專利名稱：一種人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似 物，特別涉及一種人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物的及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-l(KeratinocyteGrowthFacfor-l. KGF-1)也叫成纖維細(xì)胞生
長(zhǎng)因子-7 (FGF-7)，因?yàn)槠渚哂酗@著的促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的作用而受到科學(xué)家的
關(guān)注?，F(xiàn)已證明，它對(duì)多種上皮細(xì)胞包括II型肺泡上皮細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、胃腸
細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞和各種鱗狀上皮的角化細(xì)胞等都有作用。由于KGF對(duì)許多組
織的上皮細(xì)胞都具有促增殖作用，因此對(duì)皮膚、角膜、膀胱、腎、肺、腸、肝等
部位上皮組織的損傷具有重要的修復(fù)作用。
KGF-1具有刺激胃腸系統(tǒng)的上皮細(xì)胞的增殖和分化的功能，對(duì)保持胃腸系統(tǒng)牯
膜的完整性和促進(jìn)損傷修復(fù)有很重要的作用。研究表明，KGF-1能夠誘導(dǎo)胃上皮
細(xì)胞的增殖，同時(shí)，KGF-1還能降低胃酸的分泌。因此，KGF-1具有治療胃腸系
統(tǒng)潰瘍的功能。和傳統(tǒng)的治療藥物相比，KGF-1在起到傳統(tǒng)藥物抑制胃酸作用的
同時(shí)，還能從根本上促進(jìn)胃腸系統(tǒng)上皮細(xì)胞的增殖和分化，從而使?jié)兠嬷匦律?br> 皮化而得到完全的恢復(fù)。Farrell等證明，在小鼠的放療和化療模型中，給小鼠預(yù)
先滴注重組KGF-1，可以降低小鼠的胃腸道損傷，顯著改善小鼠的生存狀態(tài)。放
療和化療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，使胃腸系統(tǒng)的細(xì)胞同樣受到損傷，影響患者的
生存狀態(tài)，在放化療的同時(shí)使用KGF可使胃腸系統(tǒng)的細(xì)胞存活率增加55 %或更多。在化療模型和放化療結(jié)合模型中，應(yīng)用KGF-1能夠加速恢復(fù)期的體重增加。其對(duì) 胃腸粘膜的保護(hù)機(jī)制是KGF的預(yù)處理增加了小腸絨毛的高度和隱窩的深度，同時(shí)， KGF-1對(duì)小腸隱窩千細(xì)胞也有直接作用，加強(qiáng)隱窩細(xì)胞在放化療中的存活率。因 此，KGF-1在治療胃腸系統(tǒng)的損傷和降低癌癥放化療的毒副作用方面具有十分重 要的意義。
已有充分證據(jù)表明，KGF-1蛋白分子極不穩(wěn)定，KGF-1的5個(gè)半胱氨酸分別位 于l、 15、 40、 102、 106位，其中1位與15位以及102位與106位之間分別形成二對(duì) 二石危鍵，而40位的半胱氨酸以自由的形式存在的，全長(zhǎng)的KGF-1由于二硫4泉之間 的錯(cuò)配容易造成蛋白的不穩(wěn)定和聚集。研究發(fā)現(xiàn)，缺失第1位與15位的半胱氨酸， KGF-1的穩(wěn)定性不但提高，活性也比原來提高了5 10倍。通過對(duì)其N端進(jìn)行改造和 對(duì)活性位點(diǎn)(第122 133位氨基酸殘基)的點(diǎn)突變則使蛋白活性出現(xiàn)了不同程度的 改變。
目前使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)KGF-1產(chǎn)量極低且造價(jià)昂貴，而使用大腸桿菌進(jìn) 行表達(dá)雖然具有表達(dá)量高和成本較低的特點(diǎn)，但是由于KGF-1本身具有的5個(gè)半 胱氨酸，造成在表達(dá)過程中主要形成包涵體，而且這種包涵體往往難于復(fù)性。因 此，使用弱啟動(dòng)子降低其表達(dá)的速率，同時(shí)使用分子伴侶幫助其正確折疊，從而 獲得大量可溶的人KGF-l,有望獲得令人滿意的KGF-1產(chǎn)量。
到目前為止，還沒有報(bào)道在將N末端缺失22個(gè)氨基酸(即A22KGF-1)的基 礎(chǔ)上，將第23位氨基酸殘基由精氨酸突變?yōu)楦拾彼?，?28位氨基酸殘基突變由 天冬酰胺突變?yōu)榉菢O性氨基酸的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于，提供一種人角質(zhì)細(xì)胞生 長(zhǎng)因子的類似物，與人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相比較，該類似物的蛋白序列的N末端缺失22個(gè)氨基酸(即A22KGF-1),將第23位氨基酸殘基由精氨 酸突變?yōu)楦拾彼?，?28位氨基酸殘基突變由天冬酰胺突變?yōu)榉菢O性氨基酸，如 絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，優(yōu)選為絲氨酸。將此類似物命名 為KGF-1/GLYS。
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)類似物KGF- 1/GLYS具有序列4所示的氨基S菱序列,其基因具有 序列3所示的核苷S臾序列。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于公開KGF-1/GLYS蛋白的制備方法通過PCR擴(kuò)增得 到含突變位點(diǎn)的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-l的cDNA，將所述cDNA片段與表達(dá)載體連 接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，表達(dá)純化。
所述的突變位點(diǎn)包括R23G和N128S。
所述的表達(dá)載體具有trp啟動(dòng)子，并與編碼具有輔助表達(dá)折疊功能的TRX蛋 白的基因可操作的連接。
該方法是使用本實(shí)驗(yàn)自己構(gòu)建的ptrpTRX載體表達(dá)目的蛋白。該載體具有啟動(dòng) 能力較弱的trp啟動(dòng)子及幫助折疊的硫氧還蛋白TRX,可以有效地控制蛋白表達(dá)的 速率和折疊效果。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于，特別提出一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體 含有上述人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物的基因序列。
所述的重組表達(dá)載體具有trp啟動(dòng)子，并與編碼具有輔助表達(dá)折疊功能的TRX 蛋白的基因可操作的連接。
本發(fā)明的目的還在于提供人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物在制備放、化療 損傷預(yù)防藥物、長(zhǎng)效藥物、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合藥物或潰瘍治療藥物中的應(yīng)用，同時(shí)也 可應(yīng)用于化妝品中。
本發(fā)明的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-l結(jié)構(gòu)類似物能促進(jìn)創(chuàng)口的愈合，修復(fù)各種皮膚損傷，減少疤痕形成，對(duì)臨床上治療燒傷及其他皮膚損傷有重要價(jià)值；能促進(jìn) 正常上皮細(xì)胞增殖，具有輻射防護(hù)作用，能預(yù)防和治療放、化療造成的損傷；而 對(duì)肺瘤細(xì)胞既不促進(jìn)其增殖，也不降低其對(duì)輻射的敏感性，同時(shí)還有增加癌癥治 療中放療指標(biāo)的潛力。可用于潰瘍和胃腸炎的治療，因此該類似物可以作為潛在 的新型多功能藥物制劑。另外，由于它能促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的增殖，加速皮膚角質(zhì)層 和基底層的修復(fù)，所以具有延緩皮膚細(xì)胞衰老，促進(jìn)皮膚細(xì)胞修復(fù)，使皮膚光滑 豐潤(rùn)的作用，因此可用于美容和化妝品行業(yè)。因此，具有非常重要的商業(yè)價(jià)值和 十分廣闊的市場(chǎng)開發(fā)和應(yīng)用前景。


圖l為表達(dá)載體ptrpTRX的質(zhì)粒圖2為BL21的超聲破碎和肝素親和層析純化結(jié)果；
圖3為凝血酶切割目的蛋白的電泳結(jié)果圖4為SP陽離子親和層析純化結(jié)果；
圖5為KGF-1/GLYS蛋白對(duì)IEC-6細(xì)胞促增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
圖6為使用兩種不同載體表達(dá)KGF-1/GLYS的產(chǎn)量比較圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一人KGF-l的cDNA^列的獲得
根據(jù)GENBANK和文獻(xiàn)報(bào)道的人KGF氨基醋列(由163個(gè)氨基酸組成)，設(shè) 計(jì)合成針對(duì)KGF-1基因的特異引物(見序列表中序列5和6),利用PCR方法從人 胎肝cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出KGF-lcDNA。酶切后與測(cè)序載體連接，制備重組質(zhì)粒， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與序列表中序列l(wèi)完全一致，其編碼的序列見序列表中序列2。
實(shí)施例二 KGF-l/GLYScDNA^列的獲得
以上面制備的含有KGF-1基因序列的重組質(zhì)粒為模板，分別用兩對(duì)引物(見序 列表中序列7和9，序列8和10)擴(kuò)增，引入N128S的突變點(diǎn)，獲得含KGF-1/GLYS N128S全長(zhǎng)基因的兩個(gè)重疊片段。然后，將兩個(gè)片段混合作為模板，利用兩端引 物(見序列表中序列7和8)進(jìn)行PCR^應(yīng)(此時(shí)引物已將第23位R突變?yōu)镚),這時(shí) 獲得R23G和N128S同時(shí)突變成功的cDNA片段。將該cDNA片段回收酶切后與相 同酶切的載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并送測(cè)序。
實(shí)施例三ptrpTRX/KGF-l/GLYS重組質(zhì)粒的構(gòu)建
以KGF-1/GLYS基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)合成針對(duì)KGF-1/GLYS的特異引物(見序列 表中序列5和6)，通過PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為435bp,兩端分別含有5aw/71 (GGATCC )和五coi I酶切位點(diǎn)的KGF-1/GLYSPCR產(chǎn)物，將該P(yáng)CR產(chǎn)物用5am/f I和五coi I雙酶切，然后連接到用這兩種酶相同處理過的表達(dá)載體ptrpTRX中，構(gòu) 建表達(dá)質(zhì)粒ptrpTRX/KGF-l/GLYS。圖l為表達(dá)載體ptrpTRX的質(zhì)粒圖。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化至感受態(tài)細(xì)胞topolO中。培養(yǎng)增殖后從轉(zhuǎn)化抹中抽提重組質(zhì)粒，按已知的方法 并使用通用引物(T7promoter)測(cè)序。經(jīng)測(cè)序，證明獲得正確的KGF-1/GLYS cDNA 序列，見序列表中序列3，其編碼的氨基S交序列見序列表中序列4，該質(zhì)粒記為 ptrpTRX/KGF- 1/GLYS。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21中。 實(shí)施例四發(fā)酵培養(yǎng)
分別從ptrpTRXZKGF- 1/GLYS轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的平板上挑取單克隆菌落，接 入50ml的氨千抗性LB培養(yǎng)基中，30°。培養(yǎng)至00600=0.6 ~ 1.0。收菌，并轉(zhuǎn)接入氨 千抗性的18升LB培養(yǎng)基中，30。C培養(yǎng)至OD6。cr0.6-1.0，添加0.5mM誘導(dǎo)劑IPTG， 繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。從含有KGF-1/GLYS轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的平板上挑取單克隆菌落，接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并誘導(dǎo)表達(dá)，離心收M。菌體沉淀進(jìn)行超聲破碎，
離心取上清分別過肝素親和層析柱和SP陽離子柱，圖2為BL21超聲破和肝素親和 層析純化結(jié)果，其中欄1-IO分別表示低分子量標(biāo)準(zhǔn)、ptrpTRX轉(zhuǎn)化的BL21、 ptrpTRX/KGF-l/GLYS轉(zhuǎn)化的BL21、全菌上清、全菌沉淀、肝素親和層析流穿、 O.lMNaCl洗脫峰、1MNaCl洗脫峰l、 1MNaCl洗脫峰2和lMNaCl洗脫峰3。由 圖2的結(jié)果可知，融合蛋白表達(dá)分子量正確，而且其表達(dá)產(chǎn)物以可溶表達(dá)為主。而 且其能與肝素親和層析填料上肝素基團(tuán)特異結(jié)合，是FGF家族蛋白的共同特點(diǎn)。 實(shí)施例五KGF-1突變體蛋白的分離純化
發(fā)酵結(jié)束后，6000rpm離心收集菌體，加入20mMTris-CL重懸菌體，利用超 聲波破碎儀破碎細(xì)胞，12000rpm離心20分鐘，收集上清。將該上清首先通過已用 20mMTris-CL平衡過的肝素凝膠柱.用含O. lmol/L NaCl的Tris-CL(pH7.0)溶液洗柱 后，加入含lmol/LNaCl的Tris-CL(pH7.0)溶液洗脫目的蛋白。將目的蛋白使用凝 血酶切割，圓3為凝血酶切割目的蛋白的電泳結(jié)果圖，其中1 _ 3欄分別為肝素親和 層析洗脫峰、凝血酶切割后蛋白、低分子量標(biāo)準(zhǔn)。由圖3結(jié)果可知，經(jīng)過凝血酶切 割后原來的蛋白消失，產(chǎn)生新的條帶(由于TRX和KGF/GLYS大小都約為16KD， 因此電泳沒有分開)。再通過已用含0.5mol/LNaCl的PB平衡過的SP陽離子交換 柱，用lmol/LNaCl的PB(PH7.4)洗脫目的蛋白。將收集的洗脫峰超濾濃縮后，通 過分子篩S-200凝膠柱進(jìn)行分離。純化后的蛋白經(jīng)12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 后，考馬斯亮藍(lán)染色顯示分子量為約16kD的單一條帶，通過氨基酸N端測(cè)序以及 氨基酸組成分析證實(shí)按本發(fā)明方法制備的蛋白的真實(shí)性(圖4)。圖4為SP陽離子 親和層析純化結(jié)果，其中l(wèi) - 3欄分別為低分子量標(biāo)準(zhǔn)、1MNaCl洗脫峰l、 1MNaCl 洗脫峰2。經(jīng)15。/。的SDS-PAGE電泳鑒定純化產(chǎn)物僅為一條目的條帶，大小約為 16kD。實(shí)施例六MTT法測(cè)定KGF-1/GLYS的活性
正C-6細(xì)胞為正常小鼠空腸上皮細(xì)胞，用含10。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培 養(yǎng)至80%融合時(shí)，收集細(xì)胞，以3xl()S個(gè)/孔接種于96孔板細(xì)月包培養(yǎng)板中，lOOpL/ 孔；然后分別在每孔加入10pL按倍比稀釋的KGF-l/GLYS突變體蛋白樣品，終濃 度分別為3.75 , 6.25 , 12.5 , 25和50ng/mL,設(shè)不加因子的陰性對(duì)照即Ong/mL, 每個(gè)濃度重復(fù)做3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后每孔加入5mg/ml的MTT20pL，繼續(xù)培養(yǎng)5h 后，每孔加入100pL 10% SDS(溶于0.01NNaCl中)，待紫色結(jié)晶溶解后，測(cè)定570nm 的吸光值。對(duì)重組人的KGF-l/GLYS和商品化的rhKGF-l的增殖作用的測(cè)定結(jié)果進(jìn) 行比較，表明KGF-l/GLYS的促上皮細(xì)胞增殖活性較rhKGF-l明顯增強(qiáng)，而且差異 顯著，結(jié)果見圖5，圖5為KGF-l/GLYS蛋白對(duì)正C-6細(xì)胞促增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本發(fā)明 通過實(shí)驗(yàn)證明了KGF-l/GLYS促細(xì)胞增殖活性較rhKGF-l顯著增強(qiáng)，因此具有 rhKGF-l的各種功能和用途。
實(shí)施例七不同載體蛋白收率的比較
使用兩種不同載體pET22b和ptrp-TRX構(gòu)建KGF-l/GLYS的表達(dá)菌抹，構(gòu)建成 功后，同時(shí)使用1L的培養(yǎng)基進(jìn)行放大培養(yǎng)、收菌和純化，使用lowey檢測(cè)蛋白濃度， 做三次重復(fù)后計(jì)算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，比較兩者差別。圖6為使用兩種不同載體表達(dá) KGF-1/GLYS的產(chǎn)量比較圖。由圖6可知，使用pET22b載體表達(dá)從l升培養(yǎng)基獲得 0.83mg蛋白，而使用ptrp-TRX載體表達(dá)可以獲得16.1mg蛋白。兩種方法收率相差 將近20倍，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
<120>—種人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物及其制備方法和應(yīng)用
<160>10
<210>1
<211>498
<212>DNA
<400>1
tcgcatatgt gcaacgatat gactccagaa cagatggcaa ctaacgtgaa ctgcagcagc 60 ccagaacgtc atactcgtag ctatgattac atggaaggtg gtgatattcg tgtgcgtcgt 120 ctgttctgtc gtacccagtg gtatctgcgt atcgataaac gtggcaaagt aaaaggcacc 180 caagaaatga agaataatta caatatcatg gaaatccgta ccgtggcagt tggtattgtg 240 gcaatcaaag gcgtggaaag cgagttctat ctggcaatga acaaggaagg taaactgtat 300 gcaaagaaag aatgcaatga agattgtaac ttcaaagaac tgattctgga aaaccattac 360 aacacctacg catctgctaa atggacccac aacggtggcg aaatgtttgt tgccctgaat 420 caaaagggca ttccggtgcg tggtaaaaaa accaagaaag aacaaaaaac cgcccacttt 480 ctgcctatgg caatcact
<210>2 <211>163 <212>PRT <400>2
Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala Thr Asn Val Asn Cys Ser
5 10 15
Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp
20 25 30
lie Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gin Tip Tyr Leu Arg lie
35 40 45
Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr50 55 60
Asn lie Met Glu lie Arg Thr Val Ala Val Gly lie Val Ala lie Lys 65 70 75 80
Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu
85 90 95
Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu lie
100 105 110
Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Tip Thr His Asn
115 120 125
Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gin Lys Gly lie Pro Val Arg
130 135 140
Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met 145 150 155 160
Ala lie Thr
<210>3 <211>423 <212>DNA <400>3
ggtagctatg attacatgga aggtggtgat attcgtgtgc gtcgtctgtt ctgtcgtacc 60
cagtggtatc tgcgtatcga taaacgtggc aaagtaaaag gcacccgtga aatgaagaat 120
aattacaata tcatggaaat ccgtaccgtg gcagttggta ttgtggcaat caaaggcgtg 180
gaaagcgagt tctatctggc aatgaacaag gaaggtaaac tgtatgcaaa gaaagaatgc 240
aatgaagatt gtaacttcaa agaactgatt ctggaaaacc attacaacac ctacgcatct 300
gctaaatgga cccactctgg tggcgaaatg tttgttgccc tgaatcaaaa gggcattccg 360
gtgcgtggta aaaaaaccaa gaaagaacaa aaaaccgccc actttctgcc tatggcaatc 420 acttaagaattcctg
<210〉4 <211>141<212>PRT <400>4
Gly Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp lie Arg Val Arg Arg Leu Phe
5 10 15
Cys Arg Thr Gin Trp Tyr Leu Arg lie Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys
20 25 30
Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn lie Met Glu lie Arg Thr
35 40 45
Val Ala Val Gly lie Val Ala lie Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr
50 55 60 65
Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn
70 75 80
Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu lie Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr
85 90 95
Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Ser Gly Gly Glu Met Phe Val Ala
100 105 110
Leu Asn Gin Lys Gly lie Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu
115 120 125
Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala lie Thr 130 135 140
<210>5 <211>23 <212>DNA <400>5
tcgcatatgtgcaacgatatg 21
<210>6
<211>23
<212>DNA<400>6
agtgattgccataggcagaaa 21
<210>7 <211>23 <212>DNA <400>7
gatgatggatccggtagctatgattacatggaaggtg 3 7
<210>8 <211>23 <212>DNA <400>8
gatgatgaattcttaagtgattgccataggcaga 3 4
<210>9 <211>23 <212>DNA <400>9
caccagagtgggtccatttagc 22
<210>10 <211>23 <212>DNA <400>10
gctaaatggacccactctggtg 2權(quán)利要求
1、一種人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物，其特征在于，與人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相比較，所述結(jié)構(gòu)類似物的蛋白序列的N末端缺失22個(gè)氨基酸，將第23位氨基酸殘基由精氨酸突變?yōu)楦拾彼?，?28位氨基酸殘基突變由天冬酰胺突變?yōu)榉菢O性氨基酸。
2、 如權(quán)利要求1所述的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物，其特征在于， 所述的非極性氨基酸為絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。
3、 如權(quán)利要求1所述的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物，其特征在于， 所述的非極性氨基酸為絲氨酸。
4、 一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體含有權(quán)利要求1 - 3 之一所述的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物的基因序列。
5、 如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體 具有trp啟動(dòng)子，并與編碼具有輔助表達(dá)折疊功能的TRX蛋白的基因可操作的 連接。
6、 一種如權(quán)利要求l - 3之一所述的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-l結(jié)構(gòu)類似物的制 備方法，其特征在于，通過PCR擴(kuò)增得到含突變位點(diǎn)的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1的 cDNA，將所述cDNA片段與表達(dá)載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽 性克隆，表達(dá)純化。
7、 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的突變位點(diǎn)包括R23G 和N128S。
8、 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體具有trp 啟動(dòng)子，并與編碼具有輔助表達(dá)折疊功能的TRX蛋白的基因可操作的連接。
9、 權(quán)利要求1 - 3之一所述的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物在制備放、 化療損傷預(yù)防藥物、長(zhǎng)效藥物、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合藥物或潰瘍治療藥物中的應(yīng)用。
10、 權(quán)利要求1 - 3之一所述的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物在化妝品 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的類似物，與人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相比較，該類似物的蛋白序列的N末端缺失22個(gè)氨基酸，將第23位氨基酸殘基由精氨酸突變?yōu)楦拾彼?，?28位氨基酸殘基突變由天冬酰胺突變?yōu)榉菢O性氨基酸。制備該蛋白時(shí)，通過PCR擴(kuò)增得到含突變位點(diǎn)的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1的cDNA，將所述cDNA片段與表達(dá)載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，表達(dá)純化。特別提出一種重組表達(dá)載體，其含有上述人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物的基因序列。本發(fā)明的人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1結(jié)構(gòu)類似物可制備放、化療損傷預(yù)防藥物、長(zhǎng)效藥物、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合藥物或潰瘍治療藥物，同時(shí)也可應(yīng)用于化妝品中。
文檔編號(hào)A61P17/16GK101575372SQ20091004010
公開日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月9日
發(fā)明者佘妙琴, 盛國(guó)慶, 蔡祥勝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院