一種含有角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子kgf2的植物油體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種含角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的油體，利用重組DNA技術(shù)將KGF2基因插入以pCAMBIA1301質(zhì)粒為基本骨架改造的植物特異表達(dá)載體pOBT，構(gòu)建了植物油體特異表達(dá)KGF2植物表達(dá)載體pOBT-KGF2，轉(zhuǎn)化至油料作物中，大量表達(dá)了角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2，提取含油體蛋白與KGF2的融合表達(dá)產(chǎn)物的油體，可直接作為活性成分用于醫(yī)藥領(lǐng)域和日化領(lǐng)域生產(chǎn)，簡(jiǎn)化了以往角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2提取，以及與乳化劑（或保護(hù)劑）混合的加工工藝，降低了生產(chǎn)成本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種含有角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的植物油體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及植物油體特異表達(dá)載體pOBT-1KFJ?和一種含有角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的植物油體。
【背景技術(shù)】
[0002]角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (Keratinocyte growth factor2, KGF2)又稱(chēng)為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-10,是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子超家族中角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Keratinocyte growthfactors，KGFs)亞家族的一員。亞家族成員包括角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子I (KGFl)和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (KGF2),這兩種生長(zhǎng)因子都與上皮細(xì)胞的增殖有關(guān)系，都具有與肝素高度親和的特性。
[0003]KGF2的生物學(xué)功能主要是通過(guò)受體的介導(dǎo)完成的，它能特異性促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移，對(duì)脊椎動(dòng)物多種組織和器官的發(fā)育起重要調(diào)控作用。KGF-2有兩種細(xì)胞膜表面受體即FGFRl-1II b和FGFR2-1IIb0它們都由三部分組成:包括三個(gè)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(D1、D2和D3)，一個(gè)單面跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)具有酪氨酸蛋白激酶活性的C端結(jié)構(gòu)域。它不同于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族其他成員的最重要一點(diǎn)是由成纖維細(xì)胞及其他間質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生，對(duì)肝素具有很強(qiáng)的親和力，特異性作用于上皮細(xì)胞表面的酪氨酸激酶受體 FGFR2 III b 和 FGFRl IIIb0
[0004]KGF2 一般由間充質(zhì)源性細(xì)胞分泌，上皮細(xì)胞表達(dá)其相應(yīng)的受體，因此其主要是以旁分泌的方式發(fā)揮生物學(xué)功能，但也可以自分泌方式發(fā)揮作用。它能特異性促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移，對(duì)脊椎動(dòng)物多種組織和器官的發(fā)育起重要的調(diào)控作用，對(duì)治療多種臨床疾病的也有很好的應(yīng)用前景。
[0005]角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2能有效促進(jìn)上皮細(xì)胞增生，明顯改善皮膚損傷的修復(fù)。有研究表明，KGF2不僅直接促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的增殖，而且還刺激角質(zhì)細(xì)胞合成與分泌粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF-AB)，從而間接作用于參與組織修復(fù)的其它細(xì)胞如炎性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及角朊細(xì)胞自身，促進(jìn)創(chuàng)面的再上皮化與肉芽組織形成。此外，體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明KGF-2對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯的促增殖作用，因而是一個(gè)較為安全的治療創(chuàng)面愈合的生長(zhǎng)因子。
[0006]角膜損傷的修復(fù)過(guò)程，涉及許多種細(xì)胞因子，KGF2是其中很重要的一種。它以旁分泌的形式刺激角膜上皮細(xì)胞的增生，激活促分裂原蛋白激酶和纖溶酶原激活物活性，從而加速角膜損傷的修復(fù)。研究證明，人角膜上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞均有KGF-2mRNA及FGFR的表達(dá)。角膜上皮細(xì)胞創(chuàng)傷后，KGF及受體mRNA的表達(dá)水平大大提高。活體條件下的實(shí)驗(yàn)證明，KGF2能明顯加快角膜上皮損傷恢復(fù)的速度，縮短了角膜上皮愈合的時(shí)間，具有顯著的修復(fù)作用且呈劑量依賴(lài)性。
[0007]研究表明KGF-2在預(yù)防電離輻射損傷防護(hù)方面具有顯著作用。它能增強(qiáng)細(xì)胞抗氧自由基損傷和增強(qiáng)DNA復(fù)制，抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，降低輻射引起的胃腸道損傷，預(yù)防黏膜炎的發(fā)生，保護(hù)小腸隱窩免受輻射損傷，提高骨髓對(duì)全身輻射的耐受性，并能調(diào)節(jié)和維持干細(xì)胞的分裂及存活。有研究表明KGF能促進(jìn)損傷后的DNA修復(fù)，維持細(xì)胞內(nèi)骨架穩(wěn)定和保持細(xì)胞間的連接完整，KGF2對(duì)上皮樣腫瘤均無(wú)刺激增殖效應(yīng)，在臨床腫瘤放化療引起的黏膜炎等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0008]利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白，近年來(lái)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，油體蛋白是油體中主要的膜蛋白。油體蛋白是堿性的疏水蛋白，三個(gè)部分組成油體蛋白:親脂的C端和N端，和中間疏水區(qū)域，它是通過(guò)磷脂膜進(jìn)入到油體內(nèi)部。N端和C端則鑲嵌在油體表面，暴露在細(xì)胞質(zhì)中。油體蛋白具有表面活性劑，使其不能與油體結(jié)合。油體的這種非結(jié)合性非常適合用作乳化劑。乳化劑能降低互不相溶的液體間的界面張力，使之成為乳濁液。油體乳化劑是從天然油料種子中提取出來(lái)的，油體蛋白的結(jié)構(gòu)以及它的特異性，使油體在生物技術(shù)中得到廣泛的應(yīng)用，例如它可以作為乳化劑，在生產(chǎn)食品、飼料、藥物、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品和工業(yè)產(chǎn)品等中得到廣泛的應(yīng)用。與來(lái)自礦物的乳化劑相比，更加環(huán)保和可再生。它還可以應(yīng)用于純化、重折疊和固定重組蛋白，在油體表面，目的蛋白與油體蛋白通常通過(guò)兩種方式結(jié)合，分別是與油體蛋白融合在油體中表達(dá)和通過(guò)配體作為親和標(biāo)簽與油體蛋白連接。本發(fā)明是根據(jù)植物油體特性，使透明質(zhì)酸酶基因連接在油體蛋白基因的N端或C端，構(gòu)建融合基因，使目的蛋白在植物油體中特異性表達(dá)，利用油體親脂疏水的特性，將種子粉碎后，經(jīng)不同提取液抽提，回收油相，既可將融合蛋白與細(xì)胞內(nèi)的其他組份分開(kāi)，簡(jiǎn)化了分離純化步驟，降低了純化成本與生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明目的是提供植物油體特異表達(dá)載體pOBT- KGF2。
[0010]一種表達(dá)載體質(zhì)粒pOBT- KGF2,它是由下述方法制備的:
1)以pl301為基本骨架，將其T-DNA區(qū)進(jìn)行改造，除了保留有T-DNA區(qū)的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替換，以pEGAD質(zhì)粒為模板，利用35S-F上游引物CGGGGTACCATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCTACT 和 Bar-R 下游引物 CGGAATTCACTAGTTCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGG ACGGGGCGGAACC 進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增得到 35S_Bar 基因，利用 kpnl 和 SpeI酶切位點(diǎn)將其插入到PCAMBIA1301載體T-DNA區(qū)的NOS基因前，構(gòu)建了 pl301-35S-Bar_N0S基本質(zhì)粒，簡(jiǎn)與為ρθ質(zhì)粒；
2)用pstl和NcoI分別酶切并連接ρθ質(zhì)粒和序列表SEQID N0.2所示基因，得中間載體 pOB ；
3)用HindIII和kpnl分別酶切并連接中間載體pOB和序列表SEQ ID N0.3所示基因，得植物特異表達(dá)載體POBT ；
4)用NcoI與HindIII分別酶切并連接植物特異表達(dá)載體pOBT和序列表SEQ ID N0.5所示基因，得表達(dá)載體質(zhì)粒pOBT- KGF2。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的植物油體。
[0012]一種含有角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的植物油體，它是將其堿基序列如序列表SEQ IDN0.5所示的基因插入植物特異表達(dá)載體中，獲得的表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至油料作物中，收獲種子提取油體；
所述的植物表達(dá)載體為植物特異表達(dá)載體POBT ；所述的油料作物為紅花、油菜、大豆或花生。
[0013]本發(fā)明提供了含角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的油體。本發(fā)明人根據(jù)植物偏好性改造了 KGF2基因，利用重組DNA技術(shù)將KGF2基因插入以pCAMBIA1301質(zhì)粒為基本骨架改造的植物特異表達(dá)載體ΡΟΒΤ，成功構(gòu)建了植物油體特異表達(dá)KGF2植物表達(dá)載體p0BT-KGF2，轉(zhuǎn)化至油料作物中，表達(dá)了角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2，獲得了含角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的油體，角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2在植物種子中大量積累，最終獲得較高的表達(dá)水平，以期達(dá)到KGF2的大量、廉價(jià)生產(chǎn)，并在醫(yī)藥領(lǐng)域和日化領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。含油體蛋白與KGF2的融合表達(dá)產(chǎn)物的油體可直接作為活性成分用于相應(yīng)產(chǎn)品的生產(chǎn)，簡(jiǎn)化了以往角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2與乳化劑(或保護(hù)劑)混合的加工工藝，降低了生產(chǎn)成本。
[0014]本方法生產(chǎn)角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、表達(dá)量高等特點(diǎn)；在純化階段，由于油體蛋白與角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2相偶聯(lián)表達(dá)，所以通過(guò)不同濃度梯度離心的方法可以出去雜蛋白，凈化融合蛋白。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1菜豆啟動(dòng)子的核酸電泳圖 圖2菜豆終止子的核酸電泳圖
圖3植物油體表達(dá)載體構(gòu)建pOBT示意圖；
圖4含有角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2基因的植物油體表達(dá)載體P0BT-KGF2示意圖；
圖5角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的SDS-PAGE檢測(cè)圖；
圖6角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的Western blot檢測(cè)圖； 圖1為轉(zhuǎn)基因種子中KGF2生物學(xué)活性測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1:角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2基因的合成
首先從GENBANK中找到的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的核苷酸序列。根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性消除在本實(shí)驗(yàn)中所用到的酶切位點(diǎn)，送去上海生工生物工程有限公司進(jìn)行人工合成角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2 (SEQ ID N0.1)。
[0017]實(shí)施例2:克隆菜豆種子特異啟動(dòng)子與終止子
為了從菜豆基因組序列中克隆種子特異啟動(dòng)子與終止子，利用引物，采用標(biāo)準(zhǔn)的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，從菜豆基因組DNA中擴(kuò)增得到1548bp和1220bp的DNA片段(如圖1和圖2)，擴(kuò)增的片段經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化，克隆到pUC57克隆載體中，保存?zhèn)溆?。?jīng)測(cè)序，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.2和3所不。
[0018]菜豆啟動(dòng)子引物 Primer5F: GAATTCATTGTACTCCCAG Primer5R:AGTAGAGTAGTATTGAATATGAG 菜豆終止子引物
tem5F: AATAAGTATGAACTAAAATGC
tem5R: TTAGTTGGTAGGGTGCTAGGAA
實(shí)施例3:擬南芥油體蛋白基因的克隆取擬南芥種子，提取DNA基因組，用引物:
I:CCATGGCGGATACAGCTAGAGG
2:CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG
進(jìn)行擴(kuò)增擬南芥油體蛋白基因，經(jīng)測(cè)序，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.4所不；將其克隆到T載體中，保存?zhèn)溆谩?br> [0019]實(shí)施例4:構(gòu)建植物特異表達(dá)載體pOBT
將pUC57-菜豆啟動(dòng)子的克隆載體用限制性?xún)?nèi)切酶pstl和NcoI消化，回收目的片段菜豆啟動(dòng)子序列，同時(shí)用pstl和NcoI消化基本質(zhì)粒ρθ(以pl301為基本骨架，將其T-DNA區(qū)進(jìn)行改造，除了保留有T-DNA區(qū)的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替換，以pEGAD質(zhì)粒為模板，利用 35S-F 上游引物 47bp cggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctact 和 Bar-R 下游弓 I物 54bp cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaacc進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到35S-Bar基因，利用kpnl和SpeI酶切位點(diǎn)將其插入到pCAMBIA1301載體T-DNA區(qū)的NOS基因前，構(gòu)建了 pl301-35S-Bar-N0S基本質(zhì)粒，簡(jiǎn)寫(xiě)為ρθ質(zhì)粒)，將菜豆啟動(dòng)子(用來(lái)啟動(dòng)油體蛋白與膠原蛋白的融合基因)與基本質(zhì)粒PO連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得pOB中間載體；將pUC57-終止子的克隆載體用HindIII和kpnl消化，回收目的片段菜豆終止子，同時(shí)用這兩個(gè)酶消化POB中間載體，將終止子與酶切后的pOB載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得植物特異表達(dá)載體POBT (見(jiàn)圖4)。
[0020]實(shí)施例5:構(gòu)建含有角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2基因的植物油體特異表達(dá)載體P0BT-KGF2
以克隆得到的擬南芥油體蛋白基因和KGF2基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)融合基因引物，通過(guò)融合PCR技術(shù)，獲得oleosin-KGF2融合基因，經(jīng)測(cè)序，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.5所示。將融合基因用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI與HindIII進(jìn)行酶切，同時(shí)用這兩個(gè)酶對(duì)pOBT載體進(jìn)行酶切，然后將融合基因與酶切后的POBT載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，產(chǎn)生pOBTcol植物油體表達(dá)載體。
[0021]擬南芥油體蛋白與KGF2融合基因引物
1: CCATGGCGGATACAGCTAGAGGAACCCATCAC
2: CATGTCCTGACCAAGGGCAGTAGTGTGCTGGC
3:GCCAGCACACTACTGCCCTTGGTCAGGACATG
4:CCCAAGCTTCTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG
實(shí)施例6:p0BT-KGF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105
(I)取100 μ L農(nóng)桿菌ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中IOmin使其融化備用。(2)取
Iμ Lp0BT-KGF2質(zhì)粒加入到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，用移液槍輕輕吹打，使其混合均
勻，冰浴30分鐘。(3)冰浴后立即將其置于液氮中冷凍5min，立刻取出放入37°C熱擊5min。 (4)加ImL不含抗性YEP液體培養(yǎng)基至離心管中，28°C，180rpm/min搖菌4h。
(5)使用離心機(jī)5000rpm,離心5min,棄上清,加入100 μ LYEP培養(yǎng)基重懸。
[0022](6)將重懸液涂布于含三抗(100 μ g/mLRif Str、50 μ g/mLKan 和 50 μ g/mL))的YEP固體培養(yǎng)基平板內(nèi)，在28°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2~3天。
[0023]利用該方法把p0BT-KGF2轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)中，挑取單菌落進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)，經(jīng)行菌液PCR篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的菌液即為含目的基因P0BT-KGF2的農(nóng)桿菌工程菌菌株。用70%甘油保種陽(yáng)性菌株，-80°C冰箱保存。
[0024]實(shí)施例7 =Flori dip方法進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化
首先，侵染前一天將野生型擬南芥和亞麻芥植株澆水澆透；將農(nóng)桿菌工程菌株接種至50ml 含有三抗(100 μ g/ml Rif,50 μ g/ml Str 和 50 μ g/ml Kan)的 YEP 液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)(180rpm/min，28°C);取預(yù)培養(yǎng)的農(nóng)桿菌7ml加入到含有三抗的YEP液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，直至0D5900=1.(Tl.2 ;把農(nóng)桿菌菌液移到離心管中，20°C，4000rpm離心20min，收集菌體，去除三抗培養(yǎng)基。用Floral-Dip Buffer重懸菌體，使其0D590達(dá)到
0.8、.9。轉(zhuǎn)化前剪掉種莢、開(kāi)花和露白的花芽。在缽體四周插上適當(dāng)高度的竹簽，以便支撐倒過(guò)來(lái)進(jìn)行侵染的缽體。將擬南芥的莖部和葉片基部浸入重懸的農(nóng)桿菌菌液中，靜置7分鐘，然后吸棄過(guò)多的菌液。平放轉(zhuǎn)化后的缽體，用塑料薄膜等保濕過(guò)夜，第二天可稍露一小縫，第三天正常放置。一周后可進(jìn)行第二次侵染。待種子成熟后，可隔天采摘發(fā)黃成熟的莢，收獲種子。
[0025]實(shí)施例8:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
取I μ g p0BT-KGF2質(zhì)粒DNA加入到100微升EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻冰浴放置5min ;然后置于液氮中冷凍5min后迅速轉(zhuǎn)至37°C水浴中溫育5min,加入ImlLB液體培養(yǎng)基，在28°C搖床上180rpm振蕩培養(yǎng)4h，取適量菌液涂布到含有鏈霉素和卡那霉素的LB固體培養(yǎng)上，置28°C培養(yǎng)24h，經(jīng)抗性篩選、PCR檢測(cè)陽(yáng)性單菌落。
[0026]從平板上挑取含有P0BT-KGF2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種到5mlLB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取100微升菌液接種到50mlLB液體培養(yǎng)基中，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)至0D600為0.8，然后離心重懸，懸浮液OD=0.6即可。
[0027]將紅花、油菜、大豆、花生等植物子葉節(jié)在重懸液中侵染lOmin，放在含有合適激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn) 到含有0.5%basta和250mg/L頭孢霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大約30d后可見(jiàn)抗性芽出現(xiàn)，待抗性芽伸長(zhǎng)到2cm后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中。
[0028]實(shí)施例9:轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)
提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以基因組為模板，用融合基因引物:
1: CCATGGCGGATACAGCTAGAGGAACCCATCAC
2: CCCAAGCTTCTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG
擴(kuò)增KGF2基因片段，擴(kuò)增出預(yù)期的目的條帶。
[0029]實(shí)施例10:篩選表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因株系
轉(zhuǎn)基因株系在溫室或大田經(jīng)生長(zhǎng)與發(fā)育，然后開(kāi)花結(jié)籽，形成轉(zhuǎn)基因Tl代種子，當(dāng)Tl代種子收獲后，每株轉(zhuǎn)基因植株取200-1000mg，在提取液中抽提油體蛋白與KGF2的融合蛋白，采用ELISA法，按照KGF2的ElISA試劑盒(上海拜力生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)重組KGF2的表達(dá)量，以pl390R-KGF2為對(duì)照，篩選出高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系。結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的P0BT-KGF2重組載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的紅花、油菜、大豆、花生植株與P13900R-KGF2經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的植株相比，表達(dá)量明顯提高，如下表所示。
【權(quán)利要求】
1.一種表達(dá)載體質(zhì)粒pOBT-1KFJ?，它是由下述方法制備的: 1)以pl301為基本骨架，將其T-DNA區(qū)進(jìn)行改造，除了保留有T-DNA區(qū)的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替換，以pEGAD質(zhì)粒為模板，利用35S-F上游引物CGGGGTACCATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCTACT 和 Bar-R 下游引物 CGGAATTCACTAGTTCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGAACC 進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增得到 35S_Bar 基因，利用 kpnl 和 SpeI酶切位點(diǎn)將其插入到PCAMBIA1301載體T-DNA區(qū)的NOS基因前，構(gòu)建了 pl301-35S-Bar_N0S基本質(zhì)粒，簡(jiǎn)與為ρθ質(zhì)粒； 2)用pstl和NcoI分別酶切并連接p0質(zhì)粒和序列表SEQID N0.2所示基因，得中間載體 pOB ； 3)用HindIII和kpnl分別酶切并連接中間載體pOB和序列表SEQ ID N0.3所示基因，得植物特異表達(dá)載體POBT ； 4)用NcoI與HindIII分別酶切并連接植物特異表達(dá)載體pOBT和序列表SEQ ID N0.5所示基因，得表達(dá)載體質(zhì)粒pOBT- KGF2。
2.一種含有角 質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的植物油體，它是將其堿基序列如序列表SEQ IDN0.5所示的基因插入植物特異表達(dá)載體中，獲得的表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至油料作物中，收獲種子提取油體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種含有角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的植物油體，其特征在于:所述的植物表達(dá)載體為權(quán)利要求1所述的植物特異表達(dá)載體pOBT。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種含有角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子KGF2的植物油體，其特征在于:所述的油料作物為紅花、油菜、大豆或花生。
【文檔編號(hào)】C11B1/04GK103468737SQ201310333809
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月4日
【發(fā)明者】姜潮, 李校堃, 李海燕, 田海山, 楊晶, 王蘭, 陳玉斌, 金立波 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 吉林農(nóng)大生物反應(yīng)器工程有限公司