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      用于腸產(chǎn)毒性大腸桿菌導(dǎo)致的豬斷奶后腹瀉的疫苗的制作方法

      文檔序號:1178297閱讀:325來源:國知局

      專利名稱::用于腸產(chǎn)毒性大腸桿菌導(dǎo)致的豬斷奶后腹瀉的疫苗的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明涉及疫苗。更具體地,本發(fā)明涉及用于豬中腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli)(ETEC)導(dǎo)致的斷奶后腹瀉的疫苗。背景大腸桿菌是細(xì)菌中的常見物種,尤其以導(dǎo)致包括腹瀉的腸道問題而著稱。與腸道疾病和/或腹瀉相關(guān)的一類大腸桿菌是所謂的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)。ETEC可能最著名的是導(dǎo)致旅行者腹瀉。食物和/或水供給的污染通常是ETEC的來源。ETEC導(dǎo)致的疾病是由于細(xì)菌粘附到腸壁上和毒素(例如,腸毒素)釋放進(jìn)入宿主系統(tǒng)中這兩者造成的。與腸壁的粘附是經(jīng)由排列于細(xì)菌外表并使使細(xì)菌附著的一種或多種“菌毛”(即,菌體附器)而實(shí)現(xiàn)的。特定的ETEC菌株的菌毛往往具有宿主特異性。例如,感染豬的ETEC攜帶K-88菌毛而感染人的菌株攜帶CFAI和CFAII菌毛。ETEC產(chǎn)生兩種毒素?zé)岵环€(wěn)定性“LT”毒素和熱穩(wěn)定性“ST”毒素。LT毒素包含一個活性亞基或“A”亞基和五個結(jié)合亞基或“B”亞基。LT以類似于霍亂毒素的方式作用,因?yàn)槠涮岣吣c細(xì)胞中cAMP的水平,并且這導(dǎo)致電解質(zhì)和水的排泄(腹瀉)的增加。ST毒素可以是“a型”(S卩,STa)或“b型”(S卩,STb)。ST刺激cGMP的產(chǎn)生,還導(dǎo)致增加的液體排泄和腹瀉。由于腸產(chǎn)毒性大腸桿菌菌株是非侵入性的,它們不會導(dǎo)致炎癥,血性腹瀉或系統(tǒng)性癥狀比如發(fā)燒。在北美的(和世界范圍的)養(yǎng)豬業(yè)中,ETEC導(dǎo)致的新生兒和斷奶后腹瀉是經(jīng)濟(jì)上最重要的豬疾病之一。例如,據(jù)認(rèn)為ETEC菌株是造成10.8%的所有斷奶前豬死亡和多達(dá)3%以上的所有斷奶的豬死亡的原因。(Tubb等人,1993,PreweaningmorbidityandmortalityintheUnitedStatesswineheed(美國豬群中斷奶前發(fā)病率和死亡率),SwineHealthProd.1:21-28;Hampson,1994;PostweaningEscherichiacolidiarrheainpigs(豬的斷奶后大腸桿菌腹瀉),第171-191頁,出版中;C.L.Gyle,Escherichiacoliindomesticanimalsandhumans(家畜禾口人中的大腸桿菌),CABInternational,Oxon,UK;Dewey等人,2000,Theimpactofdiseaseonnurserypigproduction(疾病對幼豬詞養(yǎng)的影口向),Amer.Assoc.SwinePractictionsers,第3-11頁,Indianapolis;它們的全部公開內(nèi)容在此通過引用并入)。長期以來需要治療和/或預(yù)防豬的新生兒和斷奶后腹瀉的方法。簡述本發(fā)明提供疫苗的設(shè)計(jì)、材料、制造方法,以及使用替代物。示例性疫苗可以是抗腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的疫苗。所述疫苗可包含大腸桿菌菌株。所述大腸桿菌菌株可產(chǎn)生K88菌毛和包含與STb腸毒素連接的突變體LT腸毒素的融合蛋白。生產(chǎn)用于豬斷奶后腹瀉的疫苗的示例性方法可包括提供第一種大腸桿菌菌株。該菌株可包含eltAB基因和estB基因。該方法還可包括擴(kuò)增eltAB基因,使eltAB基因突變,生成突變體eltAB基因與estB基因的基因融合體,并利用該基因融合體轉(zhuǎn)化第二種大腸桿菌菌株。另一種示例性疫苗可以是用于豬斷奶后腹瀉的活疫苗。該疫苗可包含大腸桿菌菌株。該大腸桿菌菌株可產(chǎn)生K88菌毛和包含與STb腸毒素連接的突變體LT腸毒素的融合蛋白。以上對一些實(shí)施方式的概述并不意在描述本發(fā)明的每個公開的實(shí)施方式或每個實(shí)現(xiàn)。下面的附圖和詳述將更加具體的闡述這些實(shí)施方式。詳述對于以下所定義的術(shù)語,除非在權(quán)利要求書或本說明書中的其它地方給出有不同的定義,否則將采用這些定義。不論是否明確指出,認(rèn)為本文的所有數(shù)值都被術(shù)語“約,,修飾。術(shù)語“約,,一般指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)為與所列數(shù)值等價的數(shù)字的范圍(即,具有同樣的功能或結(jié)果)。在很多情況中,術(shù)語“約”可包含最近的有效數(shù)字周圍的數(shù)字。通過端點(diǎn)列舉的數(shù)值范圍包括在此范圍內(nèi)的所有數(shù)字(例如,1至5包括1、1.5、2,2.75,3,3.80、4和5)。除非內(nèi)容中另外清楚地指出,否則如本說明書和所附的權(quán)利要求書中所使用的,單數(shù)形式“一”、“一個”和“所述”包括復(fù)數(shù)的指示物。除非內(nèi)容中另外清楚地明確指出,否則如本說明書和所附的權(quán)利要求書中所使用的,術(shù)語“或”通常以包括“和/或”的含義使用。以下的詳述應(yīng)該根據(jù)附圖進(jìn)行理解,其中相同的元件在不同的附圖中編號相同。附圖不必按比例繪制,它描繪例證性的實(shí)施方式并且不意在限制本發(fā)明的范圍。本文所描述的示例性疫苗可被設(shè)計(jì)成對防止腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)導(dǎo)致的腹瀉是有效的。該疫苗可對防止豬中ETEC導(dǎo)致的斷奶后腹瀉有效。涵蓋了可利用相同或相似的設(shè)計(jì)理念來設(shè)計(jì)的其他疫苗,這些疫苗可對防止在包含人的其它動物中由ETEC導(dǎo)致的腹瀉有效。此外,可將該疫苗設(shè)計(jì)為易于生產(chǎn)且安全生產(chǎn)的,并且基本上使飼養(yǎng)、處理、運(yùn)輸、繁殖或以其它方式與豬工作的任何人能夠使用這種疫苗防止豬的斷奶后腹瀉??稍O(shè)計(jì)該疫苗使其可用方便的方式遞送給豬。例如,疫苗可通過食物供給(例如,利用飼料、牛奶或代乳品和/或水)口服施用給豬。這種施用途徑可能是期望的,例如,因?yàn)檫@種途徑可以使豬所經(jīng)受的操作量最少化。選擇性地,可用其它適宜方式施用該疫苗,包括胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、局部或皮下。當(dāng)然,施用途徑可以是被指定的或另外由疫苗的形式所決定的。疫苗的設(shè)計(jì)可考慮豬腹瀉中的ETEC的關(guān)鍵毒力因子,關(guān)鍵毒力因子可包括1)介導(dǎo)細(xì)菌附著于宿主腸細(xì)胞的表面并開始群集的細(xì)菌粘附分子;和2)造成流體分泌的腸毒素。例如,最近研究顯示斷奶后腹瀉所涉及的大腸桿菌菌株的50-70%以上產(chǎn)生K88型菌毛。在K88菌毛中,K88ac是在北美發(fā)現(xiàn)的僅有的K88變體,是迄今世界上最常見的。K88ac菌毛也已在豬的ETEC大腸桿菌病中被確認(rèn)為必要的毒力決定簇(參見,例如,F(xiàn)rancis等人,1998,Expressionofmuncin-typeglycoproteinK88receptorsstronglycorrelateswithpigletsusceptibilitytoK88+enterotoxigenieEscherichiacoli,butadhesionsofthisbacteriumtobrushbordersdoesnot(粘蛋白型糖蛋白K88受體的表達(dá)與小豬對K88+腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的易感性強(qiáng)相關(guān),但此細(xì)菌對刷狀緣的粘附與之不相關(guān)),Infect.Immun.66,4050-4055,其公開內(nèi)容在此通過引用方式并入)。因此,以K88菌毛和/或K88ac菌毛為目標(biāo)作為抗原的疫苗可能是期望的。所有K88+菌株產(chǎn)生LT和STb(參見,例如,F(xiàn)rancis,D.H.,2002,EnterotoxigenicEscherichiacoliinfectioninpigsanditsdiagnosis(腸產(chǎn)毒j"生大腸桿菌在豬中白勺感染及其診斷),J.SwineHealthProd.10,171-175;Frydendahl,K.,2002,PrevalenceofserogroupsandvirulencegenesinEscherichiacoliassociatedwitypostweaningdiarrheaandedemadiseaseinpigsandacomparisonofdiagnosticapproaches(%豬的斷奶后腹瀉和水腫病相關(guān)的大腸桿菌血清群和毒力基因的流行以及診斷方法的比較),Vet.Microbiol.85,169-182;禾口Zhang等人,2007,PrevalenceofvirulencegenesinEscherichiacolistrainsisolatedfromyoungpigswithdiarrheainNorthCentralU.S.(美國中北部由患有腹瀉的幼豬中分離的大腸桿菌菌株中的毒力基因的流行),Vet.Microbiol.123,145-152;它們?nèi)康恼w公開內(nèi)容在此通過引用并入)。大體上斷奶后腹瀉所涉及的所有大腸桿菌菌株都產(chǎn)生STb。一些研究已證實(shí)LT和STb腸毒素是造成與ETEC感染相關(guān)的腹瀉的原因(參見,例如,Berberov等人,2004,Relativeimportanceofheat-labileenterotoxininthecausationofseverediarrhealdiseaseinthegnotobioticpigletmodelbyastrainofentertoxigenicEscherichiacolithatproducesmultipleenterotoxins(在悉生小豬模型中由產(chǎn)生多種腸毒素的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的菌株導(dǎo)致的嚴(yán)重腹瀉疾病中熱不穩(wěn)定性腸毒素的相對重要性),Infect.Immun.72,3914-3924禾口Zhang等人,2006,Significanceofheat-stabileandheat-labileenterotoxinsinporcinecolibacillosisinanadditivemodelforpathogenicitystudies(在用于病原性研究的加性模型中熱穩(wěn)定性腸毒素和熱不穩(wěn)定性腸毒素在豬的大腸桿菌病中的重要性),Infect.Immun.74,3107-3114;它們的整個公開內(nèi)容全部在此通過引用并入)。因此,靶向LT和/或STb作為抗原的疫苗可能是期望的。此外,含有K88ac、LT和STb的抗原的疫苗可能是期望的,因?yàn)槠鋵⒏采w主要豬病原的所有必要的毒力決定簇。應(yīng)用該設(shè)計(jì)策略的疫苗的獨(dú)特性在于可產(chǎn)生出表達(dá)ETEC的所有主要毒力因子的抗原的疫苗。這些疫苗中的至少一些在小豬中似乎是基本上無毒的。本文所描述的疫苗的另一個獨(dú)特方面在于疫苗既可作為競爭性排斥益生菌又可作為疫苗行使功能(例如,在至少一些實(shí)施方式中,本文所描述的疫苗可具有益生菌功效)。微生物有機(jī)體中的競爭性排斥益生菌與病原競爭由所述病原導(dǎo)致疾病所需的在宿主內(nèi)的生態(tài)位。在養(yǎng)豬業(yè)中豬斷奶時可能改變飼養(yǎng)者,且對不久之后發(fā)生的ETEC疾病具有易患病性,而雙重目的的益生菌/疫苗菌株的極大好處是能夠迅速防止該疾病。此外,因?yàn)橛袡C(jī)體可能是活疫苗,可經(jīng)飲水系統(tǒng)遞送,并不需要單獨(dú)動物操作,這是養(yǎng)豬業(yè)所關(guān)注的問題。疫苗在至少一些實(shí)施方式中,本文所描述的疫苗是設(shè)計(jì)為保護(hù)幼豬避免腸產(chǎn)毒性大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉疾病的活疫苗。疫苗可包含表達(dá)來自K88ac菌毛的抗原和基因工程融合蛋白的大腸桿菌的活菌株。融合蛋白可包含突變體和/或無毒性的熱不穩(wěn)定性(LT)腸毒素和熱穩(wěn)定性B型(STb)腸毒素。在其他實(shí)施方式中,疫苗可包含表達(dá)來自K88ac菌毛的抗原及突變體和/或無毒性熱不穩(wěn)定性(LT)腸毒素的大腸桿菌的活菌株。在又一些實(shí)施方式中,疫苗可包含表達(dá)來自K88ac菌毛的抗原及突變體和/或無毒性熱穩(wěn)定性B型(STb)腸毒素的大腸桿菌的活菌株。在又一些實(shí)施方式中,疫苗可包含產(chǎn)生突變體和/或無毒性熱不穩(wěn)定性(LT)腸毒素、無毒性熱穩(wěn)定性B型(STb)腸毒素、或兩者(例如以融合蛋白連接)的大腸桿菌的活菌株。在又一些實(shí)施方式中,疫苗可包含表達(dá)除K88ac外的菌毛的抗原的大腸桿菌的活菌株,所述菌毛例如與ETEC相關(guān)的其它菌毛。這些疫苗還可表達(dá)突變體和/或無毒性熱不穩(wěn)定性(LT)腸毒素、突變體和/或無毒性熱穩(wěn)定性B型(STb)腸毒素或兩者。本文所描述的疫苗可以通過接種豬的食物供給來遞送給豬。例如,可將疫苗加入到豬的飼料、牛奶(或代乳品)、水或全部這些之中。本文所描述的疫苗可通過以下步驟制造和/或生產(chǎn)提供包含eltAB基因和estB基因的第一種大腸桿菌菌株,擴(kuò)增eltAB基因,使eltAB基因突變,生成突變體eltAB基因與estB基因的基因融合體,并利用所述基因融合體轉(zhuǎn)化第二種大腸桿菌菌株。實(shí)施例本發(fā)明可通過參考以下的實(shí)施例進(jìn)一步闡明,這些實(shí)施例用于例示一些優(yōu)選的實(shí)施方式,而并不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1eltAB基因的分離和克隆用于eltAB基因(編碼LT腸毒素)和estB基因(編碼STb腸毒素)的來源是來自被指定為“野外分離株3030-2”的豬腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)野外分離株的全基因組DNA0野外分離株3030-2根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2008年6月6日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心,10801UniversityBlvd.,Manassas,Va.20110-2209,USA(ATCC),并被給予ATCC專利保藏編號PTA-擬62。本專利一經(jīng)授權(quán),除37C.F.R.§1.808(b)中所規(guī)定的要求外,保藏材料可被公眾得到的所有限制將會不可撤回地取消,并且保藏期限將遵照37C.F.R.§1.806。利用DNeasy組織試劑盒(可從QIAGEN,CA公司商業(yè)上購得)從野外分離株3030-2中分離基因組DNA。所得到的分離的基因組DNA保存為或稀釋為0.1μg/μ1的貯存液。該貯存液用作擴(kuò)增eltAB(編碼LT腸毒素)基因和estB(編碼STb腸毒素)基因的DNA來源和/或模板。eltAB基因主要由編碼SEQIDNO2所列的氨基酸序列的SEQIDNO:1所列的核苷酸序列組成。estB基因主要由編碼SEQIDNO:4所列的氨基酸序列的SEQIDNO3所列的核苷酸序列組成。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增eltAB基因。合成用于此反應(yīng)的兩種引物指定為“LT-F”的合成的DNA寡核苷酸,主要由SEQIDNO:5所列的核苷酸序列組成,和指定為“LT-R”的合成的DNA弓丨物,主要由SEQIDNO:6所列的核苷酸序列組成。PCR在BIORADPTC-100熱循環(huán)儀(BI0RAD,CA)中以含有下列物質(zhì)的50μ1的反應(yīng)體積進(jìn)行1XpfuDNA聚合酶緩沖液(含Μ++)、0·2mMdNTP、各0.5μM的LT-F和LT-R、來自野外分離株3030-2的基因組DNA的1μ1貯存液和1單位的pfuDNA聚合酶(Strategene,CA)。PCR程序包括94°C下2分鐘的1個循環(huán);94°C下30秒、55°C下30秒和72°C下2分鐘的30個循環(huán);然后72°C下6分鐘的延伸。利用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增的eltAB基因(即來自PCR的反應(yīng)產(chǎn)物)具有正確大小,且然后將其從凝膠中切下并利用QIAquick凝膠提取試劑盒(可從QIAGEN,CA商業(yè)上購得)進(jìn)行純化。然后將所純化的eltAB基因PCR產(chǎn)物洗脫到35μ1的ddH20中。將eltAB基因克隆到pBR322質(zhì)粒載體(可從!Iomega,WI商業(yè)上購得)中。首先利用限制性酶EcoRV(可從NewEnglandBiolab,MA商業(yè)上購得)在37°C下在含有IX緩沖液(用于EcoRV的緩沖液3)、1XBSA和20單位的酶的25μ1反應(yīng)體系中消化pBR322載體1小時。消化后,利用QIAquick凝膠提取試劑盒0!IAGEN,CA)通過瓊脂糖凝膠電泳純化所消化的PBR322質(zhì)粒。隨后將所消化的PBR322質(zhì)粒稀釋到35μ1ddH20中。將eltAB基因克隆到載體pBR322中包括利用T4DNA連接酶(由NewEnglandBiolabs,MA商業(yè)上購得)在含有2μ1的IOX緩沖液、1μ1的Τ4連接酶、7μ1的消化的PBR322貯存液和10μ1的eltAB貯存液的20μ1反應(yīng)體系中在16°C下過夜進(jìn)行的連接反應(yīng)。利用ECM630(BTX,CA)電穿孔儀在0.Icm間距的電擊杯(Sigma,M0)中將2微升的T4連接產(chǎn)物引入來自指定為“野外分離株1836-2”的豬野外分離株的100μ1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,電穿孔儀設(shè)置為2.5kV、25uF電容、200歐電阻。野外分離株1836-2是缺少eltAB基因和estB基因的非病原性的豬大腸桿菌野外分離株。野外分離株1836-2根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2008年6月6日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心,10801UniversityBlvd.,Manassas,Va.20110-2209,USA(ATCC),并被給予ATCC專利保藏編號PTA-擬60。本專利一經(jīng)授權(quán),除37C.F.R.§1.808(b)中所規(guī)定的要求外,保藏材料可被公眾得到的所有限制將會不可撤回地取消,并且保藏期限將遵照37C.F.R.§1.806。菌株1836-2表達(dá)K88ac菌毛并群集在K88受體陽性豬的腸上皮中。單獨(dú)的1836-2菌株在幼豬中并不導(dǎo)致疾病(Zhang等人,2006,Significanceofheat-stableandheat-labileenterotoxinsinporcinecolibacillosisinanadditivemodelforpathogenicitystudies(在用于病原性研究的加性模型中熱穩(wěn)定性腸毒素和熱不穩(wěn)定性腸毒素在豬的大腸桿菌病中的重要性),Infect.Immun.74:3107_3114,其整體公開內(nèi)容在此通過引用并入)。將50μ1轉(zhuǎn)化的1836-2細(xì)胞鋪展到含有50μg/ml氨芐西林的瓊脂板上。將板在37°C下孵育過夜。在板上觀察到陽性菌落(選擇氨芐青霉素抗性)。利用試劑盒QIApr印SpinMiniprep試劑盒QIAGEN,CA)從陽性菌落中提取質(zhì)粒DNA,然后先用PCR進(jìn)行篩選,再利用BigDyeTerminator試劑盒(可從AppliedBiosystem,CA商業(yè)上購得)進(jìn)行測序以確保eltAB基因插入到pBR322中且保持在正確的閱讀框中。將所得的含有eltAB基因的質(zhì)粒載體指定為pLT,并進(jìn)行純化(QIApr印SpinMiniprep試劑盒,QIAGEN,CA),并稀釋為0.1μg/μ1貯存液。實(shí)施例2eltAB基因的突變利用定點(diǎn)誘變將pLT中的eltAB基因進(jìn)行突變以將對應(yīng)于eltAB基因的第192位氨基酸殘基的核苷酸由“AGA”變?yōu)椤癎GA”。利用質(zhì)粒pLT作為模板生產(chǎn)含有該突變體的序列的質(zhì)粒,并將其指定為pLTW2。為了生產(chǎn)pLTW2突變體,在PCR反應(yīng)中使用兩種內(nèi)部PCR引物指定為“LT192-F”的合成的DNA寡核苷酸,主要由SEQIDNO7所列的核苷酸序列組成,和指定為“LT192-R”的合成的DNA寡核苷酸,主要由SEQIDNO8所列的核苷酸序列組成。PCR在BIORADPTC-100熱循環(huán)儀(BIORAD,CA)中以含有下列物質(zhì)的50μ1的反應(yīng)體積進(jìn)行1μ1的PLT貯存液、IXpfuDNA聚合酶緩沖液(含Mg++)、0.2mMdNTP、各0.5μM的LT192-F和LT192-R,1μ1的pBR322貯存液(IOOng/μ1)和1單位的pfuDNA聚合酶(Strategene,CA)。PCR程序包括94°C下2分鐘的1個循環(huán);94°C下30秒、55°C下30秒和72°C下2分鐘的30個循環(huán);然后72°C下6分鐘的延伸。利用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增的突變的eltAB基因(即來自PCR的反應(yīng)產(chǎn)物)具有正確大小,且然后將其從凝膠中切下并利用QIAquick凝膠提取試劑盒(可從QIAGEN,CA商業(yè)上購得)進(jìn)行純化。然后將所純化的eltAB基因PCR產(chǎn)物洗脫到35μ1的ddH20中。實(shí)施例3突變的e11AB基因的克隆利用pLT質(zhì)粒作為DNA模板,利用PCR引物擴(kuò)增質(zhì)粒pBR322的一部分和eltAB基因的5'端以加上含有SfcI限制性位點(diǎn)的5'突出端。該反應(yīng)的引物包括指定為“pBREcoRI-F”的合成的DNA寡核苷酸,主要由SEQIDNO9所列的核苷酸序列所組成,和LT撤-R。PCR在BIORADPTC-100熱循環(huán)儀(BI0RAD,CA)中以含有下列物質(zhì)的50μ1的反應(yīng)體積進(jìn)行:1μ1的pLT貯存液、IXpfuDNA聚合酶緩沖液(含Mg++)、200nMdNTP、各0·5μΜ的pBREcoRI-F和LT192-R以及1單位的pfuDNA聚合酶(Strategene,CA)。PCR程序包括94°C下2分鐘的1個循環(huán);94°C下30秒、55°C下30秒和72°C下2分鐘的30個循環(huán);然后72°C下6分鐘的延伸。還利用PCR引物擴(kuò)增eltAB基因的3'端和質(zhì)粒pBR322的一部分以加上具有fegl限制性位點(diǎn)的3'突出端。該反應(yīng)的引物包括指定為“pBREagl-R”的合成的DNA寡核苷酸,主要由SEQIDNO10所列的核苷酸序列組成,和LT撤-F。PCR在BIORADPTC-100熱循環(huán)儀(BI0RAD,CA)中以含有下列物質(zhì)的50μ1的反應(yīng)體積進(jìn)行1μ1的pLT貯存液、1XpfuDNA聚合酶緩沖液(含Mg++)、0.2mMdNTP、各0.5μM8的LT192-F和pBREagl-R以及1單位的pfuDNA聚合酶(Strategene,CA)。PCR程序包括94°C下2分鐘的1個循環(huán);94°C下30秒、55°C下30秒和72°C下2分鐘的30個循環(huán);然后72°C下6分鐘的延伸。將所擴(kuò)增的突變的eltAB基因的5'端和3'端片段進(jìn)行純化(利用試劑盒QIAquickGelExtraction,QIAGEN),且然后在SOE(剪接重疊延伸)PCR中連接成突變的豬eltAB基因(編碼LTw2蛋白)。SOEPCR在1XpfuDNA聚合酶緩沖液(含Mg++)、0·2mMdNTP、純化的5'端和3'端PCR產(chǎn)物各20μ1、1單位的pfu聚合酶和0.5單位的taqDNA聚合酶(AppliedBiosystem,CA)的反應(yīng)體系中進(jìn)行。SOEPCR程序包括94°C下2分鐘的1個循環(huán);94°C下30秒、45°C下30秒和72°C下3分鐘的10個循環(huán);然后72°C下10分鐘的延伸。利用限制性酶SfcI和fegl消化該突變的eltAB基因(LT192),用同樣方法處理載體PBR322。利用SfcI和fegl限制性酶(NewEnglandBiolab,MA)的限制性酶消化在37°C下在含有1X緩沖液(用于fegl的緩沖液3和用于SfcI的緩沖液4)、1XBSA和20單位的酶的25μ1反應(yīng)體系中進(jìn)行1小時。利用QIAquick凝膠提取試劑盒0)IAGEN,CA)通過瓊脂糖凝膠電泳純化所消化的產(chǎn)物,并利用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolab,MA)在16°C下在含有2μ1的IOX緩沖液、1μ1的Τ4連接酶、7μ1的載體和10μ1的插入片段的20μ1反應(yīng)體系中連接過夜。使用2.5kV、25uF電容、200歐電阻通過電穿孔將2微升的T4連接產(chǎn)物引入到100μ1的1836-2大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將50μ1的轉(zhuǎn)化的1836-2細(xì)胞鋪展到含有50μg/ml氨芐西林的瓊脂板上。將板在37°C下孵育過夜。在板上觀察到陽性菌落(選擇氨芐西林抗性)。利用試劑盒QIApr印SpinMinipr印試劑盒QIAGEN,CA)從陽性菌落中提取質(zhì)粒DNA,然后先用PCR進(jìn)行篩選,再利用BigDyeTerminator試劑盒(可從AppliedBiosystem,CA商業(yè)上購得)進(jìn)行測序。所得的含有突變的eltAB基因的質(zhì)粒載體被指定為pLT192,并對其進(jìn)行純化(QIApr印SpinMiniprep試劑盒,QIAGEN,CA),然后稀釋為0.1μg/μ1的貯存液。實(shí)施例4突變的eltAB基因與estB基因的基因融合體的生成為了生成突變的eltAB基因與estB基因的基因融合體,利用兩次PCR反應(yīng)。對于第一次PCR反應(yīng),我們指定了兩種附加的PCR引物指定為“STb:LT_F5”的合成的DNA寡核苷酸,主要由SEQIDN0:11所列的核苷酸序列組成,和指定為“LT:STb_R4”的合成的DNA寡核苷酸,主要由SEQIDN0:12所列的核苷酸序列組成?!癝Tb:LT_F5”正向引物包含突變的eltAB基因的3‘端的核苷酸、Gly-Pro-Gly-Pro接頭和estB基因的5‘端的核苷酸。"LTSTb_R4”反向引物包含estB基因的5'端、接頭和突變的eltAB基因的3'端。利用來自質(zhì)粒pLTli32的DNA模板和引物pBREcoRI-F和LT:STb_R4進(jìn)行的PCR擴(kuò)增pBR322載體的一部分、全部的突變的eltAB基因(其終止子被缺失)、Gly-Pro接頭和estB基因的5'端的部分。9第一次PCR在BIORADPTC-100熱循環(huán)儀(BI0RAD,CA)中在含有下列物質(zhì)的50μ1的反應(yīng)體積中進(jìn)行1μ1的PLTli32貯存液、IXpfuDNA聚合酶緩沖液(含Mg++)、0.2mMdNTP、各0.5μM的STbLT-F5和LTSTb_R4和1單位的pfuDNA聚合酶(Strategene,CA)。PCR程序包括94°C下2分鐘的1個循環(huán);94°C下30秒、55°C下30秒和72°C下2分鐘的30個循環(huán);然后72°C下6分鐘的延伸。第二次PCR利用來自野外分離株3030-2的基因組DNA和PCR引物STbLT-F5和指定為“STbEagl-R”的合成的DNA寡核苷酸,該合成的DNA寡核苷酸主要由SEQIDNO13所列出的核苷酸序列組成,第二次PCR擴(kuò)增突變的eltAB基因的3'端的部分、接頭和estB基因。PCR在BI0RADPTC-100熱循環(huán)儀(BI0RAD,CA)中在含有下列物質(zhì)的50μ1的反應(yīng)體積中進(jìn)行1μ1的野外分離株3030-2的DNA貯存液、1XpfuDNA聚合酶緩沖液(含Mg++)、0.2mMdNTP、各0.5μM的STbLT-F5和STbEagl-R、和1單位的pfuDNA聚合酶(Strategene,CA)。PCR程序包括94°C下2分鐘的1個循環(huán);94°C下30秒、55°C下30秒和72°C下2分鐘的30個循環(huán);然后72°C下6分鐘的延伸。利用SOEPCR連接擴(kuò)增的產(chǎn)物,得到LT192-Gly-Pr0-接頭-estB的融合產(chǎn)物。SOEPCR程序由94°C下2分鐘的1個循環(huán);94°C下30秒、45°C下30秒和72°C下3分鐘的10個循環(huán);然后72°C下10分鐘的延伸組成。利用限制性酶SfcI和EagI消化擴(kuò)增的產(chǎn)物。利用SfcI和EagI限制性酶(NewEnglandBiolab,ΜΑ)的限制性酶消化在37°C下在含有IX緩沖液(用于fegl的緩沖液3和用于SfcI的緩沖液4)、1XBSA和20單位的酶的25μ1反應(yīng)體系中進(jìn)行1小時。利用QIAquick凝膠提取試劑盒OlIAGEN,CA)通過瓊脂糖凝膠電泳純化所消化的產(chǎn)物,并利用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolab,ΜΑ)在16°C下在含有2μ1的IOX緩沖液、1μ1的Τ4連接酶、7μ1的消化的載體(pBR322)和10μ1的消化的插入片段(擴(kuò)增的產(chǎn)物)的20μ1的反應(yīng)體系中連接過夜。使用2.5kV、25uF電容和200歐電阻通過電穿孔將2微升的T4連接產(chǎn)物引入到100μ1的1836-2大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將50μ1的轉(zhuǎn)化的1836-2細(xì)胞鋪展到含有50μg/ml氨芐西林的瓊脂板上。將板在37°C下孵育過夜。在板上觀察到陽性菌落(選擇氨芐西林抗性)。利用試劑盒QIApr印SpinMinipr印試劑盒0!IAGEN,CA)從陽性菌落中提取質(zhì)粒DNA,然后先用PCR進(jìn)行篩選,再利用BigDyeTerminator試劑盒(可從AppliedBiosystem,CA商業(yè)上購得)進(jìn)行測序。所得的含有突變的eltAB基因與estB基因的融合體的質(zhì)粒載體被指定為“pLT192:STb”,并對其進(jìn)行純化(QIAprepSpinMiniprep試劑盒,QIAGEN,CA),然后稀釋為0.1μg/μ1的貯存液。將利用質(zhì)粒LT192=STb(例如,陽性菌落的培養(yǎng)物)轉(zhuǎn)化的1836-2的貯存物保持在30%的甘油溶液中。該貯存物被指定為疫苗菌株“8488”。疫苗菌株8488根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2008年6月6日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心,10801UniversityBlvd.,Manassas,Va.20110-2209,USA(ATCC),并被給予ATCC專利保藏編號PTA-汜61。本專利一經(jīng)授權(quán),除37C.F.R.§1.808(b)中所規(guī)定的要求外,保藏材料可被公眾得到的所有限制將會不可撤回地取消,并且保藏期限將遵照37C.F.R.§1.806。實(shí)施例5選擇性地,用以下來替換第一次PCR反應(yīng)以改變“L-接頭”。對于本實(shí)施例,設(shè)計(jì)了含有“L-接頭”的兩種附加的PCR引物(5,-cgagetcggtaccggggatc-‘3,Clements和Cardenas,1990,"VaccinesagainstenterotoxigenicbacterialpathogensbasedonhybridSalmonellathatexpressheterologousantigens,,(■于^達(dá)異源Jjt原白勺雜☆沙門氏菌的抗產(chǎn)腸毒素細(xì)菌病原的疫苗),Res.Microbiol.141:981_993,其整個公開內(nèi)容在此通過引用并入)以試圖提高兩種蛋白間的柔性指定為“LT:STb-R5”的合成的DNA寡核苷酸,主要由SEQIDNO14所列的核苷酸序列組成,和指定為“STb:LTB-F”的合成的DNA寡核苷酸,主要由SEQIDNO:15所列的核苷酸序列組成。在與實(shí)施例4中所描述的相似的反應(yīng)中,利用pBREcoRI-F和LTSTb_R5和PLT192:STb質(zhì)粒DNA進(jìn)行的PCR擴(kuò)增突變的eltAB基因、L-接頭和estB基因的5'端,然后利用STb=LTB-F和STbfegI-R進(jìn)行第二次PCR(與實(shí)施例4中PCR部分相似)擴(kuò)增突變的eltAB基因的3'端、L-接頭和estB基因。在SOEPCR中連接兩種片段,利用SfcI和fegl酶消化,且然后連接到載體PBR322中。實(shí)施例6疫苗的生產(chǎn)和施用通過將25μ1的菌株8488貯存物在37°C下在含50μg/ml氨芐西林的IOmlLB(Luria-Bertani)肉湯中孵育過夜而生產(chǎn)疫苗。將3毫升(3XIO9菌落形成單位或CFU)菌株8488的過夜生長培養(yǎng)物混合到219ml的Esbilac代乳品(PetAg,Inc.,ΙΑ)中以口服施用給豬。疫苗研究所用的小豬由剖腹產(chǎn)所生產(chǎn),將其隨機(jī)分成三個組,在悉生設(shè)施(無菌環(huán)境)中養(yǎng)殖。在7天齡時,用含有包括多形類桿菌(Bacteroidesthetaiotaaomicron)、梭狀梭菌(chlostridiumclostridioforme)lif(Lactobacillusbrevis)禾口大腸桿菌菌株G58-1的正常菌群口服接種小豬,以激活這些悉生小豬的原初免疫系統(tǒng)。這些非病原細(xì)菌正常存在于豬的腸內(nèi),并且是正常菌群的一部分。在14天齡時,將豬分為三組,一個疫苗組和兩個陰性對照組。第一組的四只豬(在此處和此后其它實(shí)施例中均被稱為是“疫苗菌株”組)攝入疫苗菌株8488(在代乳品中),第二組的四只豬(在此處和此后其它實(shí)施例中被稱為是"1836-2(-)”組)攝入菌株1836-2019毫升代乳品中的3毫升或3XIO9CFU的菌株1836-2),并且第三組的四只豬(在此處和此后其它實(shí)施例中均被稱為是“陰性對照”組)僅攝入代乳品。一周以后,用387毫升代乳品中的3ml過夜生長的8488培養(yǎng)物的口服消化進(jìn)行第二次免疫而對疫苗菌株組的豬進(jìn)行加強(qiáng)。再一周以后,用混合在387毫升代乳品中的野生型病原ETEC菌株3030-2的3ml過夜生長培養(yǎng)物對全部三個組中的豬進(jìn)行攻擊。密切觀察豬的包括腹瀉和脫水的臨床癥狀的發(fā)生。48小時后,對所有的豬尸體剖檢以進(jìn)行組織檢查。在每次免疫前后和攻擊前后從每只豬中收集血液樣品,以監(jiān)測免疫源應(yīng)答(結(jié)果參見實(shí)施例11)。觀察所有豬對接種物的消耗,并監(jiān)測隨之的臨床體征,包括嘔吐、腹瀉、脫水和嗜睡。尸體剖檢時,從每只豬中收集小腸樣品用于細(xì)菌群集研究。在接種后48小時之后的安樂死處理后對小豬進(jìn)行尸體剖檢,收集回腸(I)(回盲瓣附近3-5cm)、下部空腸(LJ)(幽門瓣和回盲瓣之間的三分之一到一半的距離)、上部空腸(UJ)(幽門瓣和回盲瓣之間的一半到三分之二的距離)、和十二指腸(D)(距幽門瓣3-5cm)的樣品,用于細(xì)菌學(xué)和組織病理學(xué)研究。實(shí)施例8小豬脫水的評估通過測量血液紅細(xì)胞壓積(PCV)和血漿總蛋白(TP)的改變來測定攻擊后脫水的水平。在接種前和接種18小時后從每只豬中取得血液樣品,然后如其它處所描述的檢測血液紅細(xì)胞壓積和血漿總蛋白。簡要地說,將血液樣品置于75mm毛細(xì)管中,并離心以進(jìn)行TP和PCV的分析。利用標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞比容總百分比圖表測定PCV。利用標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療折光計(jì)測定血漿TP含量。接種前樣品收集物到接種樣后樣品收集物中的PCV和血漿TP的增高用作脫水的指示。實(shí)施例9細(xì)菌腸內(nèi)群集的評價小腸的細(xì)菌群集的量和位置的測定是通過定量培養(yǎng)和免疫組化染色的小豬小腸切片的圖像分析來實(shí)現(xiàn)的。以每克回腸組織的CFU測定細(xì)菌濃度。簡要地說,稱重回腸組織,在PBS中洗滌并置于PBS中(比例為Ng組織在9XNml的PBS中),連續(xù)稀釋,置于血液瓊脂(腦心基質(zhì))或LB瓊脂板上,然后在37°C下孵育過夜,然后計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落。實(shí)施例10用于評價K88受體表達(dá)的小豬刷狀緣粘附測定按照標(biāo)準(zhǔn)方法使用在剖檢時從每只小豬中收集的回腸樣品制備刷狀緣囊泡。對從每只小豬中收集的小腸刷狀緣囊泡檢測表達(dá)K88ab、K88ac和K88ad菌毛的大腸桿菌的粘附。在相差顯微鏡下檢查混合有刷狀緣的細(xì)菌懸浮液中細(xì)菌對刷狀緣的粘附。計(jì)數(shù)粘附在單個刷狀緣囊泡上的細(xì)菌數(shù)目,細(xì)菌計(jì)算包括來自每個刷狀緣樣品的10個囊泡。如果在刷狀緣囊泡上有2個以上的細(xì)菌粘附則認(rèn)為單個刷狀緣是粘附的。從數(shù)據(jù)分析中排除非粘附的豬。實(shí)施例11結(jié)果利用8488疫苗菌株(疫苗菌株組)免疫的所有的豬都保持健康,在利用豬致瀉ETEC菌株3030-2攻擊后沒有發(fā)生任何腹瀉或脫水。小腸中的糞便水層平均為35.5%(緊實(shí)糞便,正常的,健康的)。觀察到100%的預(yù)防。陰性對照組(1832-3(-)和陰性對照組兩者)中的豬在利用豬致瀉ETEC菌株3030-2攻擊后發(fā)生腹瀉。小腸中的糞便水層高于90%(水在小腸中積累,腹瀉)。觀察到在疫苗組(疫苗菌株組)中的豬中具有高水平的抗K88和抗LT抗體,而在對照組(1832-3(-)和陰性對照組兩者)中沒有檢測到這些抗體,或檢測到極低的這些抗體(參見以下的表1-6)。來自疫苗組(疫苗菌株組)中的豬的小腸被疫苗菌株大量群集(6.7X108CFU/g),這預(yù)防了3030-2的群集(0-6X104CFU/g);而來自陰性對照組(1832-3(-)和陰性對照組兩者)中的豬的小腸主要被攻擊的3030-2菌株所群集(1.03X108CFU/g的3030-2),這是發(fā)生腹瀉疾病的前提。利用蛋白質(zhì)印跡分析測量抗K88抗體和抗LT抗體的存在。在每組豬的血清中所檢測的抗K88抗體的效價列于表1-3中。表1在血清中檢測的抗K88抗體(IgG效價)。權(quán)利要求1.一種抗腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli)的疫苗,所述疫苗包含產(chǎn)生K88菌毛和包含與STb腸毒素連接的突變體LT腸毒素的融合蛋白的大腸桿菌菌株。2.如權(quán)利要求1所述的疫苗,其中所述疫苗是活的大腸桿菌疫苗。3.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的疫苗,其中所述疫苗是抗豬斷奶后腹瀉的疫苗。4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的疫苗,其中所述大腸桿菌菌株是以ATCC專利保藏編號PTA-9261保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的菌株。5.一種生產(chǎn)用于豬斷奶后腹瀉的疫苗的方法,所述方法包括以下的步驟提供第一種大腸桿菌菌株,所述菌株包含eltAB基因和estB基因;擴(kuò)增所述eltAB基因;使所述eltAB基因突變;生成突變體eltAB基因與所述estB基因的基因融合體;和利用所述基因融合體轉(zhuǎn)化第二種大腸桿菌菌株。6.如權(quán)利要求5所述的方法,其中所述第一種大腸桿菌菌株表達(dá)K88菌毛。7.如權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)所述的方法,其中所述第一種大腸桿菌菌株表達(dá)K88ac菌毛。8.如權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的方法,其中所述第一種大腸桿菌菌株是以ATCC專利保藏編號PTA-9262保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的菌株。9.如權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的方法,其中生成突變體eltAB基因與estB基因的基因融合體的所述步驟包括將接頭置于所述eltAB基因和所述estB基因之間。10.如權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述的方法,其中所述第二種大腸桿菌菌株缺少所述eltAB基因。11.如權(quán)利要求5-10任一項(xiàng)所述的方法,其中所述第二種大腸桿菌菌株缺少所述estB基因。12.如權(quán)利要求5-11任一項(xiàng)所述的方法,其中所述第二種大腸桿菌菌株是以ATCC專利保藏編號PTA-9260保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的菌株。13.如權(quán)利要求5-12任一項(xiàng)所述的方法,所述方法還包括以下步驟將利用所述基因融合體轉(zhuǎn)化的所述第二種大腸桿菌菌株加入到水、牛奶、代乳品或食物中并施用所述水、牛奶、代乳品或食物給哺乳動物。14.如權(quán)利要求13所述的方法,其中所述哺乳動物是豬。15.一種用于豬斷奶后腹瀉的活疫苗,所述疫苗包含產(chǎn)生K88菌毛和包含與STb腸毒素連接的突變體LT腸毒素的融合蛋白的大腸桿菌菌株。16.如權(quán)利要求15所述的疫苗,其中所述大腸桿菌菌株是以ATCC專利保藏編號PTA-9261保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的菌株。17.一種抗腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的疫苗,所述疫苗包含以ATCC專利保藏編號PTA-9261保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的大腸桿菌菌株。全文摘要疫苗及制備和使用其的方法。示例性疫苗可以是抗腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的疫苗。疫苗可包含大腸桿菌菌株。所述大腸桿菌菌株可產(chǎn)生K88菌毛和包含與STb腸毒素連接的突變體LT腸毒素的融合蛋白。生產(chǎn)用于豬斷奶后腹瀉的疫苗的示例性方法可包括提供第一種大腸桿菌菌株。該菌株可包含eltAB基因和estB基因。該方法還可包括擴(kuò)增eltAB基因,使eltAB基因突變,生成突變體eltAB基因與estB基因的基因融合體,以及利用該基因融合體轉(zhuǎn)化第二種大腸桿菌菌株。文檔編號A61K39/108GK102281895SQ200980134890公開日2011年12月14日申請日期2009年7月2日優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日發(fā)明者衛(wèi)平·張,大衛(wèi)·弗朗西斯申請人:南達(dá)科他州立大學(xué)
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