專利名稱：抗家禽大腸桿菌敗血癥疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保護(hù)家禽抗大腸桿菌敗血癥的疫苗，以及通過投與這種疫苗而抵抗家禽大腸桿菌敗血癥的方法。
大腸桿菌敗血癥或大腸桿菌病是一種通常發(fā)生于家禽(如小雞和火雞)中的疾病，它帶來許多重大損失。患有這種疾病的鳥的特征性癥狀是肺泡炎、心包炎以及肝周炎。對該領(lǐng)域進(jìn)行的大部分研究表明，在所說的病鳥中遇到的大腸桿菌株有一半以上屬于下列三種血清型之一01∶K1，02∶K1，或078∶K80。在美國，也經(jīng)常遇到血清型035。通常認(rèn)為，大腸桿菌敗血癥是繼發(fā)感染，它是在呼吸道被引起呼吸道疾病的病毒或支原體損傷后，通過它而進(jìn)入機(jī)體的。
對于在家禽大腸桿菌病的發(fā)病過程中發(fā)揮作用的致病因素幾乎不了解。在哺乳動(dòng)物的感染中發(fā)揮作用的大腸桿菌菌株的致病因素包括，例如，粘附菌毛、毒素和鐵螯合機(jī)制。
許多通常具有高度宿主特異性的不同粘附菌毛已被描述。在腹瀉的病人中遇到過CFA菌毛，在腹瀉的小豬中遇到過K88菌毛，在腹瀉的綿羊、牛犢和小豬中遇到過K99，在尿道感染的人中遇到過P菌毛(包括F11型的菌毛)。另外，也已發(fā)現(xiàn)，投與作為疫苗的純化型所說類型粘附菌毛，在相應(yīng)類型的動(dòng)物中產(chǎn)生了保護(hù)性免疫應(yīng)答。但是，對于家禽大腸桿菌病的類似致病因素還未被鑒定。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一種保護(hù)家禽抗大腸桿菌敗血癥的疫苗。其特征在于，它含有F11型的菌毛或其免疫部分，或含有具有遺傳物質(zhì)的生物體，這種遺傳物質(zhì)為所說的菌毛或其免疫部分的產(chǎn)物以及可能存在的排泄物編碼。
尤其是，通過研究已可能表明，從患有大腸桿菌病的小雞的受影響心臟分離出的大腸桿菌菌株產(chǎn)生出與F11型的菌毛相同的菌毛，此種菌毛也存在于引起人尿道感染的大腸桿菌菌株中。
通過血清學(xué)可能證明，絕大多數(shù)患有大腸桿菌敗血癥的鳥類是被含有F11型菌毛的大腸桿菌感染的。
按照SDS-PAGE，這些菌毛含有表現(xiàn)分子量為18.0KD的亞單位蛋白質(zhì)。
它們可被在37℃培養(yǎng)的固體瓊脂培養(yǎng)基上的野生鳥的大腸桿菌菌株產(chǎn)生。但如果大腸桿菌是培養(yǎng)在肉湯中，則未被發(fā)現(xiàn)。如果細(xì)菌是培養(yǎng)在血瓊脂(基質(zhì))板(如Oxoid制造的)上，則進(jìn)行18KD菌毛的最佳表達(dá)。Peuassay瓊脂板(Difco)也是合適的培養(yǎng)基。在20℃生長時(shí)不形成18KD菌毛。
過去已從野生型尿路病原體的大腸桿菌菌株中克隆F11菌毛(見deRec，J.M.等，F(xiàn)EMSMicrobiologyLett.29，91-97，1985)。用含有為F11菌毛編碼的基因的pPLL291-15質(zhì)粒轉(zhuǎn)化無菌毛大腸桿菌K12菌株AM1727，該轉(zhuǎn)化菌株就能夠產(chǎn)生F11菌毛。現(xiàn)已按下列參數(shù)，將所說的F11菌毛與從大腸桿菌CH4菌株純化的18KD菌毛進(jìn)行了比較，該菌株屬于經(jīng)常出現(xiàn)于鳥類中的02∶K1∶H血清型。
a.形態(tài)學(xué)在電子顯微鏡下，F(xiàn)11和18KD菌毛表現(xiàn)相同其菌毛大約都是1μm長，但其直徑大約都是7nm。
b.分子量通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)11和18KD菌毛亞單位的表現(xiàn)分子量均為18KD。
c.免疫化學(xué)特異性在酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)中，F(xiàn)11和18KD菌毛同樣地與抗F11單克隆抗體反應(yīng)(見J.Clin.Aicrobiol.24，121-125;1986，deRee.J.M.等)，而不與抗FIA、FIC、F7、F72、F8、F9、F12或F13型的菌毛的單克隆抗體反應(yīng)。
d.氨基酸組成18KD亞單位的氨基酸組成與F11亞單位的組成基本相同(VanDie，I等;D.L.Lark(ed.)，Proteincarbohydrateinteractionsinbiologicalsystems，Academicpress，London，pages38-46，1986)(見表1)。
表1F11和18KD菌毛亞單位氨基酸組成的比較氨基酸 F111)18KD2)Asx1818.6Thr1415.3Ser1211.0Glx1716.5Gly2019.6Ala1920.2Val1312.2Ile65.8Leu1010.3Tyr32.2Phe87.7Lys1110.1Arg00.9His11.4Met1Cys2Pro66.6Total161161
1)按照氨基酸序列(見

圖1)計(jì)算2)在6NHCl中水解后，使用ultrapac8柱(LKB)通過SODIUM系統(tǒng)測定。
e.氨基末端的氨基酸序列18KD亞單位的氨基末端的前17個(gè)氨基酸的序列與已知的F11亞單位的對應(yīng)序列相同(VanDie，I.et.al.;1986)-圖1表示了整個(gè)F11亞單位蛋白質(zhì)的氨基酸序列。實(shí)際分子量16.4KD可從其序列計(jì)算。
P菌毛的粘附特性，家F11一樣，可通過人紅血球甘露糖抗性血凝反應(yīng)(MRHA)而被觀察到。這種甘露糖抗性血凝反應(yīng)可通過在甘露糖存在的情況下，將表達(dá)足夠量所說P菌毛的大腸桿菌與人紅血球混合而顯示。
足夠P菌毛粘附于人紅血球的最小受體結(jié)構(gòu)已被鑒定為二糖Galα1→4Galβ(Kallenius，G.等，Lancetⅱ.604-6;1981)。這種二糖與乳膠顆粒偶聯(lián)產(chǎn)生一種工具，它通過乳膠凝聚而特異性地證明細(xì)菌上的P菌毛(deMan，P.等，J.Clin.Microbiol.25，401-6;1987)。
最近已表明，負(fù)責(zé)粘附的不是F11菌毛本身，而是與菌毛相關(guān)的特定粘附蛋白(也稱作“微成分”)(VanDie，I.等，MicrobiolPathogenesis1，51-56;1986)。
表2顯示了F11菌毛的表達(dá)與尿路病原性大腸桿菌菌株的吸附特性的相互關(guān)系，比較了產(chǎn)生F11菌毛的重組克隆和一些從患有大腸桿菌病的小雞的受害心臟分離出的大腸桿菌菌株。從這一表中得知，從小雞中分離出的大腸桿菌的F11菌毛至少象人大腸桿菌的F11菌毛一樣識別同樣的受體。
表2F11菌毛的表達(dá)，血凝反應(yīng)及P-受體識別菌株數(shù)a)在下列檢測中測得的在下列試驗(yàn)中測得的(血清型)F11菌毛的表達(dá)粘附ELISAb)Westernc)MRHA P-受體印跡試驗(yàn)d)試驗(yàn)e)H291(01∶K1)＞4.7+++++++AM1727----AM1727/pPIL291-15＞4.7+++++++++++CH2(078∶K80)3.0+++CH4(02∶K1)＞4.7++++++CH5(02∶K1)2.7---CH6(01∶K1)＞4.7++++++CH7(015∶K14)----CH96(078∶K80)3.2++++CH139(02∶K1)＜4.7++++++++
a)H291為人大腸桿菌，F(xiàn)11參照菌株C1976;AM1727/pPIL291-15為少菌毛K12菌株AM1727的產(chǎn)生F11菌毛的重組克隆;
b)用抗F11血清進(jìn)行的整個(gè)細(xì)菌酶聯(lián)免疫吸附檢測;10log滴度被定為具有至少兩倍于本底值的A540值的最高血清稀釋度。
c)帶有抗F11血清的粗菌毛制品的Western印跡。
d)用人紅血球進(jìn)行的甘露糖抗性血凝反應(yīng)。
e)被Galαl→4Galβ包裹的乳膠顆粒的凝聚。
符號的含義-在上面提到的試驗(yàn)中無反應(yīng)性;
+→++++在上面提到的試驗(yàn)中反應(yīng)程度的逐級增加。
本發(fā)明的疫苗也可能含有，與F11菌毛一起或取代F11菌毛，F(xiàn)11菌毛的致免疫部分。這種致免疫部分可被理解為意味著18KD亞單位，其聚集物，或其片斷或?yàn)镕11菌毛、其聚集物或片段所特有的粘附蛋白。18KD亞單位的這一片聯(lián)或所指類型的F11粘附蛋白可能是一種多肽，它含有能夠刺激抗家禽F11型大腸桿菌的保護(hù)性抗體的一個(gè)或多個(gè)抗原決定基。
通過已知技術(shù)本身，可發(fā)現(xiàn)18KD亞單位的合適多肽片段或F11粘附蛋白。通過測定氨基酸鏈的連續(xù)片段的平均親水性的這樣一種技術(shù)已由T.P.Hopp和K.R.Woods描述(Predictionofproteinantigentcideterminantsfromaminoacidsequences;Proc.Natl.Acad.Sci.78，3824-3828;1981)。這種測定的結(jié)果顯示于圖2。在該圖中，描繪了基于已知氨基酸序列的F11亞單位的親水性外觀。其中繪制的外形顯示了每7個(gè)氨基酸的親水性平均值漸次加重。具有最明顯親水性的區(qū)域被認(rèn)為是可能組成抗原決定基的區(qū)域。在圖2中，這些區(qū)域用黑塊標(biāo)明，它們對應(yīng)于氨基酸序列24-33Ile-Ser-Gln-Lys-Ser-Ala-Asp-Gln-Ser-Ile45-57Ala-Gly-Gly-Thr-Ser-Lys-Pro-Met-Asp-Leu-Asp-Ile-Glu67-78Lys-Gln-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Asn-Gly-Lys-Val-Gln87-95Thr-Gly-Gln-Ala-Glu-Glu-Leu-Ala-Thr123-130Pro-Leu-Lys-Asp-Gly-Asp-Asn-Val136-142Leu-Val-Lys-Lys-Ala-Asn-Gly.
據(jù)推測，F(xiàn)11菌毛的18KD亞單位的抗原決定基也位于這些區(qū)域。對于F11菌毛，I.VanDie，W.Hoekstra及H.Bergmans使用同樣的模式也得出了類似的結(jié)論。
利用專利申請WO84/03506所述的方法(所謂的蛋白掃描法)，也能夠發(fā)現(xiàn)18KD亞單位或F11粘附蛋白的適當(dāng)免疫化學(xué)活性多肽片段，其中合成了一系列部分重疊的多肽，它們與所研究的蛋白質(zhì)的部分序列相對應(yīng)，但研究了它們與抗體的反應(yīng)性。
為了增加致免疫性質(zhì)，也可將這種多肽片段選擇性結(jié)合到一載體上。
F11菌毛或其致免疫部分可通過采用已知方式從F11型野生型大腸桿菌株或其衍變物分離菌毛，或者通過選擇性分離其致免疫部分而制得。
F11菌毛或其致免疫部分也可從被重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞開始產(chǎn)生，這種重組DNA含有為F11菌毛或其致免疫部分的產(chǎn)生及選擇性的分泌而編碼的遺傳物質(zhì)。
另外，尤其在多肽片段較小的情況下，也可以通過人工合成的方法完整地制備它們，例如，利用Merrifield的方法(它利用了一種固相)。
本發(fā)明的疫苗也可能含有一種生物體，這種生物體中有為F菌毛或其致免疫部分的產(chǎn)生和/或分泌編碼的遺傳物質(zhì)。
它最好涉及非致病生物體。
這些生物體就其本質(zhì)能夠產(chǎn)生所說的抗原物質(zhì)，或具有為所需的抗原物質(zhì)編碼的重組多核苷酸。
尤其可以使用病毒或細(xì)菌作為這種重組生物體。所說的重組機(jī)體本身能夠產(chǎn)生所需的抗原物質(zhì)，并選擇性將其分泌。
本發(fā)明的疫苗最好通過非腸道，例如通過皮下或肌內(nèi)投與。按這種方式投給疫苗可使接種過的鳥產(chǎn)生主動(dòng)免疫，也可以投給下蛋的鳥，使其后代產(chǎn)生被動(dòng)免疫。在被免疫的下蛋雞中產(chǎn)生的抗體當(dāng)然會(huì)進(jìn)入其卵黃中，因而以后也就存在于孵化的小雞中。
本發(fā)明的疫苗也可通過口內(nèi)、鼻內(nèi)方式給與，也可通過吸入氣霧劑給藥-在這種情況下，該疫苗最好含有活的非致病生物體，它具有為F11菌毛或其免疫部分的產(chǎn)生和分泌編碼的遺傳物質(zhì)。
本發(fā)明的疫苗也可通過象上面所述的那樣，首先為蛋白質(zhì)，或從其獲得的多肽，或F11菌毛的產(chǎn)物，或含有這些F11菌毛的微生物提供蛋白質(zhì)或多肽而制備。
在后一種情況下，從大腸桿菌獲得菌毛是最佳實(shí)施方案。一般是，在培養(yǎng)帶有F11菌毛的大腸桿菌后，通過機(jī)械分離(剪切)和/或加熱，然后除去細(xì)胞(通過離心和/或(超)耍?，从蠇D蟹擲氤鯢11菌毛。然后，通過超過濾、柱層析或特定沉淀(使用硫酸銨或其它鹽，或通過改變pH值至菌毛的等電點(diǎn))等手段，除去來自培養(yǎng)基和/或細(xì)菌膜的污染物，進(jìn)一步純化菌毛。
對于非腸道接種，通常將存在于水溶性溶液或懸浮液中的活性成分與其它的組成成分混合，以增強(qiáng)活性或貨架壽命。這些成分包括鹽、福爾馬林、pH緩沖劑、以及改善免疫應(yīng)答的乳化劑和佐劑。合適的佐劑包括礦物油、胞壁酰基二肽、氫氧化鋁、皂草苷、聚陰離子和兩親物質(zhì)。
疫苗的組成和接種系統(tǒng)都是可以變化的，它是根據(jù)所保護(hù)的鳥的類型、鳥的年令及重量、所需要的保護(hù)期限及投與的方式以及希望產(chǎn)生主動(dòng)免疫還是借助于母體抗體的被動(dòng)免疫而定。對于非腸道接種，每一劑中活性成分的有效量大約為10-100μg。
上面所述的抗具有F11菌毛的大腸桿菌的主動(dòng)免疫主要在健康鳥類中作為保護(hù)性處理而加以應(yīng)用。它并不是說已被具有F11菌毛的大腸桿菌感染的鳥類適合于用抗F11菌毛、其部分或其聚集物的抗體來治療。
實(shí)施例1菌毛的純化為了純化菌毛，將三株野生型大腸桿菌于37℃在血瓊脂基質(zhì)(Oxoid)板上培養(yǎng)一夜。為此，使用了大腸桿菌CH2(078∶K80∶H4)、CH4(02∶K1∶H-)和CH6(01∶K1∶H)菌株，它們都是從患有大腸桿菌病的(小)雞的受損心臟分離的。F11菌毛克隆AM1727-p P IL291-15(De Rec等，1985)也在Biostat 發(fā)酵罐(Braun)的“Brain Heart Infusion”肉湯中培養(yǎng)16小時(shí)，該肉湯含有50μg/ml氨芐青霉素。培養(yǎng)是在37℃恒溫、pH7.4以及近似40%的氧氣飽和度的條件下進(jìn)行。
將細(xì)菌收集在pH值為7.5的10mMTris-HCl緩沖液中。
通過在Sorval全向混合器中將細(xì)菌置于冰上1分鐘連續(xù)處理15次，或在65℃將細(xì)菌加熱15分鐘，或?qū)⑸鲜鰞煞N方法結(jié)合對細(xì)菌進(jìn)行處理，使菌毛從細(xì)菌上釋放。
然后通過離心和過濾除去細(xì)菌，濃縮粗菌毛溶液，且在帶有YM100過濾器的Amicon容器中充分洗滌菌毛。
接著用經(jīng)過某些改進(jìn)的由Korhonen等描述的方法(Infect.Immun.27，568-575，1980)純化菌毛，亦即用硫酸銨沉淀菌毛，用脫氧膽酸鈉溶解菌毛，然后在蔗糖梯度中將其離心。
以這種方式純化的菌毛制品在電子顯微鏡下顯示出同樣的菌毛結(jié)構(gòu)(如VandenBosch，J.F.等所述，Infert.Immun.29，226-233，1980)。所有菌毛制品在SDS-PAGE(如Lugtenberg，B.等所述，F(xiàn)EBS.Lrtt.58，254-258，1975)的18KD處都顯示一個(gè)單一條帶，且在Westem印跡(如Muilerman，H.G等所述，見Anal.Biochem.120，46-51，1982)中都與抗各種菌毛的所有血清發(fā)生反應(yīng)。
實(shí)施例2A.含有本發(fā)明的菌毛的疫苗，以一種油包水乳劑來制備。以含有多山梨醇酯80和山梨聚糖單油酸的礦物油(低粘度石蠟)作為乳化劑。
B.象實(shí)施例2A一樣制備一種疫苗，它含有50μg/ml從野生型CH4(02∶K1∶H-)大腸桿菌純化的F11菌毛。
C.象實(shí)施例2A一樣制備一種疫苗，它含有從克隆AM1727-pPIL291-15純化的F11菌毛50μg/ml。該克隆的樣品于1987年10月19日保藏于巴黎巴斯德研究所的微生物培養(yǎng)物收藏中心(theColloctionNationaledeCulturesdeMicroorgnismes)，編號為I-709。
實(shí)施例3主動(dòng)免疫為了主動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)，將按實(shí)施例2的方法制備的疫苗通過肌肉注射的方式注射進(jìn)所研究的鳥中，然后利用酶聯(lián)免疫吸附檢測法，測定?？咕难蹇贵w滴度的發(fā)展。
A.酶聯(lián)免疫吸附檢測為了進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附檢測，將裝有100μl按實(shí)施1的方法制備的純化菌毛溶液的微滴定板在室溫下保溫一液。在該平板的每孔中，每毫升0.04MPBS(pH7.2)中含有2.5μg菌毛。
然后向每孔中加入200μl含5%BSA的PBS溶液，于37℃保溫20分鐘，用水洗滌后在空氣中干燥。
通過向每孔中加入100μl存在于緩沖液(pH7.4，0.2M Na2HPO4，0.2M Na Cl，0.1%BSA和0.05% Tween 80)中的血清系列稀釋液，然后于37℃保溫一小時(shí)而對抗菌毛血清進(jìn)行研究。
洗滌之后，向每孔中加入100μl經(jīng)稀釋的結(jié)合物(兔抗小雞IgG/PO(H+L)，Nordic)，然后再次洗滌。
向每孔中加入100μl酶底物溶液(含有15ml蒸餾水，1.5ml存在于乙酸鈉/檸檬酸緩沖液(pH5.5)中的0.14%過氧化脲溶液，以及0.2ml存在于DMSO中的0.6%TMB溶液)，通過比色法測定抗體活性。
酶促反應(yīng)在暗處進(jìn)行。10分鐘之后通過向酶孔中加入50μl 4N H2SO4而終止反應(yīng)，然后在Microelisa Reader(Organon Teknika)上于450nm(A450)處測定吸收值。
血清的第一次稀釋度為1∶50。
通過將接種前獲得的且以1∶50稀釋的血清結(jié)合到至少8個(gè)孔中而測得每孔的本底。
抗體滴度被定為產(chǎn)生至少1.5倍于平均A450本底的A450的最大血清稀釋度。
B.對SPF小雞接種通過肌內(nèi)注射的方式給6周齡的SPF小雞(GezodheidienstVoorPluimvee(PoultryHealthService)，Doorn，Netherlands)接種1ml按實(shí)施例2B制備的疫苗，4周之后，用同樣材料進(jìn)行加強(qiáng)注射。結(jié)果見表3。
表3給6周齡小雞接種后血清抗體的產(chǎn)生;ELISA滴度的對數(shù)第一次注射后的周數(shù)小雞編號024＊681＜1.73.24.44.14.72＜1.73.84.44.14.73＜1.73.2＞4.74.74.74＜1.74.4＞4.7＞4.7＞4.75＜1.74.4＞4.7＞4.7＞4.7＊加強(qiáng)注射
C.對繁育小雞的母雞接種將20周齡繁育小雞的母雞(Euribrid，Boxmeer，Netherlands)分成每組8只的兩組，通過肌肉注射的方式分別注 ml按實(shí)施例2B和2C制備的疫苗。第一次注射6周之后，用同樣的疫苗對應(yīng)地進(jìn)行加強(qiáng)注射。從表4可看出，在繁育小雞的母雞血清中大量產(chǎn)生抗體，同時(shí)伴隨著抗體向卵黃和孵出的小雞的血清中轉(zhuǎn)移。
表4給20周齡繁育小雞的母雞接種后抗體的產(chǎn)生在繁育母雞的血清、卵黃以及孵出小雞的血清中ELISA滴度(±SD)的平均對數(shù)從菌株純繁育小雞的卵黃2)孵出小雞的化的菌毛母雞血清1)血清3)CH4(02∶K1∶H-)4.58±0.505.29±0.393.98±0.27AM1727-pPIL291-155.48±0.215.14±0.474.16±0.391)第一次注射后10周收集的血清樣品2)第一次注射11周收集的8個(gè)卵的平均值3)第一次注射12周后從卵孵出的5個(gè)一周齡小雞的平均值。
用CH4菌株和AM1727-pPIL291-15克隆的F11菌毛接種，也得到相同的結(jié)果。在酶聯(lián)免疫吸附檢測中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)制品之間發(fā)生完全交叉反應(yīng)。
實(shí)施例4通過給繁育小雞的母雞接種而保護(hù)小雞用自AM1727-pPIL291-15克隆純化的F11菌毛(見實(shí)施例3C)接種于繁育小雞的母雞。
從這些已接種繁殖母雞和非接種對照母雞孵出的小雞，在3周齡時(shí)通過向其右后胸肺泡注射0.2ml細(xì)菌懸浮液而進(jìn)行攻擊。所使用的細(xì)菌株都是自患有大腸桿菌病的小雞的受損心臟分離的。將其在血瓊脂基質(zhì)板(Oxoid
)上培養(yǎng)過夜，懸浮于PBS中至適當(dāng)濃度。小雞關(guān)在隨意攝取食物和水的減壓隔離器中。
如表5所示，良好的保護(hù)作用從接種過的繁殖母雞轉(zhuǎn)移至孵出的小雞。與未接種的對照相比，對所有菌株放在一起來說，用F11菌毛接種的保護(hù)效力為85%。
令人驚奇的是，這種保護(hù)作用也能夠抗CH7菌株攻擊，而這種菌株在體外似乎不表達(dá)F11菌毛。這可能是因?yàn)椋摼陮?shí)際上在體內(nèi)表達(dá)了F11菌毛，而在體外時(shí)的表達(dá)低于所用方法能夠檢測的限度。
表5自接種了F11菌毛的繁育母雞孵出的小雞的抗大腸桿菌攻擊的保護(hù)作用
1)對每一菌株的血清型，F(xiàn)11表達(dá)以及攻擊劑量都有表示2)在攻擊后7天內(nèi)死亡的小雞數(shù)/總攻擊數(shù)3)卡方試驗(yàn)P＜0.0001
實(shí)施例5通過被動(dòng)免疫保護(hù)小雞通過用純化的F11菌毛接種兔子，然后在56℃滅活30分鐘而制備出抗血清。
通過靜脈將1ml這種未稀釋的F11抗血清注射給三周齡的小雞(Euribeid，Boxmeer，Netherlands)。
在用抗血清進(jìn)行靜脈注射后1小時(shí)內(nèi)，通過向右后胸肺泡注射0.2ml細(xì)菌懸浮液而感染小雞。在對照中，用同樣劑量的細(xì)菌感染投與抗血清的小雞。所用的細(xì)菌全是從患有大腸桿菌病的小雞的受損心臟分離的。將細(xì)菌在血瓊脂基質(zhì)板(Oxoid )上培養(yǎng)一夜，然后懸浮于PBS中，且稀釋至適當(dāng)濃度。
小雞是關(guān)在隨意攝取食物和水的減壓隔離器中。
從這些實(shí)驗(yàn)可明顯看出，F(xiàn)11菌毛抗血清為小雞提供了良好的保護(hù)作用，它能夠抗用于感染的6個(gè)大腸桿菌菌株的5個(gè)(表6)?？笴H6菌株感染的保護(hù)作用非常低，盡管安也產(chǎn)生F11菌毛。可能是由于該菌株除產(chǎn)生F11菌毛外，還產(chǎn)生一種或多種其他強(qiáng)力毒性因子。但也可能是由于產(chǎn)生的抗體水平太低，不能達(dá)到抗該細(xì)菌株的保護(hù)作用。
一個(gè)令人驚奇的性質(zhì)是，甚至達(dá)到了抗CH7菌株的顯著保護(hù)作用，而該菌株本身似乎不產(chǎn)生任何F11菌毛。這可能是由于該菌株在體內(nèi)實(shí)際上產(chǎn)生了F11菌毛，但在體外產(chǎn)生的F11菌毛濃度對所用檢測方法來說太低。
表6通過用F11菌毛抗血清進(jìn)行被動(dòng)免疫而產(chǎn)生抗大腸桿菌感染小雞的保護(hù)作用感染菌株的代號血清型劑量投與抗-感染后7天p＜0.05＊F11抗內(nèi)死亡的小血清雞數(shù)/總數(shù)CH2078∶K80∶H4∶F11+5×10+2/17+CH25×10-15/17CH502∶K1∶H7∶F11+10+0/8+CH510-6/9CH601∶K1∶H-∶F11+10+13/24CH610-19/29CH7015∶K14∶H10∶F11-2×10+1/8CH72×10-6/9CH245035∶K-∶H？∶F11+5×10+2/17CH2455×10-11/19＊卡方試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.保護(hù)家禽抗大腸桿菌敗血癥的疫苗，其特征在于所說的疫苗含有F11型菌毛，或其致免疫部分，或者是具有遺傳物質(zhì)的生物體，這些遺傳物質(zhì)為所說的菌毛或其致免疫部分的產(chǎn)生以及選擇性分泌編碼。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所說的疫苗含有致免疫多肽(如所提到的致免疫部分)，該多肽具有與F11菌毛亞單位蛋白質(zhì)的氨基致序列的一部分相對應(yīng)的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所說的疫苗也含有一種佐劑。
4.保護(hù)家禽抗大腸桿菌敗血癥的成分，以所述疫苗為特征，含有抗F11型的菌毛或其部分或其聚集物的抗體。
5.保護(hù)家禽抗大腸桿菌敗血癥的方法，其特征是投與如權(quán)利要求1-3的一種疫苗或權(quán)利要求4的一種成分。
6.F11型的菌毛、其致免疫部分或具有遺傳物質(zhì)(為所說的菌毛或其致免疫部分的產(chǎn)生，以及選擇性分泌編碼)的生物體在生產(chǎn)一種有效地保護(hù)家禽抵抗大腸桿菌敗血癥的疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一些有效地保護(hù)家禽抵抗大腸桿菌敗血癥的疫苗，它們含有F11型菌毛或其致免疫部分，或能夠引起F11菌毛及其免疫部分的產(chǎn)生，或含有抗這些物質(zhì)的抗體。
文檔編號A61P31/04GK1033008SQ8810735
公開日1989年5月24日 申請日期1988年10月25日 優(yōu)先權(quán)日1987年10月26日
發(fā)明者約翰·弗蘭西斯科·凡登布什 申請人:阿克佐公司