本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)基，具體涉及一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養(yǎng)基和使用方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

成纖維細胞是構(gòu)成皮膚真皮層的主要細胞，是真皮層產(chǎn)生膠原蛋白、彈性纖維蛋白以及其他ECM(細胞外基質(zhì))的主要細胞，膠原蛋白和彈性蛋白在皮膚組織中的作用就是形成皮膚支架，保持皮膚彈性。吸納水分，使皮膚細膩、光滑、富有彈性。

所以成纖維細胞的正常增殖、分化維系著皮膚正常的結(jié)構(gòu)和生理功能。隨著年齡的增長，皮膚真皮層厚度變薄，真皮層內(nèi)的成纖維細胞數(shù)量減少，從而引發(fā)一系列的皮膚問題：皺紋、沒有彈性、松弛、干枯沒有光澤等。解決這些皮膚問題的根源就是補充皮膚真皮層內(nèi)的成纖維細胞。

目前批準的唯一一款成纖維細胞產(chǎn)品LIVIV，是將皮膚成纖維細胞經(jīng)過分離培養(yǎng)注射到皮膚真皮層內(nèi)，為在成年中改善中度至嚴重鼻唇溝皺紋(微笑線)的外觀。細胞沒有支架，注射之后很容易流失，從而失去效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養(yǎng)基和使用方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺點和不足。本發(fā)明是利用成纖維細胞在培養(yǎng)過程中自身分泌的富含膠原蛋白、彈性纖維蛋白的細胞外基質(zhì)成分為天然支架成分，制備成成纖維細胞膜片，即保證了成纖維細胞的活性，又解決了單純成纖維細胞注射易流失的問題。

本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

作為本發(fā)明的第一方面，一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括：

(2)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：H-DMEM或者DF12；

(2)添加組分：維生素C 50-100μg/ml，

表皮細胞生長因子(EGF)3-20ng/ml，

(3)血清5-15％。

還包括：(4)dispase II(麥約爾CEL078)；

(5)IV型膠原酶(GIBCO,17104-019)；

(6)0.25％胰蛋白酶；

(7)皮膚保存液。

其中，(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為H-DMEM(High Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium)、或者DMEM-F12；

形式：干粉(純水、過濾)、液體；

提供狀態(tài)：無菌

配置方法：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基粉末(例如H-DMEM)，加入無菌超純水一部分，進行先溶解，然后根據(jù)培養(yǎng)基說明書規(guī)定的體積進行定容；

充分溶解后，0.22微米濾膜進行過濾、封裝；

然后按照需求，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入5％-15％的血清。

如果是液體H-DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混勻即可。

pH調(diào)節(jié)：使用pH試紙(或者pH電位計)測試培養(yǎng)基pH值，如不符合規(guī)定，可用10％的HCl或10％NaOH調(diào)節(jié)，直到符合配方要求，一般在pH 7.0-7.5之間。

其中，(2)添加組分按照培養(yǎng)基的終體積，配置。

其中，(3)血清的種類選自動物血清、胎牛血清、人血清，最佳的自體血清(臨床使用)，血清的濃度5-15％；

提供狀態(tài)：無菌、補體滅活

自體血清的制備：

5)血清分離：將血樣進行分離；

6)過濾除菌：將步驟1)得到的樣品0.22微米過濾器進行兩次過濾；

7)血清滅活：將步驟2)得到的樣品56℃水浴滅活熱原至少30min，冰箱冷藏室保存待用；

8)紫外線照射：有時，在步驟3)獲得的樣品在使用或者封裝前要紫外線照射。

(4)dispase II(麥約爾CEL078)配制

用電子天平秤取1g的dispase II粉末，用33ml的0.9％生理鹽水完全溶解，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌；配制成1g/33ml(24U/ml)的母液；母液放置在-20℃凍存；使用時將母液稀釋至1.5-2.4U/ml的工作液。

(5)IV型膠原酶(GIBCO,17104-019)配制

用電子天平秤取1g的IV型膠原酶粉末，用100ml的0.9％生理鹽水完全溶解，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌；配制成1g/100ml(2100U/ml)的母液；母液放置在-20℃凍存；使用時將母液稀釋至30-50U/ml的工作液。

(6)0.25％胰蛋白酶配制

0.25mg的膠原酶溶解到100ml 0.9％生理鹽水中，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌；分裝置于5ml離心管中，放置在-20℃凍存。

(7)皮膚保存液的配制

將醫(yī)用青霉素和鏈霉素配制成100ug/ml，在98ml的0.9％生理鹽水中加入1ml的青霉素和鏈霉素。

作為本發(fā)明的第二方面，一種制備人皮膚成纖維細胞膜片的細胞培養(yǎng)基的使用方法，其特征在于，包括：

1.人皮膚成纖維細胞原代培養(yǎng)

1.1雙眼皮手術(shù)中切除的皮膚組織，放置在皮膚保存液中(生理鹽水+雙抗)運至GMP實驗室，用含青鏈霉素的生理鹽水沖洗3次；

1.2在皮膚組織中加入dispase II，其濃度為30-50U/ml，37℃消化30分鐘，然后在超凈工作臺內(nèi)用眼科剪和眼科鑷將皮膚的表皮和皮下組織小心剝離，用生理鹽水將真皮組織清洗干凈至澄清；

1.3將真皮組織剪碎剪小，用IV型膠原酶，其濃度為600-800U/ml，37℃消化2小時；

1.4用生理鹽水稀釋膠原酶，離心，1000-1500rpm，5分鐘。如此重復洗3次；

1.5基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于100mm培養(yǎng)皿中，放置于5％CO₂，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

2.人皮膚成纖維細胞傳代培養(yǎng)

2.1待細胞融合度達到90％時，用0.25％胰酶在37℃培養(yǎng)箱中消化約3-5min。在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓、細胞間隙增大后，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；

2.2離心，1300rpm，5分鐘；

2.3棄去上清液，基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸沉淀，用吸管吹打細胞，以1∶4比例接種至新的100mm培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)；

2.4待人成纖維細胞培養(yǎng)至4-6代時，用于成纖維細胞膜片制備；

3.成纖維細胞膜片制備

3.1取4-6代的成纖維細胞經(jīng)過0.25％胰酶消化，1000-1500rpm離心；

3.2分別用基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分的完全培養(yǎng)基重懸沉淀，吹打均勻；

3.3按照4*10⁴/cm²接種至培養(yǎng)皿中；

3.4間隔2-4天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基；

3.5待細胞長至第八天時，可見添加完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿底層細胞已形成膜片，膜片的邊緣翹起來，用鑷子可將整張膜片掲起。

而添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿底部無膜片翹起，很難從培養(yǎng)皿底掲下來。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明在成纖維細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加其他組分，使培養(yǎng)的成纖維細胞形成膜片。

附圖說明

圖1為4*10⁴/cm²完全培養(yǎng)液第八天的圖片。

圖2為4*10⁴/cm²基礎(chǔ)培養(yǎng)液第八天的圖片。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。

實施例1

一、培養(yǎng)基配制備

1.基礎(chǔ)培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：H-DMEM(High Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium)、或者DF12；

形式：干粉(純水、過濾)、液體；

提供狀態(tài)：無菌

配置方法：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基粉末(例如DMEM)，加入無菌超純水一部分，進行先溶解，然后根據(jù)培養(yǎng)基說明書規(guī)定的體積進行定容。充分溶解后，0.22微米濾膜進行過濾、封裝。然后按照需求，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入5％-15％的血清。

如果是液體DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混勻即可。

pH調(diào)節(jié)：使用pH試紙(或者pH電位計)測試培養(yǎng)基pH值，如不符合規(guī)定，可用10％的HCl或10％NaOH調(diào)節(jié)，直到符合配方要求，一般在pH 7.0-7.5之間。

H-DMEM配方見表1，DMEM-F12配方見表2。

表1 H-DMEM配方

表2 DMEM-F12配方

2.添加組分

按照培養(yǎng)基的終體積，配置。詳細見表3。

表3添加組分

3.血清

血清種類：動物血清、胎牛血清、人血清，最佳的自體血清(臨床使用)，血清的濃度5-15％；

提供狀態(tài)：無菌、補體滅活

自體血清的制備：

9)血清分離：將血樣進行分離

10)過濾除菌：將步驟1)得到的樣品0.22微米過濾器進行兩次過濾

11)血清滅活：將步驟2)得到的樣品56℃水浴滅活熱原至少30min，冰箱冷藏室保存待用。

12)紫外線照射：有時，在步驟3)獲得的樣品在使用或者封裝前要紫外線照射。

4.dispase II(麥約爾CEL078)配制

用電子天平秤取1g的dispase II粉末，用33ml的0.9％生理鹽水完全溶解，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌。配制成1g/33ml(24U/ml)的母液。母液放置在-20℃凍存。使用時將母液稀釋至1.5-2.4U/ml的工作液。

5.IV型膠原酶(GIBCO,17104-019)配制

用電子天平秤取1g的IV型膠原酶粉末，用100ml的0.9％生理鹽水完全溶解，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌。配制成1g/100ml(2100U/ml)的母液。母液放置在-20℃凍存。使用時將母液稀釋至30-50U/ml的工作液。

6.0.25％胰蛋白酶配制

0.25mg的膠原酶溶解到100ml 0.9％生理鹽水中，攪拌均勻，在超凈工作臺用0.22微米過濾器進行過濾除菌。分裝置于5ml離心管中，放置在-20℃凍存。

7.皮膚保存液的配制

將醫(yī)用青霉素和鏈霉素配制成100ug/ml，在99ml的0.9％生理鹽水中加入1ml的青霉素和鏈霉素。

二、成纖維細胞膜片制備

1.人皮膚成纖維細胞原代培養(yǎng)

1.1雙眼皮手術(shù)中切除的皮膚組織，放置在皮膚保存液中(生理鹽水+雙抗)運至GMP實驗室，用含青鏈霉素的生理鹽水沖洗3次。

1.2在皮膚組織中加入dispase II(30-50U/ml)，37℃消化30分鐘，然后在超凈工作臺內(nèi)用眼科剪和眼科鑷將皮膚的表皮和皮下組織小心剝離，用生理鹽水將真皮組織清洗干凈至澄清。

1.3將真皮組織剪碎剪小，用IV型膠原酶(600-800U/ml)37℃消化2小時

1.4用生理鹽水稀釋膠原酶，離心，1000-1500rpm，5分鐘。如此重復洗3次。

1.5基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于100mm培養(yǎng)皿中，放置于5％CO₂，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.人皮膚成纖維細胞傳代培養(yǎng)

2.1待細胞融合度達到90％時，用0.25％胰酶在37℃培養(yǎng)箱中消化約3-5min。在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓、細胞間隙增大后，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化。

2.2離心，1300rpm，5分鐘。

2.3棄去上清液，基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸沉淀，用吸管吹打細胞，以1∶4比例接種至新的100mm培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)。

2.4待人成纖維細胞培養(yǎng)至4-6代時，用于成纖維細胞膜片制備。

3.成纖維細胞膜片制備

3.1取4-6代的成纖維細胞經(jīng)過0.25％胰酶消化，1000-1500rpm離心

3.2分別用基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分的完全培養(yǎng)基重懸沉淀，吹打均勻。

3.3按照4*10⁴/cm²接種至培養(yǎng)皿中。

3.4間隔2-4天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。

3.5圖1為4*10⁴/cm²完全培養(yǎng)液第八天的圖片，如圖1所示，待細胞長至第八天時，可見添加完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿底層細胞已形成膜片，膜片的邊緣翹起來，用鑷子可將整張膜片掲起。

圖2為4*10⁴/cm²基礎(chǔ)培養(yǎng)液第八天得圖片，如圖2所示，而添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿底部無膜片翹起，很難從培養(yǎng)皿底掲下來。

以上對本發(fā)明的具體實施方式進行了說明，但本發(fā)明并不以此為限，只要不脫離本發(fā)明的宗旨，本發(fā)明還可以有各種變化。