專利名稱::角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2在制備防治肺損傷的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子_2在制備防治肺損傷的藥物中的應(yīng)用,屬于防治肺損傷的藥物
技術(shù)領(lǐng)域:
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背景技術(shù):
:急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是呼吸系統(tǒng)的一種常見危重癥,發(fā)病率和死亡率均高,嚴(yán)重威脅重癥患者的生命并影響其生存質(zhì)量。流行病學(xué)調(diào)查顯示ALI/ARDS是臨床常見危重癥。根據(jù)1994年歐美聯(lián)合會(huì)議提出的ALI/ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn),ALI發(fā)病率為每年18/10萬(wàn),ARDS為每年1323/10萬(wàn)。2005年的研究顯示,ALI/ARDS發(fā)病率分別在每年79/10萬(wàn)和59/10萬(wàn)。上海市ARDS協(xié)作組調(diào)查結(jié)果表明,上海15家三級(jí)甲等醫(yī)院2001年3月-2002年2月ARDS死亡率71.8%。提示ALI/ARDS發(fā)病率顯著增高,甚至可與胸部腫瘤、AIDS、哮喘或心肌梗死等相提并論。ALI/ARDS是由肺內(nèi)和/或肺外因素所引起的肺部損傷。在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性疾病過(guò)程中,肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。以肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、嚴(yán)重的通氣/血流比例失調(diào)為病理生理特征,臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫,肺部影像學(xué)上表現(xiàn)為非均一性的滲出性病變。多種危險(xiǎn)因素可誘發(fā)ALI/ARDS,主要包括直接肺損傷因素嚴(yán)重肺部感染,胃內(nèi)容物吸入,肺挫傷,吸入有毒氣體,淹溺、氧中毒等;間接肺損傷因素嚴(yán)重感染,嚴(yán)重的非胸部創(chuàng)傷,急性重癥胰腺炎,大量輸血,體外循環(huán),彌漫性血管內(nèi)凝血等。甚至在臟器移植、腫瘤并發(fā)癥和全身各臟器病變和/或衰竭也可致肺部損傷。ALI/ARDS的基本病理生理改變是肺泡上皮和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮通透性增加所致的非心源性肺水腫。由于肺泡水腫、肺泡塌陷導(dǎo)致嚴(yán)重通氣/血流比例失調(diào),特別是肺內(nèi)分流明顯增加,產(chǎn)生嚴(yán)重的低氧血癥。肺血管痙攣和肺微小血栓形成引發(fā)肺動(dòng)脈高壓。ARDS早期的特征性表現(xiàn)為肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞屏障的通透性增高,肺泡與肺間質(zhì)內(nèi)積聚大量的水腫液,其中富含蛋白及以中性粒細(xì)胞為主的多種炎癥細(xì)胞。中性粒細(xì)胞黏附在受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面,進(jìn)一步向間質(zhì)和肺泡腔移行,釋放大量促炎介質(zhì),如炎癥性細(xì)胞因子、過(guò)氧化物、白三烯、蛋白酶、血小板活化因子等,參與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的肺損傷。除炎癥細(xì)胞外,肺泡上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞也能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,從而加劇炎癥反應(yīng)過(guò)程。凝血和纖溶紊亂也參與ARDS的病程,ARDS早期促凝機(jī)制增強(qiáng),而纖溶過(guò)程受到抑制,引起廣泛血栓形成和纖維蛋白的大量沉積,導(dǎo)致血管堵塞以及微循環(huán)結(jié)構(gòu)受損。ARDS在病理學(xué)上可見彌漫性肺損傷,透明膜形成及I型肺泡上皮或內(nèi)皮細(xì)胞壞死、水腫,II型肺泡上皮細(xì)胞增生和間質(zhì)纖維化等表現(xiàn)。一般認(rèn)為,ALI/ARDS具有以下臨床特征①急性起病,在直接或間接肺損傷后12-48h內(nèi)發(fā)??;②常規(guī)吸氧后低氧血癥難以糾正;③肺部體征無(wú)特異性,急性期雙肺可聞及濕啰音,或呼吸音減低;④早期病變以間質(zhì)性為主,胸部X線片常無(wú)明顯改變。病情進(jìn)展后,可出現(xiàn)肺內(nèi)實(shí)變,表現(xiàn)為雙肺野普遍密度增高,透亮度減低,肺紋理增多、增粗,可見散在斑片狀密度增高陰影,即彌漫性肺浸潤(rùn)影;⑤無(wú)心功能不全證據(jù)。目前ALI/ARDS診斷是沿用1994年歐美聯(lián)席會(huì)議提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)①急性起?。虎谘鹾现笖?shù)(Pa02/Fi02)^200mmHg;③正位X線胸片顯示雙肺均有斑片狀陰影;④肺動(dòng)脈嵌頓壓<18mmHg,或無(wú)左心房壓力增高的臨床證據(jù)。如Pa02/Fi02(300mmHg且滿足上述其它標(biāo)準(zhǔn),則診斷為ALI。ALI/ARDS在特種醫(yī)學(xué),軍事醫(yī)學(xué),甚至運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)也占有重要地位。尤其是高原性肺部損傷,也可以是航空、航天、航海、潛水、特殊地理氣候(如極地、冷環(huán)境、熱環(huán)境等)致肺部損傷。同時(shí)包括核輻射、化學(xué)中毒、生物危害、爆炸與投射物及其他(如激光、振動(dòng)、電磁輻射、聲損傷等)的肺部損傷,此外還包括運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、宇宙保障、特殊作業(yè)、人獸接觸、災(zāi)難意外等致肺部損傷。高原性肺水腫(highaltitudepulmonaryedema,HAPE)作為一種較特殊的ALI/ARDS。通常發(fā)生在快速進(jìn)入海拔超過(guò)3000米地區(qū)的健康人群,表現(xiàn)為缺氧和肺內(nèi)出現(xiàn)高蛋白性漏出液的一種威脅生命的疾病。HAPE發(fā)病率為2%_5%,但有文獻(xiàn)報(bào)道約75%的正常人群進(jìn)入高原后可出現(xiàn)亞臨床表現(xiàn),患者有干咳,胸痛和呼吸困難等現(xiàn)象,提示可能已經(jīng)存在血管外肺水增加[2]。我國(guó)青藏高原地區(qū)尤其是西藏平均海拔4000米以上,占全國(guó)面積的1/6,是HAPE的高發(fā)區(qū)。近年來(lái)西部開發(fā),赴西藏旅游人數(shù)急劇增加,HAPE發(fā)病率較前有明顯升高趨勢(shì)。HAPE的發(fā)生與高原低氧合并運(yùn)動(dòng)密切相關(guān),其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為低氧可使肺血管收縮產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓,而運(yùn)動(dòng)可加重肺動(dòng)脈高壓的形成。肺部血管血流動(dòng)力學(xué)異常,部分微血管壓力增加,導(dǎo)致血漿向血管外漏出,然而血管收縮使血液逆流至毛細(xì)血管并不能完全解釋HAPE的發(fā)病。1995年,West等通過(guò)超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺毛細(xì)血管內(nèi)皮層或整個(gè)氣血屏障的斷裂,紅細(xì)胞和水腫液進(jìn)入肺泡間質(zhì)和肺泡腔,為毛細(xì)血管應(yīng)激衰竭在HAPE發(fā)病中的作用提供了證據(jù)。我們最近發(fā)表在歐洲呼吸病雜志上的研究表明[5],在模擬海拔4700米,給予動(dòng)物持續(xù)運(yùn)動(dòng),病理表現(xiàn)為肺間質(zhì)增寬(間質(zhì)性肺水腫),及紅細(xì)胞漏出伴肺泡性肺水腫。電鏡下不僅毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷,而且肺泡上皮細(xì)胞的腫脹和斷裂更顯著,推測(cè)肺泡-毛細(xì)血管膜應(yīng)激衰竭(alveolocapillarybarrierstressfailure)在HAPE的發(fā)病中有重要作用。涉及的機(jī)制可能包括細(xì)胞骨架塌陷,肺內(nèi)液體清除障礙,氧自由基破壞和肺干/祖細(xì)胞失活等。針對(duì)上述機(jī)制的理想治療方案應(yīng)包括保護(hù)上皮和內(nèi)皮屏障完整,維持細(xì)胞骨架和細(xì)胞間連接穩(wěn)態(tài),促進(jìn)肺水清除,對(duì)抗氧化應(yīng)激,調(diào)節(jié)肺干/祖細(xì)胞端粒酶表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞遷移修復(fù)肺損傷,減少細(xì)胞調(diào)亡,從而降低或避免肺泡_毛細(xì)血管應(yīng)激衰竭。單一改善某一方面的功能可能不足以逆轉(zhuǎn)HAPE的病理生理過(guò)程,多途徑多環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù),相互之間通過(guò)累加或協(xié)同效應(yīng),也許可以放大治療的效果。迄今國(guó)際上尚缺乏對(duì)HAPE的有效預(yù)防藥物,一些已用于臨床的藥物,如硝苯地平通過(guò)擴(kuò)張外周血管降低肺動(dòng)脈壓;糖皮質(zhì)激素減少炎癥因子的浸潤(rùn);β-受體激動(dòng)劑上調(diào)ENaC來(lái)促進(jìn)肺水吸收,它們不僅副作用大,且效用單一。目前尚沒有一種藥物做到多環(huán)節(jié)干預(yù)HAPE疾病,新近發(fā)現(xiàn)的上皮特異性絲裂原一角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocytegrowthfactor,KGF)-2是纖維生長(zhǎng)因子(FGF)家族中的一員,又名FGF10。人的KGF-2由208個(gè)氨基酸組成,N端是由39個(gè)疏水氨基酸組成的信號(hào)肽序列。用反轉(zhuǎn)錄的方法對(duì)來(lái)源于成年人肺組織的KGF-2進(jìn)行分析,結(jié)果顯示人的KGF-2的mRNA長(zhǎng)267bp,與從前報(bào)道的KGF-I有57%的同源序列,其起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAG。KGF-2由成纖維細(xì)胞和其它間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞分泌,與纖維生長(zhǎng)因子受體(FGFR)2-IIIb和FGFRl-IIIb有高親和力。KGF-2通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的KGF-2受體發(fā)揮生物學(xué)作用。KGF-2以間質(zhì)-上皮相互作用的旁分泌方式有效地促進(jìn)各種來(lái)源上皮細(xì)胞的增殖、移行和分化。上海新生源醫(yī)藥研究有限公司根據(jù)人KGF-2天然氨基酸序列及其cDNA序列,按密碼子偏向性進(jìn)行密碼子優(yōu)化,合成KGF-2基因的全序列,選用大腸桿菌載體pET30a(+),構(gòu)建質(zhì)粒pET30a(+)-KGF-2,表達(dá)了重組人KGF-2(RecombinanthumanKGF-2,rhKGF-2)。KGF-2的藥理為利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的KGF-2,對(duì)來(lái)源于中胚層和外胚層的細(xì)胞(如上皮細(xì)胞,真皮細(xì)胞,成纖維細(xì)胞,血管內(nèi)皮細(xì)胞等)具有促進(jìn)修復(fù)和再生的作用。研究表明rhKGF-2對(duì)能促進(jìn)動(dòng)物皮膚切割傷、角膜堿燒傷、缺血性創(chuàng)傷的愈合,并且有抑制疤痕組織形成和促進(jìn)人慢性靜脈潰瘍愈合(PabloAetal.JSurgRes.1999,81(2)238-242;Yu-pingXiaetal,JPathol.1999,188(4)431-438;RobsonMCetal.WoundRepairRegen.2000,9(5)=347-352.)。KGF-2的藥效為10_6g/mlKGF-2對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用,特別是在72-96小時(shí);對(duì)大鼠深I(lǐng)I度燙傷型傷口每天給予KGF-25-20ug/3cm2傷口1次,連續(xù)4天,之后隔天給藥一次,連續(xù)3次,可加速傷口愈合及質(zhì)量,能促進(jìn)表皮細(xì)胞移行。KGF-2的毒理在急性實(shí)驗(yàn)中,大鼠單次皮下注射KGF-2800mg/kg,觀察14天,結(jié)果未見動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)和死亡,其主要臟器未見明顯病變。長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)中,大鼠局部給予KGF-2,觀察8周,結(jié)果未見主要臟器明顯病變。KGF-2的主要功能是促進(jìn)表細(xì)胞的增生和發(fā)育,在創(chuàng)作愈合方面有重要作用。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,KGF-2和KGF(FGF7)的功能和作用機(jī)制存在重疊和互補(bǔ)。它通過(guò)促進(jìn)上皮增生,修復(fù)損傷,調(diào)節(jié)細(xì)胞間質(zhì)和保護(hù)內(nèi)皮屏障,有效的預(yù)防內(nèi)毒素,機(jī)械通氣和肺移植等引起的損傷。需要說(shuō)明的是,首選KGF-2而不是KGF是因?yàn)镵GF-2目前已經(jīng)用于臨床試驗(yàn)治療燒傷、自體移植引起的粘膜炎和角膜損傷等疾病。如美國(guó)人類基因組公司(HumanGenomeSciences,HGSI)開發(fā)的R印ifemin(KGF-2)針對(duì)難治性上皮損傷,腫瘤放化療后黏膜炎的治療已進(jìn)入了III期臨床試驗(yàn),提示KGF-2的相對(duì)安全性和穩(wěn)定性。但目前尚未見KGF-2用于肺損傷的體內(nèi)研究,本發(fā)明正填補(bǔ)了這項(xiàng)空白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2的新用途,即藥物使用方面的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明提供的技術(shù)方案是角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)在制備防治肺損傷的藥物中的應(yīng)用。所述重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF_2)具有生物活性,對(duì)來(lái)源于內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的細(xì)胞,如上皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞,干細(xì)胞等有調(diào)節(jié)、修復(fù)和再生作用。所述肺損傷可以是任何因素造成的肺損傷和/或肺水腫,包括發(fā)生在任何年齡段,如成人、兒童等的亞臨床、輕度、中度、重度和危及生命的肺部損傷,急性、亞急性和慢性的肺部損傷,特種醫(yī)學(xué)疾病致肺部損傷,如航空、航天、航海、潛水等,特殊地理氣候致肺部損傷,如極地、冷環(huán)境、熱環(huán)境等,軍事醫(yī)學(xué)疾病致肺部損傷,如核輻射、爆炸與投射物及其他(激光、振動(dòng)、電磁輻射、聲損傷等)和宇宙保障等,運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)疾病致肺部損傷,如跑步、游泳等,化學(xué)中毒、生物危害、人獸接觸、特殊作業(yè)、災(zāi)難意外等致肺部損傷,誤吸(如腐蝕性液體或氣體)、溺水、感染、(如細(xì)菌、病毒、真菌、分支桿菌、立克次體、卡氏肺孢子蟲等)、炎癥、藥物和化學(xué)品致肺部損傷,創(chuàng)傷,敗血癥、臟器出血、反復(fù)輸血、心肺分流、血栓栓塞、全身各器官病變致肺部損傷,彌漫性血管內(nèi)凝血、血栓性血小板減少性紫癜、溶血尿毒綜合癥、熱射病和其他血管炎癥性綜合癥致肺部損傷,代謝性疾病、酸堿平衡紊亂、尿毒癥、臟器移植、腫瘤及并發(fā)癥致肺部損傷,尤其是肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征,高原性肺水腫,低壓低氧引起的肺損傷、軍隊(duì)的急行軍或軍事演習(xí)引起的肺損傷、或馬拉松長(zhǎng)跑引起的肺損傷,高氧致肺損傷,化療藥物引起的肺損傷,肺移植后原發(fā)性肺功能不全。所述KGF-2可以單獨(dú)使用或與KGF-2藥理和療效不沖突的藥用載體和藥物如β受體激動(dòng)劑、利尿劑等一起使用??梢灾瞥蓢婌F劑、滴入劑、注射劑、片劑、膠囊、口服液或涂抹藥等可使用的制劑。優(yōu)選制成滴入劑、噴霧劑氣道內(nèi)使用,或制成注射劑靜脈注射。采用定量噴霧式吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、噴霧器或負(fù)載特殊裝置的噴霧器等進(jìn)行霧化。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是KGF_2能通過(guò)保持肺泡表面活性物質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡,促進(jìn)細(xì)胞增生和遷移修復(fù)肺損傷,它在保護(hù)氣血屏障完整,維持細(xì)胞骨架和細(xì)胞間連接穩(wěn)態(tài),促進(jìn)肺水清除,降低或避免肺泡_毛細(xì)血管應(yīng)激衰竭中有重要作用。圖1為Kaplan-Meier生存曲線圖;圖2為肺濕干比用于反映整體肺水腫的嚴(yán)重程度圖;圖3為支氣管肺泡盥洗液中總蛋白濃度反映肺泡_毛細(xì)血管通透性變化圖;圖4為支氣管肺泡盥洗液中白蛋白濃度反映肺泡_毛細(xì)血管通透性變化圖;圖5為Evans藍(lán)法檢測(cè)肺泡-毛細(xì)血管通透性圖;圖6為大鼠的病理HE染色(X400倍)圖;圖7為肺水清除率能反映肺泡上皮對(duì)肺水的清除能力圖;圖8為免疫組化對(duì)細(xì)胞間連接進(jìn)行定位并了解蛋白表達(dá)情況(X400倍)圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1高原性肺水腫模型的建立基于在歐洲呼吸病雜志上發(fā)表的方法建立高原性肺水腫動(dòng)物模型(EurRespirJ2010,doi10.1183/09031936.00001709),在模擬海拔4700米,給予大鼠運(yùn)動(dòng),模型組肺泡-動(dòng)脈氧分壓差明顯低于對(duì)照組。在肺泡盥洗液中,模型組的蛋白含量和細(xì)胞計(jì)數(shù)皆高于對(duì)照組,但一些前炎癥因子則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣,模型組的肺濕干比重也顯著高于對(duì)照組。模型組的肺組織形態(tài)學(xué)改變有肺間質(zhì)增厚,肺泡腔變小,肺泡內(nèi)有液體滲出伴紅細(xì)胞漏出。研究表明已成功建立高原性肺水腫大鼠模型。同時(shí)該研究提示,電鏡下模型組不僅毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷,而且肺泡上皮細(xì)胞的腫脹和斷裂更顯著,所以肺泡_毛細(xì)血管膜應(yīng)激衰竭在HAPE的發(fā)病中有重要作用。實(shí)施例2KGF-2可增加高原性肺水腫動(dòng)物的生存率由上海新生源醫(yī)藥研究有限公司提供的人重組KGF-2凍干粉,加入生理鹽水配成5mg/kg的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。事先給予高原性肺水腫大鼠模型生理鹽水,布地耐德,沙美特羅,KGF-2,KGF_2+沙美特羅,觀察這些藥物對(duì)HAPE的預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)分組1.正常氣壓組(對(duì)照組)2.低壓氧運(yùn)動(dòng)組(HAPE模型組)模擬高原低氧狀態(tài)下,給予動(dòng)物持續(xù)運(yùn)動(dòng);3.HAPE模型+生理鹽水造模前給予無(wú)菌生理鹽水;4.HAPE模型+布地耐德造模前霧化吸入布地耐德,以后每12小時(shí)一次;5.HAPE模型+沙美特羅造模前霧化吸入沙美特羅,以后每12小時(shí)一次;6.HAPE模型+KGF-2造模前72小時(shí)氣道內(nèi)滴入KGF-2(5mg/kg);7.HAPE模型+KGF-2+沙美特羅造模前72小時(shí)氣道內(nèi)滴入KGF-2(5mg/kg)和造模前霧化吸入沙美特羅,以后每12小時(shí)一次。如圖1所示,為Kaplan-Meier生存曲線圖,與模型組比較,預(yù)先治療KGF-2后能顯著延長(zhǎng)動(dòng)物存活時(shí)間(P<0.05),(η=6只/組)。實(shí)施例3KGF-2在高原性肺水腫減少肺水腫形成的作用由上海新生源醫(yī)藥研究有限公司提供的人重組KGF-2凍干粉,加入生理鹽水配成5mg/kg的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。方法在模擬海拔4700米的低壓低氧環(huán)境中暴露48小時(shí)后,獲取動(dòng)物組織。打開胸腔,取出肺并置于事先稱取重量的鋁鉬紙中,再次稱量,計(jì)算肺濕重。然后在60°C烤箱中充分烘烤72小時(shí)至恒重進(jìn)行稱量,計(jì)算肺干重。肺濕干重比值(lungwet-to-dryweightratio)為肺濕重和肺干重的比值。肺濕干比用于反映整體肺水腫的嚴(yán)重程度。如圖2所示,為肺濕干比用于反映整體肺水腫的嚴(yán)重程度圖;與對(duì)照組比較,模型組肺濕干重比顯著增高(P<0.01)。而預(yù)先治療KGF-2后能降低高原性肺水腫引起的肺水腫。KGF-2對(duì)HAPE肺濕干重比的作用如下組別劑量數(shù)量肺濕干重比對(duì)照組----------62.73±0.24邶HAPE模型組----------65.18±0.11**HAPE+生理鹽水Iml65.19±0.2**HAPE+布地耐德2.5mg/ml64.22±0.2**ftHAPE+沙美特羅5mg/ml63.84±0.24*ttttHAPE+KGF-25mk/kg62.87±0.26湘&&HAPE+KGF-2+沙美特羅5mg/kg,5mg/ml62.75±0.28IW&&注數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示,*p<0.05,<0.Olvs對(duì)照組;#p<0.05,##p<0.Olvs模型組和生理鹽水組;&p<0.05,&&p<0.Olvs布地耐德組;§ρ<0.05,§§ρ<0.Olvs沙美特羅組。實(shí)施例4KGF-2減少高原性肺水腫支氣管肺泡盥洗液中蛋白漏出由上海新生源醫(yī)藥研究有限公司提供的人重組KGF-2凍干粉,加入生理鹽水配成5mg/kg的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。方法在模擬海拔4700米的低壓低氧環(huán)境中暴露48小時(shí)后,麻醉動(dòng)物。分離大鼠氣管,切開氣管并置管,用絲線固定,然后連接Iml注射器。向肺內(nèi)注入盥洗液lml。反復(fù)抽吸后,回收盥洗液。蛋白濃度可用酸滴定法和/或免疫比濁法檢測(cè)。支氣管肺泡盥洗液中蛋白濃度可反映肺泡-毛細(xì)血管通透性變化。如圖3所示,為支氣管肺泡盥洗液中總蛋白濃度反映肺泡-毛細(xì)血管通透性變化圖,如圖4所示,為支氣管肺泡盥洗液中白蛋白濃度反映肺泡-毛細(xì)血管通透性變化圖,與對(duì)照組比較,模型組總蛋白和白蛋白濃度顯著增高(P<0.01),而預(yù)先治療KGF-2后能降低蛋白水平(P<0.01)。KGF-2減少高原性肺水腫支氣管肺泡盥洗液中總蛋白漏出如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示,*p<0.05,<0.Olvs對(duì)照組;#p<0.05,##p<0.Olvs模型組和生理鹽水組;&p<0.05,&&p<0.Olvs布地耐德組;§ρ<0.05,§§ρ<0.Olvssalmeterol組。KGF-2減少高原性肺水腫支氣管肺泡盥洗液中白蛋白漏出如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示,*ρ<0.05,<0.Olvs對(duì)照組;#ρ<0.05,##ρ<0.Olvs模型組和生理鹽水組;&ρ<0.05,&&ρ<0.Olvs布地耐德組;§ρ<0.05,§§ρ<0.Olvs沙美特羅組。實(shí)施例5KGF-2減少高原性肺水腫毛細(xì)血管通透性。由上海新生源醫(yī)藥研究有限公司提供的人重組KGF-2凍干粉,加入生理鹽水配成5mg/kg的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。方法在模擬海拔4700米的低壓低氧環(huán)境中暴露48小時(shí)后,麻醉動(dòng)物。尾靜脈注射伊文氏藍(lán)(Evansbluedye,EBD)(30mg/kg),30分鐘后,處死動(dòng)物,打開胸腔。除去肺循環(huán)中殘余血液。切除肺,將肺組織進(jìn)行勻漿,然后將勻漿和甲酰胺混合并置于37°C24小時(shí)。離心5,OOOXg30分鐘,收集上清。用分光光度計(jì)(620nm)檢測(cè)上清液吸光值。通過(guò)建立EBD標(biāo)準(zhǔn)曲線,可計(jì)算出每克肺組織中EBD含量。EBD法可作為檢測(cè)肺泡-毛細(xì)血管通透性的指標(biāo)。如圖5所示,為EBD法檢測(cè)肺泡-毛細(xì)血管通透性圖,與對(duì)照組比較,模型組EBD含量顯著增高(P<0.01),而預(yù)先治療KGF-2后能降低肺泡-毛細(xì)血管通透性(P<0.05)。KGF-2減少高原性肺水腫毛細(xì)血管通透性如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示,*p<0.05,<0.Olvs對(duì)照組;#p<0.05,##p<0.Olvs模型組和生理鹽水組;&p<0.05,&&p<0.Olvs布地耐德組;§ρ<0.05,§§ρ<0.Olvs沙美特羅組。實(shí)施例6KGF-2保護(hù)高原性肺水腫肺泡_毛細(xì)血管屏障的作用由上海新生源醫(yī)藥研究有限公司提供的人重組KGF-2凍干粉,加入生理鹽水配成5mg/kg的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。方法在模擬海拔4700米的低壓低氧環(huán)境中暴露48小時(shí)后,獲取動(dòng)物組織。肺臟用10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片。使用常規(guī)方法進(jìn)行HE染色。如圖6所示,為大鼠的病理HE染色(X400倍)圖。與對(duì)照組比較,光鏡下模型組肺間質(zhì)增厚,肺泡腔變小,肺泡內(nèi)有液體滲出伴紅細(xì)胞漏出,而預(yù)先治療KGF-2后肺損傷明顯改善。說(shuō)明KGF-2對(duì)高原性肺水腫肺泡_毛細(xì)血管屏障有保護(hù)作用。實(shí)施例7KGF-2促進(jìn)高原性肺水腫的肺水清除由上海新生源醫(yī)藥研究有限公司提供的人重組KGF-2凍干粉,加入生理鹽水配成5mg/kg的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。按Tibayan等(AmJRespirCritCareMed1997;156:438_444)的方法。動(dòng)物麻醉后,以4ml/kg1251-albumin滴入氣道遠(yuǎn)端,呼吸機(jī)輔助通氣,1小時(shí)后吸出肺內(nèi)液體,與對(duì)照樣品進(jìn)行比較。通過(guò)肺泡內(nèi)放射性核素強(qiáng)度的變化,測(cè)定肺水清除率。計(jì)算公式為AFC(%)=[CPM(i)/g(i)-CPM(f)/g(f)]/CPM(i)/g(i)XlOO其中CPM(i)是初始125I-albumin放射性,CPM(f)是終末1251-albumin放射性,g(i)是初始放射性物質(zhì)的重量,和g(f)是終末放射性物質(zhì)的重量。肺水清除率能反映肺泡上皮對(duì)肺水的清除能力。如圖7所示,為肺水清除率能反映肺泡上皮對(duì)肺水的清除能力圖,與對(duì)照組21.53士0.99%/小時(shí)比較,模型組的肺水清除率明顯降低(P<0.01),而預(yù)先治療KGF-2后能顯著提高肺水清除率,達(dá)50%(P<0.01)。KGF-2促進(jìn)高原性肺水腫的肺水清除如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示,*p<0.05,<0.Olvs對(duì)照組;#p<0.05,##p<0.Olvs模型組和生理鹽水組;&p<0.05,&&p<0.Olvs布地耐德組;§ρ<0.05,§§ρ<0.Olvs沙美特羅組。實(shí)施例8KGF-2維持高原性肺水腫細(xì)胞間連接的穩(wěn)定由上海新生源醫(yī)藥研究有限公司提供的人重組KGF-2凍干粉,加入生理鹽水配成5mg/kg的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。使用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞間連接的變化,操作過(guò)程如下脫蠟和水化脫蠟60°C恒溫箱中烘烤30分鐘;二甲苯I,II,III各浸泡10分鐘;95%乙醇中浸泡5分鐘,2次;流水沖洗。3%H2O2封閉20分鐘??乖迯?fù)在微波爐里加熱0.OlM枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至沸騰后將組織切片放入,斷電,間隔510分鐘,反復(fù)1-2次。PBS洗3次各5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。滴加I抗,室溫靜置1小時(shí)或者4°C過(guò)夜或者37°C1小時(shí);PBS洗3次各5分鐘;滴加II抗,室溫靜置,或37°C1小時(shí);PBS洗3次各5分鐘;DAB顯色510分鐘,在顯微鏡下掌握染色程度;蘇木精復(fù)染30秒,鹽酸酒精分化;自來(lái)水沖洗1015分鐘;脫水;透明;封片;鏡檢。免疫組化對(duì)細(xì)胞間連接進(jìn)行定位并了解蛋白表達(dá)情況。如圖8所示,為免疫組化對(duì)細(xì)胞間連接進(jìn)行定位并了解蛋白表達(dá)情況(X400倍)圖,0CClUdin,Z0-l蛋白定位于細(xì)胞間。與對(duì)照組比較,模型組0CClUdin,Z0-l蛋白表達(dá)含量顯著降低,而預(yù)先治療KGF-2后能上調(diào)表達(dá)。實(shí)施例9KGF-2對(duì)低壓低氧引起的肺損傷、軍隊(duì)的急行軍或軍事演習(xí)引起的肺損傷或馬拉松長(zhǎng)跑引起的肺損傷的作用由上海新生源醫(yī)藥研究有限公司提供的人重組KGF-2凍干粉,加入生理鹽水配成5mg/kg的使用劑量,裝入微量噴霧注射器。在模擬海拔4700米的低壓低氧下,給予大鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)48小時(shí),運(yùn)動(dòng)速度為12米/分鐘(約20公里)。本研究的目的是了解重組人KGF-2對(duì)低壓低氧引起的肺損傷、軍隊(duì)的急行軍或軍事演習(xí)引起的肺損傷或馬拉松長(zhǎng)跑引起的肺損傷的療效。氣道內(nèi)給KGF-2噴霧劑KGF-25mg/kg后,72小時(shí)后暴露在模擬海拔4700米的低壓低氧環(huán)境中48小時(shí)。支氣管肺泡盥洗液中模型組的蛋白含量和紅細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01),白細(xì)胞數(shù)也有增高(P<0.05),但以單核細(xì)胞為主。而KGF-2預(yù)先治療組能顯著降低支氣管肺泡盥洗液中蛋白含量和紅細(xì)胞數(shù)。在大體標(biāo)本水平,使用KGF-2治療組的肺臟基本正常,胸膜上有少許散在的點(diǎn)狀出血。而模型組早在18小時(shí)后,陸續(xù)出現(xiàn)死亡,肺臟表面可見大片出血灶。在組織病理水平,低壓低氧環(huán)境中48小時(shí)后未治療組動(dòng)物的肺組織有大片的出血和間質(zhì)性水腫,肺泡內(nèi)可見有紅細(xì)胞和高蛋白滲出液。而使用KGF-2組,肺泡內(nèi)無(wú)滲出液和肺組織有較少的出血。實(shí)施例10KGF-2對(duì)高氧致肺損傷的作用。使用HumanGenomeSciences開發(fā)的R印ifemin,加入生理鹽水配成lmg/kg和5mg/kg,的使用劑量,靜脈滴入。靜脈滴入KGF-2后,暴露于氧濃度>98%的環(huán)境中120小時(shí)。在大體標(biāo)本水平,使用KGF-2治療組的肺臟基本正常,胸膜上有少許散在的點(diǎn)狀出血。而未治療組早在55-80小時(shí)高氧暴露后就有彌漫的廣泛出血。在組織病理水平,高氧暴露120小時(shí)后未治療組動(dòng)物的肺組織有大片的出血和間質(zhì)性水腫,肺泡內(nèi)可見有紅細(xì)胞,炎癥細(xì)胞和蛋白滲出液。而使用KGF-2組,肺泡內(nèi)無(wú)滲出液和肺組織有較少的出血。本實(shí)驗(yàn)中使用的KGF-2的劑量是lmg/kg和5mg/kg,都能減少高氧引起的動(dòng)物死亡。實(shí)施例11KGF-2對(duì)肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的作用使用HumanGenomeSciences開發(fā)的R印ifemin,加入生理鹽水配成5mg/kg,的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。α-萘硫脲(α-naphthylthiourea)可引起急性滲透性肺水腫,而離體肺臟灌注180分鐘能用于評(píng)估通透性。濕/干比和支氣管肺泡盥洗液中的蛋白濃度來(lái)驗(yàn)證。氣道內(nèi)滴入重組人KGF-248小時(shí)后,使用α-萘硫脲致肺水腫。對(duì)照組為未治療組和單純使用KGF-2組,使用組織病理學(xué)檢測(cè)變化。α-萘硫脲引起急性滲透性肺水腫通過(guò)離體肺臟灌注180分鐘評(píng)估。預(yù)防性運(yùn)用KGF-2能顯著減少通透性,和未治療組和單純使用KGF-2組比較無(wú)顯著差異。病理學(xué)顯示,預(yù)防性運(yùn)用KGF-2組有大量肺泡II型細(xì)胞增生,且顯著減少由α-萘硫脲引起的肺水腫。實(shí)施例12KGF-2減少化療藥物引起的肺纖維化使用HumanGenomeSciences開發(fā)的R印ifemin,加入生理鹽水配成5mg/kg的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。使用體重約225g左右的雄性Lewis大鼠。通過(guò)氣道或靜脈給予5mg/kg的dN29hKGF-2或空載體,48或72小時(shí)后在氣道內(nèi)滴入2.5U的博萊霉素。連續(xù)15天觀察大鼠的體重和肺功能變化。并用福爾馬林固定肺組織,石蠟包埋,切片和染色了解肺臟組織形態(tài)變化。博萊霉素使用后,接受生理鹽水治療的大鼠體重下降42%,而使用KGF-2治療的大鼠則體重增加29%。其中一只接受生理鹽水治療的大鼠死亡,考慮為使用博萊霉素所致。在肺功能檢測(cè)中,無(wú)論是呼吸頻率,還是潮氣量,生理鹽水組和KGF-2組皆有顯著差異。接受生理鹽水治療的大鼠平均呼吸頻率286次/分鐘,而使用KGF-2治療的大鼠是247次/分鐘。未接受治療的對(duì)照組是216次/分鐘。KGF-2組和對(duì)照組比較有顯著差異,ρ<0.05。在組織學(xué)上,生理鹽水組的肺組織是變形的,鏡下可見炎癥反應(yīng)和纖維化。而KGF-2組只有一些局灶的輕微炎癥,同時(shí)KGF-2組與未接受博萊霉素的對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。實(shí)施例13KGF-2對(duì)肺移植后原發(fā)性肺功能不全的保護(hù)作用使用HumanGenomeSciences開發(fā)的palifermin,加入生理鹽水配成5mg/kg,的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。使用雄性LEW大鼠,第1,2天,氣道內(nèi)滴入AN23KGF5mg/kg,第4天行肺移植術(shù),以生理鹽水為空載體組。對(duì)支氣管肺泡盥洗液中,總蛋白,總磷脂,肺泡表面活性物質(zhì)B和C進(jìn)行檢測(cè)??蛰d體移植肺組與對(duì)照組比較,支氣管肺泡盥洗液中總蛋白含量有顯著升高(P<0.01),而KGF預(yù)先治療后可減少總蛋白含量(P<0.01)。表面活性物質(zhì)B/總蛋白在空載體移植肺組和KGF預(yù)先治療組無(wú)顯著差異,而表面活性物質(zhì)C盡管在空載體移植肺組和KGF預(yù)先治療移植肺組也無(wú)顯著差異,但表面活性物質(zhì)C/總蛋白在空載體移植肺組有降低(P<0.05),KGF預(yù)先治療移植肺組與未手術(shù)組比較變化不大,而且明顯高于空載體移植肺組(P<0.01)。使用KGF-2通過(guò)增加肺泡表面活性物質(zhì)穩(wěn)態(tài),減少移植肺損傷中肺水腫的形成。實(shí)施例14KGF-2制成滴注劑使用HumanGenomeSciences開發(fā)的R印ifemin,加入生理鹽水配成5mg/kg,的使用劑量,氣道內(nèi)滴入。氣道內(nèi)進(jìn)給KGF-2滴注劑能夠促進(jìn)臟細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)如下使用體重約220_270g左右的雄性Lewis大鼠(每組5只)。在實(shí)驗(yàn)第1天和第2天通過(guò)氣道給予KGF-2滴注劑或安慰劑0.6ml。第三天,腹腔內(nèi)注射100mg/kg的BrdU,2小時(shí)后用CO2麻醉,獲取組織。肺臟用10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片。觀察BrdU摻合到復(fù)制細(xì)胞的情況,用抗-BrdU單克隆抗體通過(guò)免疫組化ABC法檢測(cè),并用蘇木素復(fù)染。切片分別由兩人在雙盲的情況下判讀。鏡下放大20倍,隨機(jī)選取10視野記錄細(xì)胞增殖數(shù)。結(jié)果為每個(gè)視野下BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)士SEM表示,統(tǒng)計(jì)使用非配對(duì)t-test,當(dāng)ρ<0.05認(rèn)為有顯著差異。氣道內(nèi)滴注KGF-2滴注劑能促進(jìn)肺臟上皮細(xì)胞增生,使用KGF-2治療后能顯著增加BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。在lmg/kg時(shí),每個(gè)視野下平均23.4個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(ρ=0.0002),在5mg/kg時(shí),每個(gè)視野下平均10.3個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(ρ=0.0003),而對(duì)照組為每個(gè)視野下平均1.58個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)施例15KGF-2制成注射劑使用HumanGenomeSciences開發(fā)的R印ifemin,加入生理鹽水配成5mg/kg,的使用劑量,靜脈滴入。靜脈使用KGF-2注射劑能夠促進(jìn)臟細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)如下使用體重約200g左右Sprague-Dawley的雄性大鼠(每組5只)。異氟烷麻醉后,通過(guò)尾靜脈給予KGF-2注射劑或安慰劑0.6ml。在第6,24,48小時(shí)靜脈再給予腹腔內(nèi)注射100mg/kg的BrdU,2小時(shí)后用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉,獲取組織。使用生理鹽水10_15ml對(duì)右心室進(jìn)行灌注,并從左心房流出。肺臟用10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片。觀察BrdU摻合到復(fù)制細(xì)胞的情況,用抗-BrdU單克隆抗體通過(guò)免疫組化檢測(cè)。鏡下放大20倍,隨機(jī)選取10視野記錄細(xì)胞增殖數(shù)。切片分別由兩人在雙盲的情況下判讀。結(jié)果為每個(gè)視野下BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)使用非配對(duì)t-test,數(shù)據(jù)以均數(shù)士SEM表示,當(dāng)ρ<0.05認(rèn)為有顯著差異。對(duì)照組為每個(gè)視野下平均36個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。而接受KGF_21mg/kg治療24小時(shí)后每個(gè)視野下平均97個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(ρ=0.0118)。接受KGF_25mg/kg治療的每個(gè)視野下平均197個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(ρ<0.0001),使用KGF-2治療組與對(duì)照組比較有顯著差異。但在6小時(shí)和48小時(shí)組,使用KGF-2治療組與對(duì)照組比較BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)沒有顯著差異。結(jié)論,靜脈使用KGF-2可增加BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),使用KGF_25mg/kg組與KGF_21mg/kg,對(duì)照組三組間都有顯著差異,使用KGF-21mg/kg組與對(duì)照組都有顯著差異,但在6小時(shí)和48小時(shí)組,KGF-2治療組與對(duì)照組比較沒有顯著差異。實(shí)施例16KGF-2制成噴霧劑使用HumanGenomeSciences開發(fā)的R印ifemin,加入生理鹽水配成5mg/kg,的使用劑量,裝入微量噴霧注射器。氣道內(nèi)給KGF-2噴霧劑能夠促進(jìn)肺臟細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)如下使用體重約250_250g左右的雄性Lewis或SD大鼠(每組5只)。氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉后,使用噴霧器給動(dòng)物霧化吸入,其中74%的霧化顆粒<5μm,24%的霧化顆粒<2μm,持續(xù)45-60分鐘。2天后,腹腔內(nèi)注射100mg/kg的BrdU,2小時(shí)后用C02麻醉,獲取組織。使用生理鹽水10-15ml對(duì)右心室進(jìn)行灌注,并從左心房流出。肺臟用10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片。觀察BrdU摻合到復(fù)制細(xì)胞的情況,用抗-BrdU單克隆抗體通過(guò)免疫組化檢測(cè)。鏡下放大20倍,隨機(jī)選取10視野記錄細(xì)胞增殖數(shù)。切片分別由兩人在雙盲的情況下判讀。結(jié)果為每個(gè)視野下BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)使用非配對(duì)t-test,數(shù)據(jù)以均數(shù)士SEM表示,當(dāng)ρ<0.05認(rèn)為有顯著差異。對(duì)照組為每個(gè)視野下平均9個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。而接受噴霧KGF_2(6mg)治療24小時(shí)后每個(gè)視野下平均20個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(ρ=0.0857)。接受噴霧KGF-2(12mg)治療的每個(gè)視野下平均32個(gè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(ρ=0.001),使用KGF-2治療組與對(duì)照組比較有顯著差異。權(quán)利要求角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2在制備防治肺損傷的藥物中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述肺損傷為肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征。3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述肺損傷為高原性肺水腫。4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述肺損傷為低壓低氧引起的肺損傷、軍隊(duì)的急行軍或軍事演習(xí)引起的肺損傷、或馬拉松長(zhǎng)跑引起的肺損傷。5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述肺損傷為高氧致肺損傷。6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述肺損傷為化療藥物引起的肺損傷。7.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述肺損傷為肺移植后原發(fā)性肺功能不全。8.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述防治肺損傷的藥物的劑型為噴霧劑、滴入劑或注射劑。全文摘要本發(fā)明涉及角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2在制備防治肺損傷的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是單藥或藥物組合方案重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2,用于治療和預(yù)防由任何因素造成的肺損傷/呼吸窘迫綜合征和使用方法,包括特種醫(yī)學(xué),如高原性肺損傷,軍事醫(yī)學(xué),運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和其他疾病致肺損傷/呼吸窘迫綜合征。以上疾病可以是亞臨床、輕度、中度、重度和危及生命的肺損傷。研究發(fā)現(xiàn)KGF-2通過(guò)保持肺泡表面活性物質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡,促進(jìn)細(xì)胞增生和遷移修復(fù)肺損傷,它在保護(hù)氣血屏障完整,維持細(xì)胞骨架和細(xì)胞間連接穩(wěn)態(tài),促進(jìn)肺水清除,降低或避免肺泡-毛細(xì)血管應(yīng)激衰竭中有重要作用。文檔編號(hào)A61P11/00GK101822821SQ201010157909公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年4月27日優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日發(fā)明者佘君,宋元林,白春學(xué)申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院