專利名稱：一種靶向腫瘤的雙基因重組腺相關(guān)病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)、免疫學(xué)、基因蛋白質(zhì)學(xué)、生物醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，特別涉及含有雙基因的重組腺相關(guān)病毒載體、其制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的重大疾病之一。目前臨床上主要是采用放射治療及化學(xué)療法。然而，有些惡性腫瘤對(duì)放射治療不敏感，對(duì)化療易產(chǎn)生耐藥性，因此尋找新的有效治療腫瘤的候選藥物和治療方法是臨床醫(yī)生與患者的急切愿望。 腫瘤分子生物學(xué)的研究表明，腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因而以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而達(dá)到抑制腫瘤目的的策略成為近些年腫瘤基因治療的熱點(diǎn)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡中重要的誘導(dǎo)和下游執(zhí)行的中心分子。正常情況下，它在細(xì)胞中以酶原形式存在，一旦活化后即可以高效地不可逆地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且在多種腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程中廣泛性存在作用。已有研究表明，將caspase-3的大小亞基顛倒可以得到具有天然活性的caspase 分子(rev-Caspase-3)，這種重組活化的Caspase-3分子作用于腫瘤細(xì)胞后無(wú)需其它因子激活即可有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Caspase-3的大小亞基反向連接小亞基在前大亞基在后活性更好(J BiolChem, 1998 ；273 :10107-11)。此外，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的生成，通過(guò)抑制腫瘤新生血管生成，也是治療腫瘤的一種途徑。在內(nèi)源性血管生成抑制因子中，內(nèi)皮抑素(Endostatin，ES)最引人注目，它對(duì)體外內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的增殖抑制活性。在體內(nèi)，其可特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管形成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。但國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道ES需與化療藥物聯(lián)用才有較好的效果(Clin Cancer Res，2004，10 (Iptl) :33-42.；中國(guó)肺癌雜志，2005，8 (4) 283-290.臨床腫瘤學(xué)雜志，2007，12 (10) :728-735.) 雖然Caspase-3和內(nèi)皮抑素各自具有較好的腫瘤治療效果，但是尚沒(méi)有同時(shí)使用Caspase-3和內(nèi)皮抑素來(lái)治療惡性腫瘤的報(bào)道，也沒(méi)有將二者導(dǎo)入相同載體進(jìn)而提供基因治療藥物的報(bào)道，為此，發(fā)明人想通過(guò)基因工程手段將Caspase-3和內(nèi)皮抑素的基因同時(shí)導(dǎo)入合適的載體中，提供一種雙基因靶向治療載體，在保證caspase分子活性的基礎(chǔ)上，可同時(shí)使ES具有較好的效果，從而實(shí)現(xiàn)強(qiáng)效治療的目的。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，申請(qǐng)人對(duì)何種載體可以作為合適的候選載體進(jìn)行了分析，最后選擇腺相關(guān)病毒(Adeno associated virus, AAV)進(jìn)行了嘗試。因?yàn)橄傧嚓P(guān)病毒是一類微小、無(wú)被膜及具有二十面體結(jié)構(gòu)的細(xì)小單鏈DNA病毒。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)與AAV相關(guān)的疾病報(bào)道，因此AAV被公認(rèn)為是最安全的病毒載體。但由于包裝容量的限制，其多用于單基因的構(gòu)建、包裝(Curr Opin Mol Ther. 2003 ；5 (4) :367-75.)。對(duì)于用AAV攜帶該雙基因能否成功構(gòu)建與有效表達(dá)尚不得而知。為此，申請(qǐng)人進(jìn)行了本發(fā)明的研究工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先將Caspase-3與內(nèi)皮抑素雙基因克隆構(gòu)建于同一 AAV載體上，經(jīng)包裝純化后獲得新型重組腺相關(guān)病毒載體。并通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證新型重組腺相關(guān)病毒載體在體內(nèi)/體外的抗癌效果，由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一方面提供了一種新的攜帶雙基因在體內(nèi)表達(dá)的、生物安全性高的重組腺相關(guān)病毒載體rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin。該載體包含大小亞基反向連接的CaSpaSe3和內(nèi)皮抑素基因，其基因連接順序?yàn)?Caspase3小亞基-CaSpaSe3大亞基-IRES-內(nèi)皮抑素基因。也就是在腺相關(guān)病毒載體內(nèi)可操作地連接有SEQ ID NO 9所示的序列。本發(fā)明的另一方面是提供了制備如上所述的雙基因重組腺相關(guān)病毒載體rAAV-Re v-Caspase3-IRES-Endostatin的方法，具體包括以下步驟(1)制備 pAAV-Rev-Caspase3-IRES_Endostatin 質(zhì)粒具體地，本申請(qǐng)的發(fā)明人采用RT-PCR方法，首先從人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中提取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再根據(jù)設(shè)計(jì)的引物從該cDNA中分別擴(kuò)增出caspase-3基因的543大亞基(LS :pl7)及311小亞基(SS :pl2)，然后通過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)按小亞基置前，大亞基置后的順序連入pAAV-IRES-hrGFP多克隆位點(diǎn)，得到按照SS-LS的順序連接的、 含有活化的重組 caspase-3 基因的 pAAV-Rev-Caspase3-IRES_hrGFP 質(zhì)粒。用同樣的方法從成人肝臟組織提取RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出555bp的內(nèi)皮抑素(Endostatin，ES)基因片段。同時(shí)pAAV-IRES-hrGFP 為模板，通過(guò)特異性引物擴(kuò)增出670bp的IRES序列，將IRES與ENDOSTATIN連接，再將 IRES-ENDOSTATIN序列替換載體pAAV-IRES-hrGFP中的IRES-hrGFP序列，構(gòu)建獲得按照 SS-LS-IRES-ES 順序連接的重組載體 pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin。根據(jù)本發(fā)明，所述的腺相關(guān)病毒優(yōu)選用AAV2型。(2)重組腺相關(guān)病毒載體 rAAV-Rev-Caspase3-IRES_Endostatin 的制備根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的制備雙基因重組腺相關(guān)病毒載體的方法還包括包裝純化該重組腺相關(guān)病毒載體的步驟。所述的病毒包裝是指，由于病毒本身不能自己繁殖復(fù)制，必須依賴真核細(xì)胞的蛋白核酸等原料包裝。尤其是本發(fā)明所采用的質(zhì)粒中沒(méi)有包含完整的病毒基因，轉(zhuǎn)染一般的細(xì)胞是不能包裝出病毒的(病毒基因組不完整)。只有加入輔助質(zhì)粒(其中含有有助于病毒包裝的必需蛋白的基因)后，才能有效的啟動(dòng)病毒包裝。根據(jù)本發(fā)明，所述的包裝步驟是指將pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，使之產(chǎn)生病毒顆粒。所述的輔助質(zhì)?？梢允莗SH3、pAAV_RC和pHelper等，本發(fā)明中優(yōu)選使用pAAV-RC、 pHelper兩種質(zhì)粒，這兩種質(zhì)粒與pAAV-Rev-Caspase3-IRES_Endostatin共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞。所述的轉(zhuǎn)染方法可以是電穿孔法、顯微注射法、基因槍法、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、多種陽(yáng)離子物質(zhì)或病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法等，本發(fā)明中優(yōu)選采用磷酸鈣共沉淀法。所述的包裝細(xì)胞可以是現(xiàn)有技術(shù)中常用的包裝細(xì)胞，例如人胚腎細(xì)胞HEK293或者金黃地鼠胚胎腎細(xì)胞BHK-21等，本發(fā)明中，優(yōu)選使用HEK293細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述的包裝步驟還包括在用輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后，培養(yǎng) 65-72小時(shí)后，收獲細(xì)胞，用1 X PBS重懸細(xì)胞置-80 °C冰箱凍存。根據(jù)本發(fā)明，制備雙基因重組腺相關(guān)病毒載體的方法還包括用肝素一瓊脂糖親和層析方法純化，制得高純度高滴度重組腺相關(guān)病毒載體rAAV-Rev-Caspasd-IRES-Endos tatin。本發(fā)明的再一方面提供了本發(fā)明的病毒載體rAAV-Rev-Caspase3-IRES_Endostat in的醫(yī)藥用途，例如在制備用于預(yù)防和治療惡性腫瘤，特別是實(shí)體瘤(例如肝癌)的藥物中的用途。其中的腫瘤包括但不限于肝癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、腎癌。根據(jù)本發(fā)明，將制備的rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin用于肝癌細(xì)胞株及肝癌模型鼠以檢測(cè)其抗腫瘤效果，結(jié)果表明該重組腺相關(guān)病毒載體具有明顯的抑制腫瘤作用。本發(fā)明還涉及含有重組腺相關(guān)病毒載體rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin 的組合物，其中還含有藥學(xué)允許的賦形劑。發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次成功地將Caspase-3與內(nèi)皮抑素雙基因構(gòu)建于同一 AAV載體上，經(jīng)包裝純化后獲得新型重組腺相關(guān)病毒載體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的新型重組腺相關(guān)病毒載體具有明顯的抗癌作用。由此提供了一種新的雙基因靶向治療載體，可能進(jìn)一步提高抗腫瘤治療效果。


圖IA 質(zhì)粒pAAV-IRES-GFP的結(jié)構(gòu)示意 IB 質(zhì)粒 pAAV-Rev-Caspase3-IRES_Endostatin 的結(jié)構(gòu)示意圖。圖 2 :rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin 的純度與滴度檢測(cè)。圖 2A 結(jié)果表明該重組病毒中三種外殼蛋白VP1，VP2，VP3的比例為1 1 10，純度達(dá)到要求。圖2B表示病毒滴度檢測(cè)時(shí)的雜交結(jié)果。圖 3 用 rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin 轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株 H印G2，24、48、72 小時(shí)后細(xì)胞的變化。其中，圖3A為轉(zhuǎn)染前對(duì)照；圖:3B為轉(zhuǎn)染后M小時(shí)；圖3C為轉(zhuǎn)染前對(duì)照；圖3D為轉(zhuǎn)染后M小時(shí)；圖3E為轉(zhuǎn)染前對(duì)照；圖3F為轉(zhuǎn)染后48小時(shí)；圖3G為轉(zhuǎn)染前對(duì)照；圖3H為轉(zhuǎn)染后72小時(shí)。其中圖3A，;3B是在普通光鏡下的視野照片；圖3C-3H是由瑞吉染色后由普通光鏡下觀察得到的視野照片。其中3A是;3B的對(duì)照，3C是3D的對(duì)照，3E是 3F的對(duì)照，3G是3F的對(duì)照。圖4 :rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin重組病毒對(duì)荷瘤模型鼠的作用。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)技術(shù)可參見(jiàn)J.薩母布魯克等編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)》;所使用的工具酶均購(gòu)自New England Biolab公司，具體的反應(yīng)條件和使用的方法均參考商品說(shuō)明書；所使用的膠回收試劑盒購(gòu)自安比奧生物技術(shù)公司，使用方法參考商品說(shuō)明書。實(shí)施例1.構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒載體pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin質(zhì)粒DRT-PCR 克隆 Rev_Caspase3 基因的引物Rev-Caspase3分為大亞基LS (ρ 17)與小亞基SS (ρ 12)。根據(jù)序列用Ρ5軟件設(shè)計(jì)引物如下
權(quán)利要求
1.重組腺相關(guān)病毒載體，其中沿著腺相關(guān)病毒的轉(zhuǎn)錄方向可操作地連接有SEQID NO 9所示的外源基因，所述外源基因是編碼反向連接的CaSpaSe3大小亞基的基因和內(nèi)皮抑素基因，其基因連接順序?yàn)?’ -Caspase3小亞基編碼基因-Caspase3大亞基編碼基因-IRES 編碼基因-內(nèi)皮抑素編碼基因_3’。
2.含有權(quán)利要求1的重組腺相關(guān)病毒載體的宿主細(xì)胞。
3.含有權(quán)利要求1的重組腺相關(guān)病毒載體的組合物，其中還含有藥學(xué)允許的賦形劑。
4.制備權(quán)利要求1的重組腺相關(guān)病毒載體的方法，包括步驟(a)用基因工程方法構(gòu)建質(zhì)粒pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin，其包含大小亞基反向連接的CaspaSe3和內(nèi)皮抑素基因，其基因連接順序?yàn)镃aSpaSe3小亞基-CaSpaSe3 大亞基-IRES-內(nèi)皮抑素基因；(b)將(a)中構(gòu)建的質(zhì)粒pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞；(c)收獲(b)中的細(xì)胞，依照常規(guī)方法獲得重組病毒載體rAAV-Rev-CaspaseS-IRES-En dostatin。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的輔助質(zhì)粒可以是pSH3、pAAV-RC和pHelper，優(yōu)選 pAAV-RC和pHelper兩種質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述的轉(zhuǎn)染方法可以是電穿孔法、顯微注射法、基因槍法、 磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、多種陽(yáng)離子物質(zhì)或病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，優(yōu)選磷酸鈣共沉淀法。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述的包裝細(xì)胞是人胚腎細(xì)胞HEK293或者金黃地鼠胚胎腎細(xì)胞BHK-21，優(yōu)選人胚腎細(xì)胞HEK293。
8.權(quán)利要求1的重組腺相關(guān)病毒載體在制備腫瘤治療藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1中的重組腺相關(guān)病毒載體用于抑制腫瘤生長(zhǎng)的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9和10的用途，其中的腫瘤包括肝癌、胰腺癌、膽管癌、肺癌、腎癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靶向腫瘤的雙基因重組腺相關(guān)病毒載體，具體地涉及同時(shí)含有大小亞基反向連接的Caspase3和內(nèi)皮抑素的重組腺相關(guān)病毒載體、其制備方法及其抗腫瘤的用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102212556SQ201010137619
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2010年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者唐升斌, 肖艷桃, 譚孟群, 趙霏 申請(qǐng)人:深圳市湘雅生物醫(yī)藥研究院