專利名稱：基于端粒酶顯像的腫瘤診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明生物試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體是以采用放射性標(biāo)記的端粒抑素來對腫瘤進(jìn)行“像，從而進(jìn)行腫瘤的早期診斷。技術(shù)背景腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，早期治療，可降低篩查人群癌癥死亡率，改善預(yù)后，提高生活質(zhì)量，減少放化療藥物的使用率，降低治療費用。然而腫瘤的早期診斷一直是一個沒有攻克的難題，因而發(fā)現(xiàn)合適的腫瘤標(biāo)志和合理選擇與應(yīng)用腫瘤標(biāo)志達(dá)到篩查和早期診斷目的，是當(dāng)前的首要任務(wù)。常用的篩查方法有子宮頸癌的巴氏涂片，結(jié)直腸癌的隱血試驗，前列腺癌的肛指檢查食道癌的拉網(wǎng)等，但這些檢查均不理想。計算機斷層掃描、超聲診斷、乳房攝影等檢測的K小極限為lcm(109細(xì)胞)直徑的腫瘤。從理論上講，腫瘤標(biāo)志較敏感，當(dāng)腫瘤當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到108時，就可采用免疫法、多重聚合酶鏈反應(yīng)、芯片等技術(shù)檢測到蛋白、酶、癌基因等生化變化。臨床證實，甲胎蛋白陽性比物理檢查早出現(xiàn)9個月。而腫瘤標(biāo)有須定位、可以定量、無創(chuàng)、能動態(tài)監(jiān)測、易普及和推廣等優(yōu)點，可作為首選的初篩方法。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其DNA的特殊是含有大量的(TTAGGG)n串聯(lián)重復(fù)并富含G的重復(fù)序列，這些序列在進(jìn)化中高度保守。端粒結(jié)構(gòu)功能主要有2個一是可保護(hù)染色體基因組免受被降解或有害重組，其二是端粒重復(fù)可為染色體末端提供一種可消耗的非編碼序列以暫時緩沖或取消末端復(fù)制問題所帶來的染色體DNA 進(jìn)行性縮短。大多數(shù)普通體細(xì)胞的端粒會隨周期性復(fù)制而逐漸縮短，最終達(dá)到一個使染色體完整性喪失的臨界點，細(xì)胞增殖停止。說明端粒的縮短與高等真核生物中正常體細(xì)胞增生受到限制相關(guān)，在細(xì)胞衰老中扮演“分裂鐘”的作用。與體細(xì)胞不同，生殖細(xì)胞要為將來產(chǎn)生新的有機體而保存基因組的全部信息。為此它們必須解決端?？s短所引起的不良后果，方法是在染色體末端補充新的端粒重復(fù)序列。端粒酶就是行使這種功能的DNA聚合酶，它是由RNA、蛋白質(zhì)構(gòu)成的核酸蛋白，可在體內(nèi)以酶結(jié)構(gòu)中的RNA成份(與端粒重復(fù)序列互補)為模板，在染色體末端催化添加TTAGGG重復(fù)序列。在生殖細(xì)胞中由于有端粒酶表達(dá)，其端粒不隨年齡增長而縮短，故生殖細(xì)胞為永生細(xì)胞。由于端粒縮短和端粒酶無活性，體細(xì)胞通常逐漸衰老死亡。僅有極少數(shù)細(xì)胞偶然通過激活端粒酶而逃避程序性老化，其生存延長可能給另外的基因損傷的積累提供機會， 導(dǎo)致進(jìn)行性腫瘤性發(fā)展[2]。在大多數(shù)癌細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞中端粒酶均有高水平表達(dá)[3]。 表明端粒酶的激活表達(dá)與細(xì)胞的無限增殖有密切關(guān)系，通過解除細(xì)胞衰老過程中的增生受限，端粒酶的束新活化可能是體細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。一些正常需要更新的組織表達(dá)低水平的端粒酶，其作用僅是部分補償末端復(fù)制問題造成的端粒進(jìn)行性縮短。已發(fā)現(xiàn)有端粒酶表達(dá)的正常組織有外周血淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、胚胎體細(xì)胞、毛發(fā)、皮膚、子宮內(nèi)膜等分裂旺盛的組織。正常外周血單個核細(xì)胞表達(dá)端粒酶的水平僅為無限增殖的癌細(xì)胞的 2%。Hiyama等發(fā)現(xiàn)正常的腸道粘膜有端粒酶活性，他認(rèn)為這種酶表達(dá)起源于腸道基底干細(xì)胞，但其水平比癌性粘膜低10倍 100倍。盡管造血祖細(xì)胞和激活的淋巴細(xì)胞表達(dá)很強的端粒酶活性，但端粒仍然逐漸縮短， 提示在這些細(xì)胞是以一種與端粒長度無關(guān)的方式上調(diào)酶活性。由于組織樣品通常是不同類型細(xì)胞的混合物，其中可能含有表達(dá)端粒酶的正常細(xì)胞，如果不了解由正常細(xì)胞產(chǎn)生的背景表達(dá)水平，就有可能將正常細(xì)胞的表達(dá)誤判為腫瘤細(xì)胞的表達(dá)。研究表明，大多數(shù)腫瘤組織細(xì)胞均有較高水平的端粒酶表達(dá)。而且在一些前侵襲性病變(如發(fā)育異常、原位癌)端粒酶表達(dá)的頻率很高，表明端粒酶激活是癌癥多步驟形成過程中的早期事件。常見惡性腫瘤端粒酶表達(dá)情形見附表。癌組織端粒酶表達(dá)有以下特點O癌組織表達(dá)陽性率很高，除少數(shù)腫瘤外，陽性率均在80%以上。而癌旁組織和正常相應(yīng)組織陽性率低于10%，為低水平表達(dá)。總體上，端粒酶表達(dá)與臨床特征無明顯關(guān)系， 但與臨床病理學(xué)特征有一定聯(lián)系。一些研究表明端粒酶活性反映了細(xì)胞的惡變程度。例如 SCLC的惡性程度高于NSCLC，故端粒酶的檢出率和活性均高于NSCLC[7]。胃癌中端粒酶陽性腫瘤惡性程度較高。前列腺癌組織中端粒酶活性相對水平與病理分化有關(guān)，高水平端粒酶活性在分化差的前列腺癌中更常見。在一些前侵襲性病變中端粒酶表達(dá)水平增加，如結(jié)腸腫瘤、口腔原位癌和發(fā)育異常病灶約半數(shù)表現(xiàn)端粒酶活性，盡管前侵襲病變并非都進(jìn)展為癌，但其中端粒酶表達(dá)陽性者似乎可列為密切監(jiān)控的對象。本發(fā)明是采用能靶向腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的端粒酶(tolemerase)的端粒抑素來進(jìn)行腫瘤早期檢測的目的。將端粒抑素采用锝標(biāo)記后，能高靈敏度診斷體內(nèi)端粒酶高表達(dá)區(qū)域，從而顯示腫瘤的早期發(fā)生部位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了以核素標(biāo)記的端粒抑素作為腫瘤診斷方法。該方法具體如下端粒抑素采用锝標(biāo)記后，進(jìn)行純化；純化后锝標(biāo)記端粒抑素靜脈注射，能顯像腫瘤的出現(xiàn)部位。本發(fā)明通過以下途徑實現(xiàn)1、室溫下取含氯化亞錫(SnC12) lmg,滴加2mL 99mTc-F洗脫液(比活度為5mci/ mL)和2mL濃度為ImM的端粒抑素，充分振搖lmin，靜置15min。采用硅膠G薄層板，展開劑為正丁醇-冰醋酸_水G 1 1)，展開后測端粒抑素的標(biāo)記率為99. 78%。2、標(biāo)記后的端粒抑素采用色譜進(jìn)行純化。锝標(biāo)記后的端粒抑素分子量較大，出峰時間晚于i標(biāo)記的端粒抑素約lmin。3、稀釋锝標(biāo)記后的端粒抑素至InM。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明實施例1皮下腫瘤對锝標(biāo)記后的端粒抑素的吸收取裸鼠10只，皮下接種IOf5Hela細(xì)胞，自然生長一周后，取2uL InM的锝標(biāo)記后的端粒抑素注射至裸鼠尾靜脈中。注射后監(jiān)測菏瘤區(qū)域腫瘤細(xì)胞對锝標(biāo)記后的端粒抑素的吸收。結(jié)果顯示，注射一小時后，瘤區(qū)能探測到锝的趨向，在4小時達(dá)到最大。M小時后沒有衰減，而在肝臟、脾臟、肺部等組織中，沒有探測到锝的存在。表明锝標(biāo)記后的端粒抑素能很好的進(jìn)行腫瘤顯像。實施例2肺原位腫瘤對锝標(biāo)記后的端粒抑素的吸收取小鼠10只，尾靜脈接種IO6小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，自然生長一周后，取2uL InM 的锝標(biāo)記后的端粒抑素注射至裸鼠尾靜脈中。注射后監(jiān)測肺部區(qū)域腫瘤細(xì)胞對锝標(biāo)記后的端粒抑素的吸收。結(jié)果顯示，注射0.6小時后，肺部能探測到锝的趨向，在4小時達(dá)到最大。 72小時后沒有衰減，而在肝臟、脾臟、腎臟等組織中，沒有探測到锝的存在。表明锝標(biāo)記后的端粒抑素能很好的進(jìn)行腫瘤顯像。
權(quán)利要求
1.一種基于放射性同位素锝標(biāo)記的腫瘤診斷試劑盒，其特征在于以锝標(biāo)記的端粒抑素進(jìn)行顯像。
2.端粒抑素的標(biāo)記方法為室溫下取含氯化亞錫(SnCU)lmg，滴加2mL 99mTc-F洗脫液(比活度為5mci/mL)和2mL濃度為ImM的端粒抑素，充分振搖lmin，靜置15min。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于端粒酶成像來檢測腫瘤細(xì)胞的方法。該方法具體如下室溫下取含氯化亞錫(SnCl2)1mg，滴加2ml 99mTc-F洗脫液(比活度為5mci/mL)和2ml濃度為1mM的端粒抑素，充分振搖1min，靜置15min。標(biāo)記后的端粒抑素采用色譜進(jìn)行純化。稀釋锝標(biāo)記后的端粒抑素，注射至動物體內(nèi)可對腫瘤區(qū)域進(jìn)行顯像。
文檔編號A61K51/08GK102188725SQ20101012147
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者吳錦昌, 周俊東, 張舒羽 申請人:蘇州百潤生物科技有限公司