由紊亂、疾病或病癥引起或與之相關(guān)的癥狀的發(fā)作、頻率、嚴(yán)重性、進(jìn)展或期限的主觀或客 觀上的減少，對(duì)疾病、疾病或病癥的發(fā)病原因或后果的改進(jìn)，或者紊亂、疾病或病癥的取消。因此治療可導(dǎo)致紊亂、疾病或病癥，或者相關(guān)的癥狀或后果，或者發(fā)病原因的抑 制、減少或防止；紊亂、疾病、病癥、癥狀或后果的進(jìn)展或惡化，或者該紊亂的一種或多種其 它癥狀、疾病狀況或癥狀的進(jìn)一步惡化或發(fā)作的抑制、減少或防止。因此，成功的治療結(jié)果 導(dǎo)致“治療作用”或“效果”或者抑制、減少或防止對(duì)對(duì)象體內(nèi)一種或多種癥狀的發(fā)作、頻率、 嚴(yán)重性、進(jìn)展或期限，或者病癥、紊亂、疾病或癥狀的發(fā)病原因或后果。因此，可影響該病癥、 紊亂、疾病或癥狀的一種或多種發(fā)病原因的治療方法被認(rèn)為是有益的。對(duì)紊亂或病癥的進(jìn) 展或惡化的穩(wěn)定或抑制同樣是成功的治療結(jié)果。因此治療效果或改進(jìn)不需要完全消除與病癥、紊亂或疾病相關(guān)的任意一種、多數(shù) 或所有癥狀、并發(fā)癥、后果或發(fā)病原因。因此，當(dāng)對(duì)于對(duì)象的癥狀有了改進(jìn)，或者在較短或較 長(zhǎng)的時(shí)間期限內(nèi)(小時(shí)、天、周、月等)一種或多種相關(guān)有害癥狀或并發(fā)癥或后果或發(fā)病原 因的發(fā)作、頻率、嚴(yán)重性、進(jìn)展或期限有了部分減少，或者該紊亂或疾病的一種或多種生理、 生化或細(xì)胞表現(xiàn)或特征的惡化或進(jìn)展有了部分減少(例如，穩(wěn)定該病癥、紊亂或疾病的一 種或多種癥狀或并發(fā)癥)時(shí)，便達(dá)到了令人滿意的終點(diǎn)。在特定的實(shí)施方式中，治療方法導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅 生瘤細(xì)胞量、體積、大小或細(xì)胞數(shù)量的部分或完全破壞；導(dǎo)致刺激、誘導(dǎo)或提高轉(zhuǎn)移性或非 轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤細(xì)胞壞死、溶解或凋亡；導(dǎo)致減少轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性 腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤體積大小、細(xì)胞量；導(dǎo)致抑制或防止高度增殖細(xì)胞(例如轉(zhuǎn) 移瘤)擴(kuò)散或散播至對(duì)象體內(nèi)其它(次級(jí))位點(diǎn)、區(qū)域、組織或器官或者高度增殖細(xì)胞(例 如，轉(zhuǎn)移瘤)在對(duì)象體內(nèi)其它(次級(jí))位點(diǎn)、區(qū)域、組織或器官的確立；或?qū)е卵娱L(zhǎng)對(duì)象壽 命。除了特定的實(shí)施方式之外，一種治療方法導(dǎo)致減少或降低了與轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、 癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤相關(guān)或由其因引起的不良癥狀或并發(fā)癥的嚴(yán)重性、持續(xù)時(shí)間或頻 率。充分量或有效量不需要在單次施用中提供，并且可以(但非必須)單用或與另一 組合物(例如，化療或免疫增強(qiáng)或刺激藥劑)、治療、計(jì)劃或治療方案聯(lián)用。例如，該數(shù)量可 根據(jù)該對(duì)象、紊亂的狀態(tài)、所治療的疾病或病癥或者待治療的副作用的需求相應(yīng)增加。此 外，如果在沒(méi)有第二組合物(例如，化療或免疫刺激藥劑)、治療、計(jì)劃或治療方案時(shí)以單劑 量或多劑量給用時(shí)，充分量或有效量不需要充分或有效，因?yàn)檫€可在該劑量之外采用附加 的劑量、數(shù)量或期限，或者可包含附加組合物(例如，化療或免疫刺激藥劑)、治療、計(jì)劃或 治療方案以達(dá)到對(duì)給定對(duì)象的充分和有效。認(rèn)為充分的數(shù)量還包括導(dǎo)致另一治療、治療方 案或計(jì)劃的使用減少的數(shù)量。 充分量或有效量無(wú)需對(duì)每一個(gè)治療對(duì)象有預(yù)防或治療效果，或?qū)o定組或群內(nèi)大 部分治療對(duì)象有效。在治療方法中常見(jiàn)的是，部分對(duì)象對(duì)給定的治療、治療方案或計(jì)劃顯示 出更大或更小的應(yīng)答。充分量或有效量指對(duì)特定對(duì)象充分或有效，而非對(duì)組或一般群充分或有效。該種數(shù)量將部分依賴于待治療的病癥，例如不良的或異常的細(xì)胞增殖或高度增殖 紊亂(例如，轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤)的類型和階段，預(yù)期的治療 效果，以及個(gè)體對(duì)象(例如，該對(duì)象的生物利用度、性別、年齡等)。不良或異常細(xì)胞增殖如高度增殖紊亂(例如，轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性 腫瘤或贅生瘤)的治療效果或改進(jìn)的特定非限制性范例包括細(xì)胞大小、量或體積的減小， 細(xì)胞大小、量或體積的抑制，惡化或進(jìn)展的減緩或抑制，刺激細(xì)胞壞死、溶解或凋亡，減少或 抑制贅生瘤或重量、惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤，減少死亡率，以及延長(zhǎng)對(duì)象壽命。因此，盡管沒(méi)有 形成對(duì)轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤的完全消除，但抑制或減緩大小、 量、體積或轉(zhuǎn)移的上升(穩(wěn)定化)可增加壽命(減少死亡率)，即使只有數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月。 可以減少或降低的與高度增殖紊亂(例如，轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生 瘤)相關(guān)的不良癥狀或并發(fā)癥包括，例如，疼痛、惡心、不適、食欲不振、嗜睡和虛弱。對(duì)不良 的或異常的細(xì)胞增殖，例如高度增殖紊亂(例如，轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤 或贅生瘤)的癥狀的發(fā)作、頻率、嚴(yán)重性、進(jìn)展或持續(xù)時(shí)間的減少，例如，對(duì)主管感受的改進(jìn) (例如，精神、食欲的改善，惡心的減少，活動(dòng)能力或心理健康的改善等)均為治療效果或改 進(jìn)的范例。例如，如果施用可導(dǎo)致對(duì)不良或異常細(xì)胞增殖如高度增殖紊亂(例如，轉(zhuǎn)移性或 非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤)的治療所需的化學(xué)治療藥物、放射或免疫療法更 少，融合構(gòu)建體的重復(fù)或有效量被認(rèn)為具有治療效果。術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”指動(dòng)物，通常為哺乳動(dòng)物，例如人，非人靈長(zhǎng)動(dòng)物(猿、長(zhǎng)臂猿、黑猩 猩、猩猩、獼猴)，馴養(yǎng)動(dòng)物(狗和貓)，畜牧動(dòng)物(馬、牛、山羊、綿羊、豬)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(小鼠、 大鼠、兔子、豚鼠)。對(duì)象包括動(dòng)物疾病模型，例如，用于體內(nèi)融合構(gòu)建體分析的不良的或異 常的細(xì)胞增殖如高度增殖紊亂(例如，轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤) 的動(dòng)物模型。適于治療的對(duì)象包括具有或者易具有轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或 贅生瘤細(xì)胞，正經(jīng)歷或者曾經(jīng)歷抗增殖(例如，轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或 贅生瘤)療法的對(duì)象，包括緩解中的對(duì)象?！耙谆肌睂?duì)象通常具有與不良或異常細(xì)胞增殖、增 生的形成(例如，腫瘤)相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素。具有風(fēng)險(xiǎn)或候選對(duì)象的特定范例包括具有表達(dá)融合構(gòu)建體可結(jié)合的受體、配體、 抗原或抗體的細(xì)胞的對(duì)象，特別地靶向壞死、溶解、殺死或破壞的細(xì)胞比非靶細(xì)胞表達(dá)更高 數(shù)量或量的受體、配體、抗原或抗體。該種細(xì)胞可選擇性或優(yōu)選地靶向壞死、溶解或殺死。具有風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象還包括候選進(jìn)行或正進(jìn)行手術(shù)切除、化學(xué)療法、免疫療法、電離或 化學(xué)放射療法、局部或區(qū)域熱(高熱)療法或疫苗接種的對(duì)象。本發(fā)明因而適用于治療易 患轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤或者與轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、 惡性腫瘤或贅生瘤相關(guān)的并發(fā)癥(例如，由于轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅 生瘤在一個(gè)穩(wěn)定或緩解時(shí)期后重新出現(xiàn)或者重新生長(zhǎng))的對(duì)象。風(fēng)險(xiǎn)因素包括年齡、生活習(xí)慣(飲食，吸煙)、職業(yè)(醫(yī)療和臨床人員，農(nóng)業(yè)和畜業(yè) 工作者)、環(huán)境因素(致癌物質(zhì)暴露)、家族史(自身免疫疾病，糖尿病等)、遺傳傾向等。例 如，易患黑色素瘤的對(duì)象的風(fēng)險(xiǎn)因素包括過(guò)量日光照射(紫外輻射)、白皮膚、痣數(shù)量過(guò)多 (發(fā)育不良痣)、患者顯型、家族史或之前的黑色素瘤史。因此，易患癌癥的對(duì)象可通過(guò)生物習(xí)慣、職業(yè)、環(huán)境因素、家族史以及腫瘤相關(guān)基因、基因刪除或基因突變的篩選得以鑒別。例 如，易患乳腺癌的對(duì)象缺失Brcal。易患結(jié)腸癌的對(duì)象具有幼年或高頻率的鼻息肉形成，或 者刪除或突變的腫瘤抑制基因，例如腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因。對(duì)象還包括被其它治療排除的對(duì)象。例如，特定的對(duì)象可以不是手術(shù)切除、化學(xué)療 法、免疫療法、電離或化學(xué)放射療法、局部或區(qū)域熱(高熱)療法或疫苗接種的良好候選者。 因此，根據(jù)本發(fā)明的治療的候選對(duì)象包括并非手術(shù)切除、化學(xué)療法、免疫療法、電離或化學(xué) 放射療法、局部或區(qū)域熱(高熱)療法或疫苗接種候選者的對(duì)象。融合構(gòu)建體可配制為單位劑量或單位劑型。在特定的實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體 的數(shù)量可有效治療患有不良或異常細(xì)胞增殖或高度增殖紊亂的對(duì)象。在附加的特定實(shí)施 方式中，融合構(gòu)建體的量可有效治療患有轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤 的對(duì)象。在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式中，融合構(gòu)建體的量可有效減少對(duì)象生育力。示范性 的單位劑量的范圍為 25-250、250-500、500-1000、1000-2500or 2500-5000,5000-25, 000、 5000-50, OOOng ；and fromabout 25-250、250-500、500_1000、1000-2500 或 2500-5000、 5000-25，000,5000-50, 000 μ g。本發(fā)明的組合物和方法可在體外、間接體外或體內(nèi)接觸或提供。組合物可作 為單獨(dú)或多重劑量(例如，以有效或充分量)施用以提供目標(biāo)作用。在連續(xù)數(shù)天、隔 天或間歇性施用的示范性劑量的范圍為約25-250、250-500、500-1000、1000-2500或 2500-5000,5000-25, 000,5000-50,OOOpg/kg ；從約 50-500、500-5000、5000_25，000 或 25，000-50，000ng/kg ；以及從約 25-250、250-500、500_1000、1000_2500or 2500-5000、 5000-25，000,5000-50, 000μ g/kg。單獨(dú)或多重劑量可連續(xù)數(shù)天、隔天或間歇地施用?？赏ㄟ^(guò)全身、區(qū)域或局部施用等任何途徑施用該組合物和實(shí)施該方法。例如，融合 構(gòu)建體可全身、區(qū)域或局部、靜脈、口服(例如，攝取或吸入)、肌肉、腹膜、皮內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、 顱內(nèi)、透皮(局部)、腸胃外(例如經(jīng)粘膜或經(jīng)直腸)施用。本發(fā)明的組合物和方法包括可 通過(guò)(微)膠囊化傳遞系統(tǒng)施用或裝填進(jìn)入移植物進(jìn)行施用的藥物制劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了融合構(gòu)建體和方法，其中該融合構(gòu)建體包含在藥物組合物 中。藥物組合物指“藥學(xué)可接受的”和“生理可接受”的載體、稀釋劑或賦形劑。此處所用的 術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”和“生理可接受的”在涉及載體、稀釋劑或賦形劑時(shí)包括與藥物施用以 及與該制劑中其它成分相容的溶劑(水性或非水性)、清潔劑、溶液、乳液、分散介質(zhì)、涂層、 等張劑和吸收促進(jìn)或延緩劑。該種制劑可包含在片劑(包衣或未包衣)、膠囊(硬或軟)、 微粒、乳劑、粉末、顆粒、晶體、懸浮劑、糖漿或酏劑。藥物組合物可制成與特定施用途徑相容的劑型。用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下施用的 組合物可包含無(wú)菌稀釋劑，例如水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成 的溶劑。該制劑可包含一種或多種防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)(例如，苯甲醇或羥苯甲酸甲 酯等抗菌劑；抗壞血酸或重亞硫酸鈉等抗氧化劑；乙二銨四醋酸等螯合劑；醋酸鹽、檸檬酸 鹽或磷酸鹽等緩沖液以及氯化鈉或右旋糖等調(diào)節(jié)張力的試劑)。適于注射的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(具有水溶性時(shí))或分散體以及用于臨時(shí) 制備無(wú)菌水溶液或分散體的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈施用，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、 Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。該載體可以是一種溶劑或 分散介質(zhì)，其包含，例如，水、乙醇、多羥基化合物(例如，丙三醇、丙二醇、以及聚乙二醇)及
35其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。可通過(guò)，例如，采用卵磷脂等涂層或使用表面活性劑來(lái)保持流動(dòng)性。抗菌 劑和抗真菌劑包括，例如，對(duì)羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸和硫柳汞。包括延緩吸收 的藥劑，例如，單硬脂酸鋁和明膠可延長(zhǎng)可注射組合物的吸收。其它藥物制劑和傳遞系統(tǒng)已為本領(lǐng)域所知并適用于本發(fā)明的方法(參見(jiàn)，例 如，ReminRton’ s Pharmaceutical Sciences (1990) 18thed. , Mack Publishing Co., Easton,PA :The Merck Index(1996) 12th ed. ,Merck Publishing Group,ffhitehouse,NJ ； Pharmaceutical Principles ofSolid DosaRe Forms, Technonic Publishing Co.，Inc.， Lancaster, Pa. , (1993) ；and Poznansky,等人，DruR Delivery Systems, R. L. Juliano, ed.，Oxford, N. Y. (1980)，pp. 253—315)。本發(fā)明提供了包括本發(fā)明融合構(gòu)建體，其聯(lián)合組合物以及藥物制劑并用適當(dāng)包裝 材料進(jìn)行包裝的試劑盒。試劑盒可選擇性包含帶有成分描述或者對(duì)其中成分的體外、體內(nèi) 或間接體內(nèi)的使用的說(shuō)明的標(biāo)簽或包裝插頁(yè)。示范性的說(shuō)明書(shū)包括對(duì)以下方法的說(shuō)明減 少或抑制細(xì)胞的增殖，減少或抑制不良或異常細(xì)胞(例如高度增殖細(xì)胞)的增殖，減少或抑 制轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤細(xì)胞的增殖，治療患有高度增殖紊亂的 對(duì)象，治療患有轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤的對(duì)象或者減少動(dòng)物的生 育力。試劑盒可包含該種成分的集合，例如，兩種或多種單獨(dú)的融合構(gòu)建體或與其它治 療用途組合物(例如，抗增殖或免疫增強(qiáng)藥物)的組合。術(shù)語(yǔ)“包裝材料”指包容該試劑盒的成分的物理結(jié)構(gòu)。該包裝材料可維持該成分無(wú) 菌，并可用常用于該種目的的材料(例如，紙，波紋纖維，玻璃，塑料，箔，安瓿，小瓶，管等) 制作。本發(fā)明的試劑盒可包含標(biāo)簽或插頁(yè)。標(biāo)簽或插頁(yè)包括“印刷品”，例如，單獨(dú)或粘 帖至成分、試劑盒或包裝材料(例如，箱子)，或貼在包含試劑盒成分的安瓿、管子或小瓶的 紙張或紙板。標(biāo)簽或插頁(yè)可進(jìn)一步包括計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，例如磁碟(例如，軟盤(pán)，硬盤(pán)，ZIP 盤(pán))，如CD-或DVD-ROM/RAM，DVD, MP3等光碟，磁帶，或RAM和ROM等電子存儲(chǔ)介質(zhì)或其復(fù) 合體，如磁/光存儲(chǔ)介質(zhì)，F(xiàn)LASH介質(zhì)或記憶類型卡。標(biāo)簽或插頁(yè)還可包括其中一種或多種成分的鑒別信息，劑量，活性成分的臨床藥 理學(xué)(包括作用機(jī)制，藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué))。標(biāo)簽或插頁(yè)可包括生產(chǎn)商信息，批次，生產(chǎn)商 地址以及日期的識(shí)別信息。標(biāo)簽和插頁(yè)可包含有關(guān)試劑盒成分可能針對(duì)的病癥、紊亂或疾病或癥狀的信息。 標(biāo)簽和插頁(yè)可包含針對(duì)臨床醫(yī)師或?qū)ο笤诜椒?、治療?jì)劃或治療方案中使用一種或多種試 劑盒成分的說(shuō)明。說(shuō)明可包括劑量、頻率或期限，以及實(shí)施此處所述的任意方法、治療計(jì)劃 或治療方案的說(shuō)明。示范性的說(shuō)明包括對(duì)治療不良或異常細(xì)胞增殖、高度增殖細(xì)胞和紊亂 (例如，轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性腫瘤、癌癥、惡性腫瘤或贅生瘤)的說(shuō)明。因此本發(fā)明的試劑盒可 進(jìn)一步包括針對(duì)實(shí)施本發(fā)明所述的任意方法(包括治療方法)的標(biāo)簽或說(shuō)明。標(biāo)簽或插頁(yè)可包括試劑盒成分可能提供的任意效果(例如，預(yù)防性或治療性效 果)的信息。標(biāo)簽或插頁(yè)可包括有關(guān)潛在有害副作用的信息，例如對(duì)臨床醫(yī)生或?qū)ο笥嘘P(guān) 不適于使用特定組合物的情形的警示。不良副作用還可能在該對(duì)象曾經(jīng)，將要或正在采用 一種或多種可能與該組合物不相容的其它藥物時(shí)出現(xiàn)，或在該對(duì)象曾經(jīng)，將要或正在接受與該組合物不相容的其它治療方案時(shí)出現(xiàn)，因此，該說(shuō)明可包括有關(guān)該種不相容性的信息。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包含其它成分。該試劑盒的各個(gè)成分可封入單獨(dú)的容器 中，且所有不同的容器包含在單個(gè)包裝中。本發(fā)明的試劑盒可冷凍保存。本發(fā)明的試劑盒 可進(jìn)一步設(shè)計(jì)為包含表達(dá)本發(fā)明的融合構(gòu)建體或包含編碼融合構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。該試劑 盒中的該細(xì)胞可保存在適當(dāng)?shù)馁A存條件下，直至該細(xì)胞即將被使用。例如，含有一種或多種 細(xì)胞的試劑盒可包含適當(dāng)?shù)募?xì)胞貯存培養(yǎng)基，從而使該細(xì)胞可被融解和生長(zhǎng)。除非另行說(shuō)明，此處所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義等同于本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員的普遍理解。盡管其它與此處所述類似或等同的方法和材料也可用于對(duì)本發(fā)明的實(shí) 施或測(cè)試，此處描述了適用的方法和材料。此處引用的所有應(yīng)用，出版物，專利及其它參考文獻(xiàn)，GenBank引文以及ATCC弓丨文 均在此全文引用作為參考。在產(chǎn)生沖突的情況下，將受本說(shuō)明書(shū)包括定義所支配。除非上下文另行明確指出，此處所用的單數(shù)形式的“一種”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù) 數(shù)含義。因此，例如，“融合構(gòu)建體”或“溶解結(jié)構(gòu)域”包括了復(fù)數(shù)個(gè)該種融合構(gòu)建體或溶解 結(jié)構(gòu)域，以此類推。除非上下文另行明確指出，此處所用的所有數(shù)值或數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)的整 數(shù)以及該值或該范圍內(nèi)整數(shù)的分?jǐn)?shù)。因此，例如，90-100%的范圍包括91 ^^92^^93%, 94%、95%、96%、97%等，以及 91. 1%,91. 2%,91. 3%,91. 4%,91. 5%等，92. 1%,92. 2%, 92. 3%,92. 4%,92. 5%等，并依次類推。此處一般披露的本發(fā)明采用肯定性的語(yǔ)言描述多個(gè)實(shí)施方式。本發(fā)明還特別包 括了完全或部分排除特定對(duì)象(例如，物質(zhì)或材料、方法步驟和條件、計(jì)劃、步驟、測(cè)定或分 析)的實(shí)施方式。因此，盡管本發(fā)明一般不以本發(fā)明包括什么來(lái)進(jìn)行表示，本發(fā)明未明確排 除的方面仍然在此披露。本發(fā)明的一系列實(shí)施方式已得到描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解可在不脫離本發(fā)明的精神 和范圍的基礎(chǔ)上進(jìn)行各種改動(dòng)。相應(yīng)地，下列實(shí)施例目的在于闡述，而非限制權(quán)利要求書(shū)中 描述的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1初始的研究包括體外篩選28種溶解結(jié)構(gòu)域肽，其在溶解肽部分和配體之間包含 不同的鉸鏈序列；其包含30%的D氨基酸(D-對(duì)映異構(gòu)體)，溶解肽部分為18和15個(gè)氨基 酸的長(zhǎng)度，且包含鉸鏈序列或其D-對(duì)映異構(gòu)體。研究了在21、18和15氨基酸Wu)r21類似 物上引入作為間隔子的α-氨基己酸。為進(jìn)行研究所選擇的配體包括β CG-ala(來(lái)自絨毛 膜促性腺激素的β鏈的結(jié)合部分的15個(gè)氨基酸片段)和LHRH(代表全功能配體的十肽)。實(shí)施例2本實(shí)施例描述了采用人乳腺癌細(xì)胞系篩選細(xì)胞毒性(IC5tl)和溶血活性。對(duì)十八種β CG-ala和八種LHRH結(jié)合的融合構(gòu)建體進(jìn)行了研究，并與 Phor21-3 CG-ala 和未結(jié)合的 Phor21 和 Phorl8(338913) = CLIP71 肽進(jìn)行比較。過(guò)量 表達(dá)絨毛膜促性腺激素(CG)和促黃體激素-釋放激素(LHRH)受體的人乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-435S. Iuc在傳代數(shù)248-252時(shí)被用于篩選。該MDA-MB_4;35S. Iuc細(xì)胞系可從由美國(guó)菌種保藏中心獲得的MDA-MB-435S細(xì)胞系通過(guò)以包含美洲螢火蟲(chóng)螢光素酶基因和抗體 耐受基因的PRC/CMV-luc質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化構(gòu)建得到。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可采 用G418進(jìn)行選擇，對(duì)具有最高熒光素酶基因表達(dá)的克隆測(cè)試LH和LHRH受體表達(dá)。MDA-MB-435S. Iuc 細(xì)胞生長(zhǎng)于 Leibovitz，s L 15 培養(yǎng)基，10%胎牛血清，0. Olmg/ ml牛胰島素，100IU/ml盤(pán)尼西林，100微克/ml鏈霉素。該細(xì)胞培養(yǎng)于密閉燒瓶中。孵育 以10，000細(xì)胞/微孔采用96孔板進(jìn)行。細(xì)胞通常被接種至96孔板，并在孵育48小時(shí)后 替換培養(yǎng)基。每次測(cè)定在0,0. 001,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、2、5、10和100微摩爾劑量的溶 解肽-結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合物的升高濃度下進(jìn)行。每種溶解肽-結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合物以凍干形式 提供，新鮮溶解于鹽水中并添加至細(xì)胞。孵育的時(shí)間通常為M小時(shí)，通過(guò)甲簪(formazan) 轉(zhuǎn)化測(cè)定(MTT測(cè)定)進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定。分別包含鹽水或0. 1% triton的對(duì)照作為0和 100%細(xì)胞死亡的參考。數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prizm 4 軟件(Graph Pad Prizm, Inc)進(jìn)行處理和分析。 通過(guò)雙尾學(xué)生T-檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的顯著性。進(jìn)行每個(gè)研究以使N至少為8。增加融合構(gòu)建體長(zhǎng)度的作用被確定(Javadpour等人，J MedChem 39 3107(1996) Javadpour 禾口 Barkeley， Biochemistry 36:9540(1997) ；Leuschner 禾口 Hansel, Current Pharmaceutical Design,10 :2299(2004)；以及 Leuschner 禾口 Hansel, Biol Reprod 73 :255 (2005))。在C末端結(jié)合至β CG-ala的溶解肽隨著構(gòu)建體長(zhǎng) 度的增加毒性增強(qiáng)。各種長(zhǎng)度的肽的IC5tl為14氨基酸(Phor 14)5. 74，15氨基酸 (Phor 15) 1. 92，18 氨基酸(Phorl8 = CLIP71) 1. 09，21 氨基酸(Phor21) 2. 31 和 28 氨基酸 (Phor28) 1.36yM(表 3)。結(jié)合部分的位置(N-或C-末端)的作用被確定。簡(jiǎn)言之，對(duì) Phor21-^ CG-ala(C-末端)、β CG-ala Phor21 (N-末端)、LHRH_Phor21 (N-末端)禾口 Phor21-LHRH(C-末端)融合構(gòu)建體進(jìn)行了研究。這些肽的IC5tl為Phor21_ β CG-ala 2. 3 μ Μ, β CG-ala-Phor214. 7 μ Μ, LHRH-Phor212. 65 μ Μ, Phor21-LHRH 1. 71 μ Μ。數(shù)據(jù)顯示 β CG-ala和LHRH結(jié)合部分的C-末端定位比結(jié)合部分的N-末端定位顯示了更大的毒性。LHRH-受體存在于許多人癌癥中(參見(jiàn)表1)。對(duì)LHRH作為結(jié)合部分和β CG-ala 作為結(jié)合部分的活性進(jìn)行了比較。在人MDA-MB-435S. Iuc乳腺癌細(xì)胞體外孵育2或24小時(shí)對(duì)LHRH-Phor21和 Phor21-β CG-ala的毒性進(jìn)行了比較。數(shù)據(jù)表示LHRH_Phor21比Phor21_ β CG-ala更快殺 死細(xì)胞，LHRH-Phor21在2小時(shí)內(nèi)誘發(fā)細(xì)胞殺死(圖1)。表1 人癌癥的LH和LHRH受體
權(quán)利要求
1.融合構(gòu)建體，其包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域由包含選 自 KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、 KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 的肽的 12-28 氨基酸序列或包含選 自 KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、 KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 的肽的 12-25 氨基酸序列組成，其中一個(gè) 或多個(gè)K殘基被F或L殘基中的任一個(gè)所替換，一個(gè)或多個(gè)F殘基被K、A或L殘基中的任 一個(gè)所替換，或者一個(gè)或多個(gè)A殘基被K、F或L殘基中的任一個(gè)所替換；且所述第二結(jié)構(gòu)域 包含結(jié)合部分。
2.融合構(gòu)建體，其包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域由選自 KFAKFAKKFAKFAKK、KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、 KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 的氨基酸序列或選自 KFAKFAKKFAKFAKK、 KFAKFAKKFAKFAKKF、KFAKFAKKFAKFAKKFA、KFAKFAKKFAKFAKKFAK、KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA的氨基酸序列組成，其中一個(gè)或多個(gè)K殘基被F或L殘基中的任一 個(gè)所替換，一個(gè)或多個(gè)F殘基被K、A或L殘基中的任一個(gè)所替換，或者一個(gè)或多個(gè)A殘基被 K、F或L殘基中的任一個(gè)所替換；且所述第二結(jié)構(gòu)域包含結(jié)合部分。
3.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述結(jié)合部分結(jié)合至受體、配體或抗原。
4.如權(quán)利要求3所述的融合構(gòu)建體，其中所述配體包括受體激動(dòng)劑和拮抗劑。
5.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述結(jié)合部分結(jié)合至在細(xì)胞上表達(dá)的受 體、配體或抗原。
6.如權(quán)利要求5所述的融合構(gòu)建體，其中所述細(xì)胞為高度增殖細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求5所述的融合構(gòu)建體，其中所述細(xì)胞為乳腺、卵巢、子宮、子宮頸、前列 腺、睪丸、腎上腺、腦垂體或子宮內(nèi)膜細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述結(jié)合部分包括配體、受體或抗體。
9.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述結(jié)合部分包括肽、多肽、蛋白、核酸或 碳水化合物。
10.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述結(jié)合部分為激素、激素類似物、與激 素受體結(jié)合的激素或激素類似物的片段、激素受體或者與激素或激素受體結(jié)合的藥劑。
11.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述結(jié)合部分具有線性或環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
12.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述結(jié)合部分結(jié)合至激素或激素受體。
13.如權(quán)利要求12所述的融合構(gòu)建體，其中所述激素選自促性腺激素釋放激素I、促性 腺激素釋放激素II、八目鰻I(yíng)II促黃體激素釋放激素、促黃體激素β鏈、促黃體激素、絨毛 膜促性腺激素、絨毛膜促性腺激素β-亞單位、促黑色素細(xì)胞激素、雌二醇、乙烯雌酚、多巴 胺、生長(zhǎng)激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮質(zhì)激素、雌激素、睪丸激素、雄烯二酮、二 氫睪丸激素、脫氫表雄酮、黃體酮或雄性激素。
14.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第二結(jié)構(gòu)域由氨基酸序列組成或包 含氨基酸序列。
15.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一或第二結(jié)構(gòu)域由約1-10、 10-20、15-20、20-30、30-40、40-50、60-70、70-80、80-90、90-100 或更多的氨基酸序列所組成或包含該氨基酸序列。
16.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一結(jié)構(gòu)域由約15至約20個(gè)氨基 酸的序列所組成。
17.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一結(jié)構(gòu)域由具有15、16、17、18、 19或20個(gè)氨基酸的序列所組成。
18.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第二結(jié)構(gòu)域由如下列舉的氨基酸序 列所組成或包含該氨基酸序列SYAVALSAQAALARR。
19.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第二結(jié)構(gòu)域由如下列舉的氨基酸序 列所組成或包含該氨基酸序列QHWSYGLRPG。
20.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一結(jié)構(gòu)域定位于相對(duì)所述第二結(jié) 構(gòu)域的NH2-末端處。
21.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第二結(jié)構(gòu)域定位于相對(duì)所述第一結(jié) 構(gòu)域的NH2-末端處。
22.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一結(jié)構(gòu)域或所述第二結(jié)構(gòu)域具有 一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸。
23.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一結(jié)構(gòu)域在K、F或A殘基具有D-氨基酸。
24.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一結(jié)構(gòu)域形成兩親α-螺旋。
25.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)共價(jià)鍵連接。
26.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)肽或非肽接 頭連接。
27.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)具有1-25 個(gè)氨基酸殘基的肽序列或通過(guò)線性碳鏈連接。
28.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)包含一個(gè)或 多個(gè)A、S或G氨基酸殘基的肽序列連接。
29.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述第一和第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)包含 GSGGS、ASAAS或CCCCCC或者由其組成的肽序列連接。
30.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，進(jìn)一步包含第三、第四、第五、第六或第七結(jié) 構(gòu)域。
31.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述融合構(gòu)建體被分離或純化。
32.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述融合構(gòu)建體包含混合物。
33.包含如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體的組合物。
34.包含如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體的藥物組合物。
35.包含如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體的單位劑型，該融合構(gòu)建體的量可有效治 療具有不良細(xì)胞增殖或高度增殖紊亂的對(duì)象。
36.包含如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體的單位劑型，該融合構(gòu)建體的量可有效治 療具有贅生瘤、腫瘤或癌癥的對(duì)象。
37.包含如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體的單位劑型，該融合構(gòu)建體的量可有效降 低對(duì)象的生育力。
38.包含如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體以及說(shuō)明書(shū)的試劑盒，其用于減少或抑制 細(xì)胞增殖、減少或抑制高度增殖細(xì)胞的增殖、減少或抑制贅生瘤、腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖、 治療患有高度增殖紊亂的對(duì)象、治療患有贅生瘤、腫瘤或癌癥的對(duì)象或者減少動(dòng)物的生育 力。
39.包含如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體以及抗細(xì)胞增殖劑或免疫刺激劑的組合物。
40.編碼如權(quán)利要求9所述的融合構(gòu)建體的核酸分子。
41.包含權(quán)利要求40所述的核酸分子的載體。
42.用權(quán)利要求41所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
43.表達(dá)如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體的細(xì)胞。
44.減少或抑制細(xì)胞增殖的方法，其包括將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制該細(xì)胞增殖 的如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體相接觸。
45.減少或抑制細(xì)胞增殖的方法，其包括將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制細(xì)胞增殖的 如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體相接觸。
46.減少或抑制高度增殖細(xì)胞的增殖的方法，其包括將細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制 該高度增殖細(xì)胞的增殖的如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體相接觸。
47.減少或抑制贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞的增殖的方法，其包括將細(xì)胞與數(shù)量上 足以減少或抑制該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞的增殖的如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述 的融合構(gòu)建體相接觸。
48.如權(quán)利要求45-47任意一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)受體、配體或抗原。
49.如權(quán)利要求45-47任意一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)激素或激素受體。
50.如權(quán)利要求45-47任意一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)性或性腺類固醇激素或 者性或性腺類固醇激素受體。
51.如權(quán)利要求45-47任意一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)受體，該受體結(jié)合促性腺 激素釋放激素I、促性腺激素釋放激素II、八目鰻I(yíng)II促黃體激素釋放激素、促黃體激素β 鏈、促黃體激素、絨毛膜促性腺激素、絨毛膜促性腺激素β -亞單位、促黑色素細(xì)胞激素、雌 二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生長(zhǎng)激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮質(zhì)激素、雌激素、睪 丸激素、雄烯二酮、二氫睪丸激素、脫氫表雄酮、黃體酮、雄性激素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、生 長(zhǎng)激素(GH)、Her2/neU、維生素H、葉酸、鐵傳遞蛋白、甲狀腺刺激激素(TSH)、內(nèi)皮素、蛙皮 素、生長(zhǎng)激素、血管活性腸肽、乳鐵蛋白、整合素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、⑶_8、⑶-33、⑶19、⑶20、 ⑶40、RORl、IGF-I、癌胚抗原(CEA)、α -胎兒球蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列 腺特異性膜抗原(PSAM)、CA 125(殘留上皮卵巢癌)、可溶性白介素-2(IL-2)受體、RAGE-1、 酪氨酸酶、MAGE-I、MAGE-2、NY-ES0-1、Melan-A/MART-l、糖蛋白(gp) 75、gplOO、β -連環(huán)蛋 白、？肌1^、]\0\1-1、2 161、泛素-1、!1( -86、￥8-1、骨粘連蛋白、11^3、葉酸或其衍生物、腫瘤 壞死因子(TNF)家族成員、TNF-α、TNF-β (淋巴細(xì)胞毒素、LT)、TRAIL、i^as、LIGHT、41BB、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、胰島素、血漿銅藍(lán)蛋白、HIV-tat、包含R⑶序列基序的 肽或蛋白、單糖、二糖、寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、巖藻糖或乙酰神經(jīng)氨酸。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中該整合素選自α_5β3或α-5β 1整合素。
53.如權(quán)利要求45-47任意一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)受體，該受體結(jié)合促性腺激素釋放激素I、促性腺激素釋放激素II、八目鰻I(yíng)II促黃體激素釋放激素、促黃體激素β 鏈、促黃體激素、絨毛膜促性腺激素、絨毛膜促性腺激素β -亞單位、促黑色素細(xì)胞激素、雌 二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生長(zhǎng)激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮質(zhì)激素、雌激素、睪 丸激素、雄烯二酮、二氫睪丸激素、脫氫表雄酮、黃體酮、雄性激素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、生 長(zhǎng)激素(GH)、Herf/neu、維生素H、葉酸、鐵傳遞蛋白、甲狀腺刺激激素(TSH)、內(nèi)皮素、蛙皮 素、生長(zhǎng)激素、血管活性腸肽、乳鐵蛋白、整合素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、⑶_8、⑶-33、⑶19、⑶20、 CD40、RORU IGF-I癌胚抗原(CEA)、α -胎兒球蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列 腺特異性膜抗原(PSMA)、CA 125(殘留上皮卵巢癌)、可溶性白介素-2(IL-2)受體、RAGE-1、 酪氨酸酶、MAGE-I、MAGE-2、NY-ES0-1、Melan-A/MART-l、糖蛋白(gp) 75、gplOO、β -連環(huán)蛋 白、PRAME、MUM-1、ZFP161、類泛素-1、Η0Χ-Β6、YB-1、骨粘連蛋白和 ILF3。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該類似物選自米非司酮、氟他胺、柳菩林、諾雷德、 醋酸組氨瑞林、synatel曲普瑞林、布舍瑞林、西曲瑞克、加尼瑞克、阿巴瑞克、安肽、替維瑞 克和地加瑞克(Fe200486)。
55.選擇性減少或抑制表達(dá)受體或抗原的細(xì)胞的增殖的方法，其包括將該細(xì)胞與數(shù)量 上足以減少或抑制該細(xì)胞增殖的如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體相接觸，其 中所述肽的結(jié)合部分結(jié)合由該細(xì)胞表達(dá)的受體、配體或抗原。
56.選擇性減少或抑制表達(dá)受體或抗原的高度增殖細(xì)胞的增殖的方法，其包括將該細(xì) 胞與數(shù)量上足以減少或抑制該高度增殖細(xì)胞增殖的如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合 構(gòu)建體相接觸，其中所述肽的結(jié)合部分結(jié)合由該高度增殖細(xì)胞表達(dá)的受體、配體或抗原。
57.選擇性減少或抑制表達(dá)受體或抗原的贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞的增殖的方 法，其包括將該細(xì)胞與數(shù)量上足以減少或抑制該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞增殖的如權(quán) 利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體相接觸，其中所述融合構(gòu)建體的結(jié)合部分結(jié)合由 該細(xì)胞表達(dá)的受體、配體或抗原。
58.如權(quán)利要求55-57任意一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)受體或抗原。
59.如權(quán)利要求55-57任意一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)激素或激素受體。
60.如權(quán)利要求55-57任意一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)性或性腺類固醇激素或 者性或性腺類固醇激素受體。
61.如權(quán)利要求55-57任意一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)受體，該受體結(jié)合促性腺 激素釋放激素I、促性腺激素釋放激素II、八目鰻I(yíng)II促黃體激素釋放激素、促黃體激素β 鏈、促黃體激素、絨毛膜促性腺激素、絨毛膜促性腺激素β -亞單位、促黑色素細(xì)胞激素、雌 二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生長(zhǎng)激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮質(zhì)激素、雌激素、睪 丸激素、雄烯二酮、二氫睪丸激素、脫氫表雄酮、黃體酮、雄性激素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、生 長(zhǎng)激素(GH)、Her2/neU、維生素H、葉酸、鐵傳遞蛋白、甲狀腺刺激激素(TSH)、內(nèi)皮素、蛙皮 素、生長(zhǎng)激素、血管活性腸肽、乳鐵蛋白、整合素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、⑶_8、⑶-33、⑶19、⑶20、 ⑶40、RORl、IGF-I、癌胚抗原(CEA)、α -胎兒球蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列 腺特異性膜抗原(PSAM)、CA 125(殘留上皮卵巢癌)、可溶性白介素-2(IL-2)受體、RAGE-1、 酪氨酸酶、MAGE-I、MAGE-2、NY-ES0-1、Melan-A/MART-l、糖蛋白(gp) 75、gplOO、β -連環(huán)蛋 白、PRAME、MUM-I、ZFP161、泛素-1、Η0Χ-Β6,YB-U骨粘連蛋白、ILF3、葉酸或其衍生物、腫瘤 壞死因子(TNF)家族成員、TNF-α、TNF-β (淋巴細(xì)胞毒素、LT)、TRAIL、i^as、LIGHT、41BB、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、胰島素、血漿銅藍(lán)蛋白、HIV-tat、包含R⑶序列基序的 肽或蛋白、單糖、二糖、寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、巖藻糖或乙酰神經(jīng)氨酸。
62.如權(quán)利要求55-57任意一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞表達(dá)受體，該受體結(jié)合促性腺 激素釋放激素I、促性腺激素釋放激素II、八目鰻I(yíng)II促黃體激素釋放激素、促黃體激素β 鏈、促黃體激素、絨毛膜促性腺激素、絨毛膜促性腺激素β -亞單位、促黑色素細(xì)胞激素、雌 二醇、乙烯雌酚、多巴胺、生長(zhǎng)激素抑制素、促卵泡成熟激素(FSH)、糖皮質(zhì)激素、雌激素、睪 丸激素、雄烯二酮、二氫睪丸激素、脫氫表雄酮、黃體酮、雄性激素、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、生 長(zhǎng)激素(GH)、Herf/neu、維生素H、葉酸、鐵傳遞蛋白、甲狀腺刺激激素(TSH)、內(nèi)皮素、蛙皮 素、生長(zhǎng)激素、血管活性腸肽、乳鐵蛋白、整合素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、⑶_8、⑶-33、⑶19、⑶20、 ⑶40、RORl、IGF-I、癌胚抗原(CEA)、α -胎兒球蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、前列 腺特異性膜抗原(PSMA)、CA 125(殘留上皮卵巢癌)、可溶性白介素-2(IL-2)受體、RAGE-1、 酪氨酸酶、MAGE-I、MAGE-2、NY-ES0-1、Melan-A/MART-l、糖蛋白(gp) 75、gplOO、β -連環(huán)蛋 白、PRAME、MUM-I、ZFP161、泛素-1、Η0Χ-Β6,YB-U骨粘連蛋白、ILF3、葉酸或其衍生物、腫瘤 壞死因子(TNF)家族成員、TNF-α、TNF-β (淋巴細(xì)胞毒素、LT)、TRAIL、i^as、LIGHT、41BB、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、胰島素、血漿銅藍(lán)蛋白、HIV-tat、包含R⑶序列基序的 肽或蛋白、單糖、二糖、寡糖、涎酸、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、乙酰神經(jīng)氨酸或其類似物。
63.治療患有高度增殖紊亂的對(duì)象的方法，其包括向該對(duì)象施用足以治療高度增殖紊 亂的量的如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體。
64.治療患有贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤的對(duì)象的方法，其包括向該對(duì)象施用足以 治療贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤的量的如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體。
65.減少或抑制贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至其它位點(diǎn)或者在遠(yuǎn)離原發(fā)贅生 瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤的其它位點(diǎn)形成或建立轉(zhuǎn)移性贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤的 方法，其包括向?qū)ο笫┯靡欢康娜鐧?quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體，該量足以 減少或抑制贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至其它位點(diǎn)或者在遠(yuǎn)離原發(fā)贅生瘤、腫瘤、 癌癥或惡性腫瘤的其它位點(diǎn)形成或建立轉(zhuǎn)移性贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤。
66.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤為轉(zhuǎn)移性、 非轉(zhuǎn)移性或良性的。
67.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤包含實(shí)體細(xì) 胞物質(zhì)。
68.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤包含造血細(xì)胞。
69.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤包括癌、肉 瘤、淋巴瘤、白血病、腺瘤、腺癌、黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、 成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤、間皮瘤、網(wǎng)狀內(nèi)皮的、淋巴的或造血的贅生 瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤。
70.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該肉瘤包括淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、軟 骨肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤或纖維肉瘤。
71.如權(quán)利要求68所述的方法，其中該造血的贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤包括骨髓 瘤、淋巴瘤或白血病。
72.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤包括肺、甲 狀腺、頭或頸、鼻咽、喉、鼻或竇、腦、脊柱、乳腺、腎上腺、腦垂體腺、甲狀腺、淋巴腺、胃腸的 (嘴、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸(小腸)、結(jié)腸、直腸)、泌尿生殖道(子宮、卵巢、子宮 頸、子宮內(nèi)膜、膀胱、睪丸、陰莖、前列腺)、腎、胰腺、肝、骨、骨髓、淋巴腺、血液、肌肉或皮膚 贅生瘤、腫瘤或癌癥。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其中該肺贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤包括小細(xì)胞肺 癌或非小細(xì)胞肺癌。
74.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤包括干細(xì)胞 贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤。
75.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該方法抑制或減少該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡 性腫瘤的復(fù)發(fā)或進(jìn)展。
76.如權(quán)利要求63或64的方法，其進(jìn)一步包括施用抗細(xì)胞增殖、抗贅生瘤、抗腫瘤、抗 癌癥或免疫增強(qiáng)治療或療法。
77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中該治療或療法包括手術(shù)切除、放射療法、電離或化 學(xué)放射療法、化學(xué)療法、免疫療法、局部或區(qū)域熱(高熱)療法或疫苗接種。
78.如權(quán)利要求76所述的方法，其中該治療或療法包括施用烷化劑、抗代謝物、植物提 取物、植物生物堿、亞硝基脲、激素、核苷或核苷酸類似物。
79.如權(quán)利要求76所述的方法，其中該治療或療法包括施用環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、環(huán)孢 菌素A、強(qiáng)的松龍、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、硫鳥(niǎo) 嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、AZT、5-氮胞苷(5-AZC)和5-氮胞苷相關(guān)化合物、博來(lái)霉素、 放射菌素D、光神霉素、絲裂霉素C、卡氮芥、環(huán)己亞硝脲、司莫司汀、鏈脲菌素、羥脲、順式鉬 氨、米托坦、甲基芐胼、氮烯唑胺、紫杉酚、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、阿霉素或二溴甘露醇。
80.如權(quán)利要求76所述的方法，其中該治療或療法包括施用淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞、樹(shù)狀細(xì)胞、NK細(xì)胞或B-細(xì)胞。
81.如權(quán)利要求76所述的方法，其中該治療或療法包括施用抗體、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞 存活因子、細(xì)胞分化因子、細(xì)胞因子或趨化因子。
82.如權(quán)利要求76所述的方法，其中該治療或療法包括施用IL-2、IL-Iα、IL-I β、 IL-3、IL-6、IL-7、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GMCSF)、IFNi、IL-12、TNF-α、 TNFβ ,MIP-Ια,MIP-I β、RANTES, SDF-U MCP-U MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸粒細(xì)胞親合 素、嗜酸粒細(xì)胞親合素 _2、I-309/TCA3、ATAC, HCC-U HCC-2、HCC-3、LARC/MIP-3 α、PARC、 TARC、CK3、0(β 6、CK3 7、CK3 8、CK3 9、CK3 ΙΙΧΚβ 12、C10、IL_8、GR0 α、GR0 β、ΕΝΑ_78、 GCP-2、PBP/CTAPIII β -TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1 或淋巴細(xì)胞趨化因子。
83.如權(quán)利要求76所述的方法，其中該融合構(gòu)建體施用于該抗細(xì)胞增殖、抗贅生瘤、抗 腫瘤、抗癌或免疫增強(qiáng)治療或療法施用之前、施用同時(shí)或施用之后。
84.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該對(duì)象已經(jīng)歷了手術(shù)切除、化學(xué)療法、免疫療 法、電離或化學(xué)放射療法、局部或區(qū)域熱(高熱)療法或疫苗接種。
85.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該對(duì)象是手術(shù)切除、化學(xué)療法、免疫療法、電 離或化學(xué)放射療法、局部或區(qū)域熱(高熱)療法或疫苗接種的候選者。
86.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該對(duì)象不是手術(shù)切除、化學(xué)療法、免疫療法、電離或化學(xué)放射療法、局部或區(qū)域熱(高熱)療法或疫苗接種的候選者。
87.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該治療導(dǎo)致該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性細(xì)胞 量、體積、大小或細(xì)胞數(shù)量的部分或完全破壞，刺激、誘導(dǎo)或提高贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性 細(xì)胞壞死、溶解或凋亡，減少贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤體積大小、細(xì)胞量，抑制或防止 贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫瘤體積、量、大小或細(xì)胞數(shù)量的進(jìn)展或提高或者延長(zhǎng)壽命。
88.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該治療導(dǎo)致與該贅生瘤、腫瘤、癌癥或惡性腫 瘤相關(guān)或由其引起的不良癥狀或并發(fā)癥的嚴(yán)重性、持續(xù)時(shí)間或頻率的減少或下降。
89.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該治療導(dǎo)致疼痛、不適、惡心、虛弱或嗜睡的 減少或下降。
90.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該治療導(dǎo)致更高的精力、食欲、改善的靈活性 或心理狀態(tài)。
91.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該對(duì)象為哺乳動(dòng)物。
92.如權(quán)利要求64或65所述的方法，其中該對(duì)象為人。
93.降低動(dòng)物生育力的方法，其包括向該動(dòng)物施用一定量的足以降低生育力的如權(quán)利 要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體。
94.如權(quán)利要求93所述的方法，其中該動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。
95.如權(quán)利要求93所述的方法，其中該動(dòng)物為人。
96.減少或治療動(dòng)物子宮內(nèi)膜異位的方法，其包括向該動(dòng)物施用一定量的足以治療動(dòng) 物子宮內(nèi)膜異位的如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體。
97.減少或治療良性前列腺增生的方法，其包括向動(dòng)物施用一定量的足以治療良性前 列腺增生的如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體。
98.減少或治療纖維瘤或息肉的方法，其包括向動(dòng)物施用一定量的足以治療纖維瘤或 息肉的如權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體。
99.如權(quán)利要求98所述的方法，其中該纖維瘤或息肉存在于乳腺、子宮、陰道、子宮頸 或輸卵管。
100.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述融合構(gòu)建體通過(guò)更低的IC50 值確定具有比 Phor21-3 CG-ala、Phor21_GSGGS-β CG-ala、Phor21-ASAAS-β CG-ala 或 PhorH-β CG-ala更高的抗細(xì)胞增殖活性。
101.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述融合構(gòu)建體具有比 Phor21-^ CG-ala, Phor21-GSGGS-β CG-ala, Phor21-ASAAS-β CG-ala 或 Phor 14- β CG-ala更小的IC50/ (HA50，溶血活性)比例。
102.如權(quán)利要求1或2所述的融合構(gòu)建體，其中所述融合構(gòu)建體具有小于約0.02、 0. 01或0. 005的IC50/(HA50，溶血活性)比例。
103.選自 KFAKFAKKFAKFAKK、 KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA 、 KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 的分離或純化的 肽。
104.選自 KFAKFAKKFAKFAKK、 KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA、 KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF 和 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 的分離或純化的 肽，其中一個(gè)或多個(gè)K殘基被F或L殘基的任意一個(gè)所替換，一個(gè)或多個(gè)F殘基被K、A或L殘基的任意一個(gè)所替換，或者一個(gè)或多個(gè)A殘基被K、F或L殘基的任意一個(gè)所替換。
105.編碼如權(quán)利要求103或104所述的肽的核酸。
106.包含編碼如權(quán)利要求103或104所述的肽的核酸的載體。
107.以包含編碼如權(quán)利要求103或104所述的肽的核酸的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
108.表達(dá)如權(quán)利要求103或104所述的肽的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及融合構(gòu)建體，使用融合構(gòu)建體的方法以及治療不良的或異常的細(xì)胞增殖或高度增殖疾病(例如腫瘤、癌癥、贅生瘤(neoplasia)和惡性腫瘤)的方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102089320SQ200980111383
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日
發(fā)明者卡羅拉·勒施奈, 赫克托·阿里拉 申請(qǐng)人:埃斯佩蘭斯醫(yī)藥公司, 路易斯安那州立大學(xué)以及農(nóng)業(yè)和機(jī)械學(xué)院監(jiān)事會(huì)