專利名稱：：一種動物腸黏膜提取物及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種動物腸黏膜提取物及其制備方法與應用。
背景技術：
：我國是腸衣及肝素生產(chǎn)和出口大國，腸衣及肝素加工所用腸主要源于豬腸、羊腸等動物消化道組織，腸衣加工工藝分為傳統(tǒng)手工刮取及酶解，由于手工刮取費時費力、效率低下，并且無法利用肝素，目前逐漸被淘汰，而酶解法加工過程中的廢水排放量極大，廢水中氮含量豐富，化學耗氧量(C0D值)高，不宜直接排放。因此開發(fā)一種新的酶解工藝以提高排放廢物利用價值具有重要的意義?？咕?Antibacterialp印tide，ABP)是生物體內存在的一種具有抗菌活性的小分子多肽，與干擾素、補體等組成了宿主的免疫防御系統(tǒng)。由于其抗菌譜廣，能殺死抗生素耐藥菌株，且其殺菌機制使病原菌不易產(chǎn)生耐藥性突變，因此抗菌肽有望開發(fā)成為新一代抗細菌、真菌、病毒和抗癌的藥物。由于其應用前景廣闊，已成為生命科學領域一個研究熱點，研究主要集中在抗菌肽的分離與提純、基因工程克隆與表達抗菌肽基因等方面。目前已有大量利用基因工程技術在微生物中直接表達抗菌肽基因的研究，但由于抗菌肽對宿主菌有很強的殺傷力而不能獲得表達產(chǎn)物；這就需要以融合蛋白的形式表達抗菌肽基因，但存在表達效率低等問題。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種動物腸黏膜提取物(抗菌肽)及其制備方法。本發(fā)明所提供的動物腸黏膜提取物是按照包括下述步驟的方法制備得到的1)取離體動物小腸，刮取腸壁的黏膜層，離心，收集沉淀；其中，所述動物小腸為除人外的動物小腸，如豬小腸、羊小腸；2)將步驟1)得到的沉淀加入水中，然后向所述水中加入胰蛋白酶，進行酶解I，酶解結束后，滅酶、冷卻；接著再向所述水中加入木瓜蛋白酶，進行酶解II，酶解結束后，滅酶、冷卻；最后離心取上清液，得到腸黏膜酶解液；3)向所述腸黏膜酶解液中加入質量濃度5%_10%的乙酸溶液，攪拌浸提，然后將浸提液離心，收集沉淀和上清液；4)將所述上清液的pH值調節(jié)到6.0-7.0，冷凍干燥，得到動物腸黏膜提取物。其中，步驟2)中所述胰蛋白酶的加入量可為3000-4000U/g沉淀，所述木瓜蛋白酶的加入量可為3000-5000U/g沉淀。步驟2)中所述酶解I的條件如下酶解溫度37-4(TC，酶解時間3-6h，酶解pH值為6.5-7.5;所述酶解II的條件如下酶解溫度37-4(TC，酶解時間3-6h，酶解pH值為6.5_7.5。步驟2)中所述沉淀與水的質量比可為1:5-1:10;步驟2)中所述滅酶的條件為沸水浴滅酶5-10min;步驟2)中所述離心的條件為10000-12000g離心12-15min。步驟3)中所述乙酸溶液的加入量為所述腸黏膜酶解液體積的1-2倍，優(yōu)選為1倍；所述攪拌浸提的溫度為4-l(TC，優(yōu)選為4t:，時間為12-24h，優(yōu)選為12h;上述步驟3)中所述離心的條件均為10000-12000g離心10-15min。為了進一步提高回收率，還可按照步驟3)的方法對步驟3)收集的沉淀進行一次或多次浸提，具體方法如下向步驟3)離心收集的沉淀中加入質量濃度為5%_10%的乙酸溶液，攪拌浸提，然后將浸提液離心，收集沉淀和上清液；將所述上清液與步驟3)收集的上清液合并。為了提高所制備的動物腸黏膜提取物的純度，上述方法還包括下述純化的步驟a)將步驟4)得到的動物腸黏膜提取物溶于雙蒸水，用截留分子量為10KD的超濾管超濾，收集超濾液；b)將超濾液利用S印hadexG-100層析柱進行純化，收集具有抑菌作用的洗脫液，冷凍干燥，得到純化的動物腸黏膜提取物。上述S印hadexG-100柱層析的洗脫液可為0.2M、pH7.0的乙酸鈉溶液；洗脫液的流速可為1-1.5mL/min。本發(fā)明的另一個目的是提供動物腸黏膜提取物的用途。本發(fā)明所提供的動物腸黏膜提取物的用途是動物腸黏膜提取物在制備抗菌藥物中的應用。以本發(fā)明所提供的動物腸黏膜提取物為活性成分制備的抗菌藥物也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明提供了一種動物腸黏膜提取物及其制備方法。試驗證明，該腸黏膜提取物對細菌(如大腸桿菌)具有抗菌活性。本發(fā)明的方法適用于腸衣-肝素加工工藝改進，可利用該方法從腸衣_肝素加工廢水中提取制備動物腸黏膜提取物(飼用抗菌肽)。腸衣_肝素加工首先是用物理的方法刮去動物腸衣以外的其它成分，得到腸衣；再加入胰蛋白酶處理從腸衣上剝下的成分，控制酶解的溫度和時間，加入吸附樹脂進行吸附，回收樹脂，從回收的樹脂中提取肝素鈉；經(jīng)過上述步驟處理后得到的廢水中含有大量蛋白質，其中也包括具有抑菌作用的抗菌肽成分。但是由于蛋白酶對底物的作用有高度的專一性，采用單酶解時只能對幾個固定的氨基酸位點進行水解，使得水解效率不高，抗菌肽的回收效率降低。采用多種酶同時降解又會導致多種蛋白酶之間互為底物且相互水解，降低酶活性，進而影響降解的效率，增加成本。利用本發(fā)明的方法可以避免以上缺點，且該方法工藝簡單，既能提高產(chǎn)業(yè)附加值，又可減輕環(huán)境污染。圖1為豬腸道粘膜抗菌肽粗提物經(jīng)S印hadexG-100凝膠柱的層析洗脫曲線圖。圖2為實施例2中制備的牛血清蛋白的標準曲線圖。圖3為不同處理方法獲得的豬腸道粘膜抗菌肽粗提物對大腸桿菌的抑菌試驗效果圖。圖4為純化的豬腸黏膜提取物與粗提物的抑菌試驗效果對比圖。具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明的方法進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例1、兩步酶法制備豬腸黏膜提取物1)50ml離心管(15.5g)取樣稱重(25.4g)，樣品為剝取的小腸內壁經(jīng)離心后的沉淀，去除了樣品中水分，樣品重為9.9g。2)向上述離心管中加入50ml水，然后向所述水中加入3.6g(3000-4000U)胰蛋白酶(Sigma，T1426)，37。C水浴pH值為7.0-7.5條件下酶解6h，沸水浴滅酶5min，冷卻；接著再向所述重蒸水中加入O.8g(3000-5000U)木瓜蛋白酶(Sigma，P3250)，37。C水浴pH值為6.5-7.5條件下酶解6h，沸水浴滅酶10min，冷卻；最后以10，000g的轉速離心15min收集上清液，得到腸黏膜酶解液。3)向所述腸黏膜酶解液中加入等體積質量濃度為5X的乙酸溶液，4。C攪拌浸提過夜，將浸提液以10，000g離心15min，收集上清液；將沉淀懸起加入等體積質量濃度為5%的乙酸溶液，在4t:攪拌浸提過夜，將浸提液以10，000g離心15min，收集上清液；合并兩次上清液并進行冷凍干燥，得豬腸黏膜提取物。采用紫外分光光度法測定蛋白回收率。上述步驟l)到步驟2)的蛋白回收率為82.7%;步驟3)的蛋白回收率為38.37%。對比例1、其它方法制備豬腸黏膜提取物50ml離心管取樣稱重，樣品為剝取的小腸內壁經(jīng)離心后的沉淀，去除了樣品中水分；向離心管中加入50ml水，按照下述不同方法進行處理。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>將上述方法處理后的樣品，沸水浴煮沸10min，冷卻；最后以10，OOOg的轉速離心15min收集上清液，得到腸黏膜酶解液。向所述腸黏膜酶解液中加入等體積質量濃度為5X的乙酸溶液，4。C攪拌浸提過夜，將浸提液以10，OOOg離心15min，收集上清液；將沉淀懸起加入等體積質量濃度為5%的乙酸溶液，在4t:攪拌浸提過夜，將浸提液以10，000g離心15min，收集上清液；合并兩次上清液，將上述蛋白溶液分別進行冷凍干燥，得到對比例1、對比例2、對比例3三種處理的豬腸黏膜提取物。蛋白回收率測定將對比例1、對比例2、對比例3、實施例1得到的豬腸黏膜粗提物各0.87g、0.61g、0.16g、0.76g，分別溶于26ml水中。所得樣品溶液的體積如下1(對比例1).26ml;2(對比例2).24.5ml;3(對比例3).23ml;4(實施例1).26ml。標準曲線的繪制以各管相應標準牛血清白蛋白含量(mg)為橫坐標、A595為縱坐標，繪制標準曲線(見圖2)。所得標準曲線方程如下:y=15.132x+0.0199，R2=0.996(y:A0D;x:mg)測定樣品量為20ul，其結果為20ul中的蛋白含量，結果見表2。表2蛋白濃度測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表2結果可知，實施例1、對比例1、對比例2、對比例3得到的豬腸黏膜提取物經(jīng)冷凍干燥濃縮、溶解后的蛋白濃度，即腸黏膜粗提取物的蛋白濃度。實施例3、抗菌活性測定采用瓊脂糖彌散法進行抗菌試驗，具體方法如下在培養(yǎng)皿上傾倒一層底層瓊脂(10ml)。底層瓊脂含1%瓊脂糖，0.022%營養(yǎng)肉湯粉，10mmol/LPBS(pH7.4)，及對數(shù)生長期的大腸桿菌(EscherichiacoliATCC25922)(1.0X106/ml)。在底層瓊脂上打直徑3mm的圓孔，(根據(jù)表2結果，即根據(jù)蛋白濃度的比例計算每孔加入粗提物的體積，以保證每孔加入的蛋白量一致)分別取出4.4iU，6iU，20iil，5.4iil，加水補齊至20iil，每孔加入20ia稀釋后的實施例2中測定蛋白回收率的樣品溶液。37。C孵育3h后，在底層瓊脂上覆蓋一層2X營養(yǎng)瓊脂，37。C繼續(xù)孵育過夜，觀察測量抗菌環(huán)的直徑，結果見圖3，圖3中1號為對比例1樣品，2號為對比例2樣品，3號為對比例3樣品，4號為實施例1樣品。由圖3可知，對比例1、對比例2樣品沒有抗菌環(huán)出現(xiàn)；對比例3、實施例1樣品有抗菌環(huán)出現(xiàn)，其中，對比例3樣品的抑菌圈直徑約8mm;實施例1樣品的抑菌圈直徑約9mm;但是由實施例2可知，實施例1樣品的蛋白回收率是對比例3的3.7倍，所以實施例1得到的產(chǎn)品中具有抑菌活性的物質含量較高且抑菌效果好。實施例4、豬腸黏膜提取物的純化及抑菌活性測定將實施例1制備的豬腸黏膜粗提物溶于雙蒸水，用截留分子量為10KD的超濾管超濾，收集超濾液。將所述超濾液上樣于S印hadexG-lOO凝膠過濾柱(①1.0x30.Ocm)。用0.2M，pH7.0乙酸鈉以流速lmL/min進行洗脫，每管收集3mL，共收集20管。以層析流出液的體積為橫座標，以相應的^95值為縱座標，作出洗脫曲線圖，見圖1。用瓊脂糖彌散法檢測洗脫液的抗菌活性，圖1中箭頭所指洗脫峰具有抗菌活性。將具有抑菌作用的洗脫液進行合并，冷凍干燥，得到純化的豬腸黏膜提取物。將純化的豬腸黏膜提取物與粗提物的抑菌效果進行對比，結果見圖4，圖4中，a為第10管洗脫液即27-30ml;b為第13管洗脫液即36_39ml，c為純化的豬腸黏膜提取物(第11、12管洗脫液即30-36ml);d為豬腸黏膜粗提物。由圖4可知，純化后的豬腸黏膜提取物的抑菌效果明顯優(yōu)于豬腸黏膜粗提物。權利要求一種制備動物腸黏膜提取物的方法，包括下述步驟1)取離體動物小腸，刮取腸壁的黏膜層，離心，收集沉淀；其中，所述動物小腸為除人外的動物小腸；2)將步驟1)得到的沉淀加入水中，然后向所述水中加入胰蛋白酶，進行酶解I，酶解結束后，滅酶、冷卻；接著再向所述水中加入木瓜蛋白酶，進行酶解II，酶解結束后，滅酶、冷卻；最后離心取上清液，得到腸黏膜酶解液；3)向所述腸黏膜酶解液中加入質量濃度為5％-10％的乙酸溶液，攪拌浸提，然后將浸提液離心，收集沉淀和上清液；4)將步驟3)得到的上清液的pH值調節(jié)到6.0-7.0，冷凍干燥，得到動物腸黏膜提取物。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中所述胰蛋白酶的加入量為3000-4000U/g沉淀，所述木瓜蛋白酶的加入量為3000-5000U/g沉淀。3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟2)中所述酶解I的條件如下酶解溫度37-4(TC，酶解時間3-6h，酶解pH值為6.5_7.5;所述酶解II的條件如下酶解溫度37-4(TC，酶解時間3-6h，酶解pH值為6.5_7.5。4.根據(jù)權利要求l-3中任一所述的方法，其特征在于步驟2)中所述沉淀與水的質量比為l:5-1:10;步驟2)中所述滅酶的條件為沸水浴滅酶5-10min;步驟2)中所述離心的條件為10000-12000g離心12-15min。5.根據(jù)權利要求l-4中任一所述的方法，其特征在于步驟3)中所述乙酸溶液的加入量為所述腸黏膜酶解液體積的1-2倍，優(yōu)選為1倍；所述攪拌浸提的溫度為4-l(TC，優(yōu)選為4t:，時間為12-24h，優(yōu)選為12h;步驟3)中所述離心的條件為10000-12000g離心10-15min。6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括在步驟3)后步驟4)前至少重復一次下述操作向步驟3)離心收集的沉淀中加入質量濃度為5%-10%的乙酸溶液，攪拌浸提，然后將浸提液離心，收集沉淀和上清液；將所述上清液與步驟3)收集的上清液合并。7.根據(jù)權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括下述純化的步驟a)將所述步驟4)得到的動物腸黏膜提取物溶于雙蒸水，用截留分子量為10KD的超濾管超濾，收集超濾液；b)將超濾液利用S印hadexG-100層析柱進行純化，收集具有抑菌作用的洗脫液，冷凍干燥，得到純化的動物腸黏膜提取物；S印hadexG-100柱層析的洗脫液為0.2M、pH7.0的乙酸鈉溶液，洗脫液流速為1-1.5mL/min;所述具有抑菌作用的洗脫液優(yōu)選按照下述方法收集得到的將所述超濾液上樣于規(guī)格為①1.0x30.0cm的S印hadexG-100凝膠過濾柱，用0.2M，pH7.0乙酸鈉以流速lmL/min進行洗脫，收集第30-36ml的洗脫液。8.根據(jù)權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中所述動物小腸為豬小腸或羊小腸。9.按照權利要求1-8中任一所述方法制備得到的動物腸黏膜提取物。10.權利要求9所述的動物腸黏膜提取物在制備抗菌藥物中的應用，所述抗菌藥物優(yōu)選為抗細菌藥物，所述細菌優(yōu)選為大腸桿菌。全文摘要本發(fā)明公開了一種動物腸黏膜提取物及其制備方法與應用。該動物腸黏膜提取物是按照包括下述步驟的方法制備得到的1)取離體動物小腸，刮取腸壁黏膜層，離心，收集沉淀；2)將所述沉淀加入水中，然后向重蒸水中加入胰蛋白酶，進行酶解I，酶解結束后，滅酶、冷卻；接著再向重蒸水中加入木瓜蛋白酶，進行酶解II，酶解結束后，滅酶、冷卻；最后離心取上清液，得到腸黏膜酶解液；3)向腸黏膜酶解液中加入質量濃度為5％-10％的乙酸溶液，攪拌浸提，然后將浸提液離心，收集上清液；將所述上清液的pH值調節(jié)到6.0-7.0，冷凍干燥，得到動物腸黏膜提取物。試驗證明，該腸黏膜提取物對細菌(如大腸桿菌)具有抗菌活性。文檔編號A61P31/04GK101773522SQ20101011768公開日2010年7月14日申請日期2010年3月3日優(yōu)先權日2010年3月3日發(fā)明者何夙旭,劉玉春,周志剛,姚斌,張宇婷,曹雅男,石鵬君,趙旭民申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所;義烏市華太飼料有限公司