專利名稱:聚酮化合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及聚酮類化合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù):
(Tuberculosis, TB) Mi^^WM^fM (Mycobacterium tuberculosis, MTB)所致呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病,可能侵入人體全身各種器官,主要侵犯肺臟,稱 為肺結(jié)核病,是一種古老的傳染病,自有人類以來就有結(jié)核病,至今未得到有效根除。結(jié)核 病與艾滋病和瘧疾被喻為威脅人類的三大傳染病殺手。而且由于與艾滋病共感染和多重耐 藥結(jié)核桿菌(XDR-TB)的出現(xiàn),世界衛(wèi)生組織于1993年宣布"全球結(jié)核病緊急狀態(tài)"。當(dāng) 今全世界的TB治療,一線藥物仍然大多依賴于少數(shù)幾個四五十年前發(fā)明的藥物,例如異煙 胼、利福平、吡嗪酰胺等。TB感染往往是慢性長期的,現(xiàn)在臨床上的治療一般至少持續(xù)6個 月,采取4種或更多種藥物的雞尾酒療法。異煙胼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺是目前的 一線藥物的組合。而二線藥物往往價格較貴并且相對一線藥物效果不甚理想,只有當(dāng)一線 藥物產(chǎn)生耐藥性或毒性過大的時候才會使用。而不恰當(dāng)?shù)闹委熁蚴腔蛲蛔儗?dǎo)致針對 各種抗TB藥物抗性的出現(xiàn)。現(xiàn)在開發(fā)針對TB藥物的緊迫性再一次被超級耐藥TB的發(fā)現(xiàn) 所證實和肯定了,在某些地方已經(jīng)分離出目前尚無藥可治的TB菌株。雖然對于治療TB抗 生素的需求很緊迫,但是制藥廠商們都不大情愿涉及這一高風(fēng)險、回報慢的領(lǐng)域?;诖诵?要進(jìn)行新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)。由微生物產(chǎn)生的聚酮類化合物的數(shù)量極其龐大,是一大類結(jié)構(gòu)多樣化和生物活性 多樣性的天然產(chǎn)物,已經(jīng)成為新藥的重要來源。但目前尚無關(guān)于本發(fā)明所要求保護(hù)的聚酮 類化合物的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種聚酮類化合物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供的聚酮類化合物,其結(jié)構(gòu)式如式I所示, (式 I)。本發(fā)明提供的制備上述化合物的方法,包括如下步驟1)在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)康氏木霉(Trichoderma koningii)MF349至形成孢子;2)用無菌水沖洗收集所述孢子,將所收集的孢子接種到由滅菌大米和水組成的培 養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),得到康氏木霉發(fā)酵物;3)利用乙酸乙酯浸提所述康氏木霉發(fā)酵物,將所述浸提步驟得到的提取液進(jìn)行濃 縮得到濃縮物a,加水混合后,用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取,合并乙酸乙酯萃取液后濃縮,得到粗浸膏;4)將所述步驟3)得到的粗浸膏用乙酸乙酯溶解后與硅膠混合,待乙酸乙酯揮發(fā) 后,進(jìn)行吸附層析分離,先用二氯甲烷洗脫兩次,再用二氯甲烷與甲醇的混合液洗脫四次, 依次得到7個餾分;5)將所述步驟4)依次得到的7個餾分中第7個餾分用體積比為5 5 1的石 油醚、二氯甲烷和甲醇的混合液作為洗脫液吸附層析分離5次,依次得到5個餾分,將所述 5個餾分中第5個餾分純化后,得到式I所述化合物。該方法的步驟1)中,所述固體培養(yǎng)基優(yōu)選PDA培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基;培 養(yǎng)的溫度為優(yōu)選28°C,培養(yǎng)的時間優(yōu)選為10天;所述步驟2)中,所述PDA培養(yǎng)基上的孢子液的接種量為所述由大米和水組成 的培養(yǎng)基重量優(yōu)選5% ;所述由大米和水組成的培養(yǎng)基中,所述大米和水的重量份數(shù)比為 100g 40mL ;培養(yǎng)的溫度為優(yōu)選25°C,培養(yǎng)的時間為10-30天,優(yōu)選20天;該步驟所得康 氏木霉發(fā)酵物是由孢子、菌絲及所述固體培養(yǎng)基如PDA培養(yǎng)基組成;所述步驟3)中,所述乙酸乙酯與所述康氏木霉發(fā)酵物的體積比為2 1;所述水 與所述濃縮物a的質(zhì)量比為1 20 ;用乙酸乙酯浸提的次數(shù)優(yōu)選為三次;所述步驟4)中,將所述步驟3)得到的粗浸膏用乙酸乙酯溶解后與硅膠混合的步 驟中,所述步驟3)得到的粗浸膏、乙酸乙酯與硅膠的質(zhì)量比為1 10 2;所述吸附層析 分離優(yōu)選硅膠柱層析分離,所述凝膠柱的型號優(yōu)選為S印hadex LH-20 ;所述硅膠為薄層層 析硅膠;所述吸附層析分離步驟中,所述二氯甲烷與甲醇的混合液中,二氯甲烷與甲醇的體 積比依次為99 1、99 1、98 2、98 2 禾口 97 3 ;所述步驟5)中,所述吸附層析優(yōu)選凝膠柱層析,所述將第5個餾分純化的方法為 用反相色譜柱進(jìn)行純化,流動相為體積百分濃度為70%的甲醇水溶液;該反相色譜柱可為 型號為RP-18的Agilent反相色譜柱,色譜柱的柱長為250mm,內(nèi)徑為9. 4mm,檢測波長254 納米??凳夏久?Trichoderma koningii)MF349已于2010年1月5日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)(地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號,郵編100101),保藏編號為CGMCC No 3576。此外,上述本發(fā)明提供的式I所示化合物在制備抑制結(jié)核分枝桿菌的產(chǎn)品尤其是 結(jié)核分枝桿菌抑制劑或抑制結(jié)核分枝桿菌藥物中的應(yīng)用,也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供的聚酮類化合物,屬于全新骨架化合物,具有非常好的生物活性,適宜 于制備治療結(jié)核分枝桿菌的藥物。本發(fā)明提供的制備上述聚酮類化合物的方法,發(fā)酵工藝 簡單,提取方法成熟,工藝簡便,所得產(chǎn)物產(chǎn)率高,經(jīng)核磁共振、紅外光譜、質(zhì)譜和高分辨質(zhì) 譜檢測,其結(jié)構(gòu)正確。
圖1為實施例1制備所得聚酮類化合物I的核磁共振屯譜圖。圖2為實施例1制備所得聚酮類化合物I的核磁共振13C譜圖。圖3為實施例1制備所得聚酮類化合物I的高分辨質(zhì)譜。圖4為實施例1制備所得聚酮類化合物I的圓二色譜(⑶)。
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圖5為康氏木霉(Trichoderma koningii)MF349的形態(tài)特征圖及與標(biāo)準(zhǔn) Trichoderma koningii 的對比照片,其中,A 為康氏木霉(Trichoderma koningii)MF349 菌 株的孢子囊,C為文獻(xiàn)報道Trichoderma koningii的孢子囊,B為康氏木霉(Trichoderma koningii)MF349菌株的孢子,D為文獻(xiàn)報道Trichoderma koningii的孢子。圖6為ITS系統(tǒng)進(jìn)化樹。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明,但本發(fā)明并不限于以下實施例。實施例1、1)用接種環(huán)取康氏木霉(Trichoderma koningii)MF349接種到PDA平皿培養(yǎng)基, 28攝氏度培養(yǎng)10天。2)無菌水沖洗平皿培養(yǎng)基上的孢子,收集孢子液,按照體積比為5%的接種量接 種到滅菌后的由大米和水組成的培養(yǎng)基中,置于28攝氏度靜置培養(yǎng)20天,獲得康氏木霉發(fā) 酵物。其中,所述培養(yǎng)基按照下述方法配制取100克大米和40mL水混合于500mL三角燒 瓶中,于121攝氏度下滅菌20分鐘后,得到所述培養(yǎng)基。實驗中利用10瓶培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。3)利用3000ml乙酸乙酯浸提步驟2)得到的康氏木霉發(fā)酵物1500ml,所得提取液 減壓濃縮至不含乙酸乙酯,加1000ml蒸餾水混懸,并用與所述蒸餾水等體積的乙酸乙酯萃 取三次,合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮,得到粗浸膏。4)將上述粗浸膏5克用50毫升乙酸乙酯溶解后加入10克200目硅膠H(青島海洋 化工集團(tuán)公司產(chǎn)品)拌樣,待乙酸乙酯揮干。利用薄層硅膠H(青島海洋化工集團(tuán)公司產(chǎn)品) 對以上樣品進(jìn)行柱層析分離,為了達(dá)到更好的分離效果,可選用減壓柱層析分離,依次二氯 甲烷、二氯甲烷、二氯甲烷和甲醇的混合液作為洗脫液(洗脫液的用量均為4倍柱體積)進(jìn) 行梯度洗脫分離,所述二氯甲烷和甲醇的混合液的體積比依次為99 1、99 1、98 2、 98 2、97 3、97 3、96 4、96 4、95 5、95 5、94 6、94 6、93 7、93 7、 92 8、92 8、91 9、91 9,90 10,90 10,88 12,85 15,80 20,75 25 和 50 50,用上述洗脫液洗脫27次,依次得到27個餾分;在實際工業(yè)生產(chǎn)中,為了提高生產(chǎn) 效率、降低生產(chǎn)成本,可只用前述7個洗脫液進(jìn)行洗脫,取第7個餾分。將第7個餾分用體 積比為5 5 1的石油醚、二氯甲烷和甲醇的混合液作為洗脫液(該洗脫液的用量為柱 體積的5倍)進(jìn)行凝膠柱層析分離5次,依次得到5個餾分,將第5個餾分用反相液相色譜 進(jìn)行純化(分離條件為Agilent反相色譜柱,RP-18,9. 4*250mm,檢測波長254納米,流動 相為體積比為70%甲醇水溶液),得到式I化合物。該方法中所用凝膠柱為S印hadexLH-20 凝膠柱。該化合物為無色油狀物;結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果如下所示[a] D20+73. 0 (c 0. 17,MeOH) ;UV (MeOH)入 max 259nm ; CD(MeOH) A e 292nm_l. 347,A e 258nm+l. 067 ;IR vmax 3391,2949,2923,2864,1675,1650,1596,1433,1415,1335,1296,1234, 1188,1141,1078cm-1 ;和13C NMR數(shù)據(jù)如表1所示;分子式C16H2305 ;ESIMS m/z 295[M-H]-;
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按照下述步驟測定該化合物的抑制結(jié)核分支桿菌活性
在一個無菌的沒有操作過BCG操作臺內(nèi),使用常規(guī)的無菌操作手段進(jìn)行準(zhǔn)備工作。1、配制7H9培養(yǎng)基將Middlebrook 7H9Broth 4. 7 克、甘油 2 毫升、吐溫-800. 5 毫升和 MiddlebrookOADC Enrichment 100毫升混合均勻,調(diào)節(jié)pH值至7. 0后,用0. 22um孔徑濾膜 過濾除菌,得到所述7H9培養(yǎng)基,避光保存于4°C,取1000毫升備用。2、取100塊96孔黑色的細(xì)胞培養(yǎng)板,該培養(yǎng)板的底部為透明底,將該培養(yǎng)板的蓋 子取下,分裝40 yl前述7H9培養(yǎng)基到96孔培養(yǎng)板各個孔;3、轉(zhuǎn)移2iU式II所述化合物的二甲基亞砜溶液(濃度為lmg/ml開始,進(jìn)行二 倍梯度稀釋 8 次,濃度依次為 lmg/ml、500 ii g/ml、250 ii g/ml、125 ii g/ml、62. 25u g/ml, 31. 125ii g/ml、15. 625 u g/ml 和 7. 8125u g/ml)到每個孔;4、將Mycobacterium bovis牛型結(jié)核分支桿菌減毒株bacillus Calmette-GuerinBCG(ATCC 35734)菌株接入含有50ml 7H9培養(yǎng)基的無菌聚苯乙烯滾瓶中 (規(guī)格側(cè)面積490平方厘米);
5、滾瓶轉(zhuǎn)速設(shè)定為2rpm,培養(yǎng)溫度37°C。培養(yǎng)BCG菌株使其吸光度0D_ = 0. 6-0. 8,達(dá)到對數(shù)生長期;6、使用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速500rpm離心BCG菌液,使成團(tuán)塊狀的菌體部分沉淀;轉(zhuǎn)移上 清菌液至新管,并使用分光光度計讀取吸光值0D_ ;7、用所述7H9培養(yǎng)基將BCG菌液上清稀釋至0D_ = 0. 05,總體積為400毫升,足 夠每孔40 Pi使用;8、將步驟7稀釋后的BCG JP15菌液分裝到步驟3中96孔培養(yǎng)板,每孔分裝40 yl, 重新蓋上96孔培養(yǎng)板板蓋進(jìn)行培養(yǎng);9、將步驟9中密封的培養(yǎng)板置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時;10、取出96孔培養(yǎng)板,取下板蓋,使用EnVision Multilabel Plate Reader讀取吸 光度值0D_,記錄數(shù)據(jù)。設(shè)置沒有經(jīng)過化合物II處理的陰性對照組,并按照下述方法設(shè)置 陽性對照藥物異煙胼將終濃度依次為500ng/ml、100ng/ml、20ng/ml、4ng/ml、0. 8ng/ml、 0. 16ng/ml、0. 032ng/ml和0. 0064ng/ml的陽性對照藥物異煙胼置于前述步驟3中96孔培 養(yǎng)板中。已報道異煙胼對于Mycobacterium bovis BCG的最低抑菌濃度MIC為100ng/ml, 經(jīng)上述測定可知,異煙胼濃度低于lOOng/ml后0D■值明顯逐漸增大。截止值在此設(shè)置 為0. 055 (陰性對照組0D_平均值的1/2,反映BCG JP15的生長狀況被抑制50% ),因此, 0D_值低于截止值的培養(yǎng)孔被定義為陽性,該孔所對應(yīng)的樣品即為具有抑制結(jié)核分支桿菌 活性。此外,同時利用一塊96孔培養(yǎng)板作為正對照板,用于檢測測定結(jié)果是否可信,當(dāng)Z factor值低于0.5時測定結(jié)果不可信。該正對照板的處理方法與上相同,僅在步驟3時,將 作為正對照板的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板左側(cè)的48個孔內(nèi)各加入1 P g/ml的異煙胼,右側(cè)48個孔 內(nèi)各加入2 ill的DMS0。37°C培養(yǎng)72小時后讀取吸光值0D6(1(1。左側(cè)48個孔的0D6(1(1值計算 標(biāo)準(zhǔn)偏差定義為Sdmin,計算平均值定義為Min ;右側(cè)48個孔的0D,值計算標(biāo)準(zhǔn)偏差定義為 Sd_,計算平均值定義為Max,將所得數(shù)值按照如下公式計算Z factor Z factor = 1—3 (Sdmax+Sdmin)/Max—Min按照上述方法計算得到,Z factor為0. 8,大于0. 5,證明上述檢測結(jié)果可信,式II 化合物的MIC為18. 6 y g/ml,本發(fā)明提供的式II所示化合物具有抑制結(jié)核分支桿菌活性。其中,所用康氏木霉(Trichoderma koningii)MF349 由邊疆(border78@gmail. com)于2006年7月分離自中國南海海泥,其分離方法如下1) lg海泥樣品溶于20mL無菌水中(定義為10°稀釋液);2)加入20個直徑3 5毫米的玻璃珠,42°C劇烈振蕩培養(yǎng)30min。3)按照下述方法配制10—1稀釋液取lmL10°稀釋液,加入9mL無菌水,混勻,得到 10-1稀釋液;按照同樣的方法配制10_2稀釋液和10_3稀釋液。4)分別取0. lmLlO-1稀釋液、0. lmL 10_2稀釋液和0. lmL 10_3稀釋液,用玻璃刮刀 涂布于真菌分離培養(yǎng)基PDA上。每個稀釋度設(shè)5個平板,共15個板,于28°C倒置培養(yǎng)一周。 一周以后選取長有真菌菌落的平板,用牙簽挑取各個形態(tài)的菌株到PDA培養(yǎng)基,培養(yǎng)基編 號記錄樣品、處理手段、稀釋度,28°C倒置培養(yǎng)一周。根據(jù)康氏木霉的ITS序列(該序列如序列表中序列1所示)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如
8圖8所示,表明Mf349與康氏木霉(Trichoderma koningii)相似度最高,進(jìn)化距離最近, 可初步確定Mf349屬于木霉屬(FiglE)。進(jìn)而利用形態(tài)學(xué)的手段對Mf349的菌絲及孢子 進(jìn)行觀察,并與美國農(nóng)業(yè)部研究中心提供的木霉照片進(jìn)行比較,進(jìn)一步確定Mf349的種屬。 如圖7所示,通過顯微鏡可以明顯觀察到Mf349能在菌絲頂端或菌絲中部形成圓球形的 厚垣孢子,而且能夠觀察到光滑近球形的分生孢子,這些特征都是康氏木霉(Trichoderma koningii)的典型特征。而且Mf349的這些形態(tài)特征與美國農(nóng)業(yè)部研究中心提供的康氏木 霉(Trichoderma koningii)照片完全相符。最后,根據(jù)ITS進(jìn)化樹及形態(tài)特征,確定Mf349 為康氏木霉(Trichoderma koningii)。該康氏木霉(Trichodermakoningii)MF349 已于 2010 年 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC),保藏號為序列表<110>中國科學(xué)院微生物研究所<120>聚酮化合物及其制備方法與應(yīng)用<130>CGGNAM102039<160>1<210>1<211>564<212>DNA<213> 康氏木霉(Trichoderma koningii)<400>1gggatcattacggcggggtcaaccaaactctcaaaatgaaagcgaaatgccacattgcgcaacccctccgaaatacagtgggagcgcggcggtaggaata 9
1月5日保藏于中國微 CGMCC No 3576。
ccgagtttac3-3.CtCCC3.3-3.cccaatgtga3-CC3.t3.CC3.3.actgttgcct60acgccccgggtgcgtcgcagccccggaaccaggcgcccgccggagggacc120tttctgtagtcccctcgcggacgttatttcttacagctctgagcaaaaat180tcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgc240gataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacg300ccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcg360gggggtcggcgttggggatcgggaacccctaagacgggatcccggccccg420gcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacaactcgcaccg480gcgtccacgtccgtaaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatca540cccgctgaacttaa56權(quán)利要求
式I所示聚酮類化合物,(式I)。dest_path_G2010100343569D00011.tif
2.一種制備權(quán)利要求1所述化合物的方法,包括如下步驟1)在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)康氏木霉(Trichodermakoningii)MF349至形成孢子;2)用無菌水沖洗收集所述孢子,將所收集的孢子接種到由滅菌大米和水組成的培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng),得到康氏木霉發(fā)酵物;3)利用乙酸乙酯浸提所述康氏木霉發(fā)酵物,將所述浸提步驟得到的提取液進(jìn)行濃縮得 到濃縮物a,加水混合后,用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取,合并乙酸乙酯萃取液后濃縮,得到 粗浸膏;4)將所述步驟3)得到的粗浸膏用乙酸乙酯溶解后與硅膠混合,待乙酸乙酯揮發(fā)后,進(jìn) 行吸附層析分離,先用二氯甲烷洗脫兩次,再用二氯甲烷與甲醇的混合液洗脫四次,依次得 到7個餾分;5)將所述步驟4)依次得到的7個餾分中第7個餾分用體積比為5 5 1的石油醚、 二氯甲烷和甲醇的混合液作為洗脫液吸附層析分離5次,依次得到5個餾分,將所述5個餾 分中第5個餾分純化后,得到權(quán)利要求1所述化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于所述步驟1)中,所述固體培養(yǎng)基為PDA培 養(yǎng)基;所述康氏木霉(Trichoderma koningii)MF349的保藏號為CGMCC3576 ;所述步驟3)中,所述乙酸乙酯與所述康氏木霉發(fā)酵物的體積比為2 1;所述水與所 述濃縮物a的質(zhì)量比為1 20;所述步驟4)中,所述吸附層析分離步驟中,所述二氯甲烷與甲醇的混合液中,二氯甲 烷與甲醇的體積比依次為99 1、99 1、98 2、98 2和97 3 ;所述步驟5)中,所述將第5個餾分純化的方法為用反相色譜柱進(jìn)行純化,流動相為體 積百分濃度為70%的甲醇水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于所述步驟2)中,所述PDA培養(yǎng)基上的孢 子液的接種量為所述由大米和水組成的培養(yǎng)基重量的5% ;所述由大米和水組成的培養(yǎng)基 中,所述大米和水的重量份數(shù)比為100g 40mL;所述步驟3)中,用乙酸乙酯浸提的次數(shù)為三次;所述步驟4)中,將所述步驟3)得到的粗浸膏用乙酸乙酯溶解后與硅膠混合的步驟中, 所述步驟3)得到的粗浸膏、乙酸乙酯與硅膠的質(zhì)量比為1 10 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述方法,其特征在于所述步驟1)中,培養(yǎng)的溫度為28°C, 培養(yǎng)的時間為10天;所述步驟2)中,培養(yǎng)的溫度為25°C,培養(yǎng)的時間為20天。
6.權(quán)利要求1所述化合物在制備抑制結(jié)核分枝桿菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用,其特征在于所述抑制結(jié)核分枝桿菌的產(chǎn)品為結(jié)核分 枝桿菌抑制劑或抑制結(jié)核分枝桿菌的藥物;所述結(jié)核分枝桿菌為保藏編號為ATCC35734的 牛型結(jié)核分枝桿菌減毒株。
8.康氏木霉(Trichoderma koningii)MF349,其保藏編號為 CGMCC3576。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚酮類化合物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供的聚酮類化合物,其結(jié)構(gòu)式如式I所示。其制備方法是利用康氏木霉(Trichoderma koningii)MF349進(jìn)行制備的。本發(fā)明提供的聚酮類化合物,適宜于制備抑制結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)品。本發(fā)明提供的制備上述聚酮類化合物的方法,工藝簡便,所得產(chǎn)物產(chǎn)率高,經(jīng)核磁檢測,其結(jié)構(gòu)正確。(式I)
文檔編號A61P31/06GK101863895SQ20101003435
公開日2010年10月20日 申請日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者代煥琴, 任彪, 傅成章, 宋福行, 張立新, 童垚俊, 郭徽 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所