專利名稱：一種具有治療婦科疾病的中藥復(fù)方有效部位及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥復(fù)方有效部位，具體涉及一種具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位及其制備方法和其在制備治療婦科疾病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
婦科疾病是婦女的常見(jiàn)病、多發(fā)病，其中多與炎癥及內(nèi)分泌紊亂密切相關(guān)。婦科炎癥中慢性盆腔炎、慢性宮頸炎、陰道炎等發(fā)病率較高；婦科內(nèi)分泌紊亂所通常以月經(jīng)的紊亂為主要表現(xiàn)，月經(jīng)正常與否決定于性甾體激素水平的高低，在性激素有序的波動(dòng)變化下形成了規(guī)律月經(jīng)。
流行病學(xué)研究表明痛經(jīng)是目前婦科月經(jīng)病中最常見(jiàn)疾病，分為原發(fā)性痛經(jīng)和繼發(fā)性痛經(jīng)。主要表現(xiàn)為經(jīng)期或行經(jīng)前后出現(xiàn)下腹部、腰部疼痛，有時(shí)伴有頭暈或惡心嘔吐，嚴(yán)重者可出現(xiàn)面色蒼白、出冷汗、手足厥冷、劇痛昏倒現(xiàn)象。目前，痛經(jīng)的治療仍采用甾體激素及前列腺素拮抗劑，前者多不易被患者接受，后者因只能暫時(shí)緩解疼痛而不能徹底治愈，且有一定副作用，故不宜長(zhǎng)期服用，不能視為理想的藥物及治療方法。而中藥市場(chǎng)上治療痛經(jīng)的藥物如月月舒、痛經(jīng)靈、益母草沖劑等，具有良好療效，且毒副作用甚小，受到廣大患者的歡迎。
子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率近年呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，其并發(fā)癥表現(xiàn)多樣性，臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的痛經(jīng)、不孕、盆腔結(jié)節(jié)與包塊，臨床藥物治療中常用孕激素、丹那唑、內(nèi)美通、促性腺激素釋放激動(dòng)劑和米非司酮等藥物，但這些藥物臨床效果并不理想，特別是現(xiàn)用的藥物是強(qiáng)力的生育抑制劑，具有明顯的副作用。手術(shù)治療有保守性手術(shù)和根治性手術(shù)?？梢?jiàn)對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥患者根治性手術(shù)是不合適的，而保守性手術(shù)長(zhǎng)常配合藥物治療。
慢性盆腔炎常為急性盆腔炎未能徹底治愈或疾病遷延、患者體質(zhì)較弱所致。該病是婦女的常見(jiàn)病、多發(fā)病，在發(fā)展中國(guó)家，育齡期婦女盆腔炎的發(fā)病率高達(dá)40％，具有病程長(zhǎng)、病情頑固、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。針對(duì)盆腔炎患者的治療主要是抗生素治療。在我國(guó)還有傳統(tǒng)的中醫(yī)療法和中西醫(yī)結(jié)合療法等輔助治療，療效肯定。治療盆腔炎的常用抗生素有青霉素類、頭孢菌素類、林可霉素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類等；中醫(yī)治療盆腔炎的主要原則是活血祛瘀、清熱解毒。
西藥治療該類疾病的措施有效迅速，但停藥后易復(fù)發(fā)，且藥物多有副作用。如黃體酮、醋酸甲羥基孕酮、對(duì)乙酰氨基酚等，這些藥物均為針對(duì)婦科疾病的癥狀進(jìn)行治療，且黃體酮和醋酸甲羥基孕酮可有頭暈、頭痛、惡心、乳房脹痛等副作用，長(zhǎng)期應(yīng)用可引起子宮內(nèi)膜萎縮，月經(jīng)量減少，易發(fā)生陰道霉菌感染。
而中藥在治療婦科疾病中發(fā)揮著一定的特色和優(yōu)勢(shì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體整體功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂、作用緩和、副作用小等一系列優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有針對(duì)婦科疾病專利僅對(duì)復(fù)方藥物組方配伍進(jìn)行保護(hù)(如CN 136871A一種中藥復(fù)方；CN1895458A一種治療婦科疾病的重要復(fù)方提取物及其制備方法)；而有關(guān)中藥復(fù)方的專利未對(duì)其有效成分進(jìn)行研究(如CN1651033A一種治療婦科疾病的中藥復(fù)方及其制備方法；CN1470273A治療婦科疾病的藥物及其應(yīng)用制劑；CN1530126A一種藥物組合物、其制備方法及其在制備治療婦科疾病藥物中的應(yīng)用)；中醫(yī)藥治療婦科疾病有悠久的歷史，其治則為發(fā)時(shí)攻邪治標(biāo)，未發(fā)之時(shí)扶正治本，從目前臨床婦科疾病治療來(lái)看，以辨證辨病結(jié)合，中醫(yī)藥愈加顯現(xiàn)其獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)，但目前治療婦科疾病的復(fù)方藥物多存在使用不便、用藥量大、成分復(fù)雜、有效部位不明確，復(fù)方中起療效的物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚，并存在一定的不良反應(yīng)等問(wèn)題，因此很有必要在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下開(kāi)發(fā)出一種有效物質(zhì)明確、療效確切，副作用小、服用方便的治療婦科疾病的藥物。


發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種組方配比科學(xué)合理、有效成分明確、療效好、副作用小、服用方便的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位，本發(fā)明另一個(gè)目的是提供該具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的制備方法和其在制備治療婦科疾病藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為 一種具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位，它由下列重量份數(shù)的原料制成 當(dāng)歸10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黃10-50份、五靈脂8-35份、沒(méi)藥3-20份、延胡索3-20份。
作為優(yōu)選方案，本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位由下列重量份數(shù)的原料制成 當(dāng)歸30-50份、川芎5-15份、赤芍15-30份、蒲黃30-50份、五靈脂15-30份、沒(méi)藥5-15份、延胡索5-15份。
作為更優(yōu)選方案，本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位由下列重量份數(shù)的原料制成 當(dāng)歸35-45份、川芎10-15份、赤芍15-25份、蒲黃30-45份、五靈脂15-25份、沒(méi)藥10-15份、延胡索10-15份。
本發(fā)明在對(duì)古今治療婦科疾病方劑進(jìn)行篩選，在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，辨證施治，結(jié)合婦科疾病的發(fā)病機(jī)理和發(fā)病癥狀進(jìn)行配比組方，確定以當(dāng)歸、川芎、赤芍，配伍活血祛瘀止痛藥蒲黃、沒(méi)藥、延胡索和五靈脂組成七味中藥進(jìn)行組方，整方具有活血化瘀止痛、養(yǎng)血補(bǔ)血，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的雙重功效，主用于婦科血虛血瘀、內(nèi)分泌混亂導(dǎo)致的痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥或慢性盆腔炎等病癥；方中當(dāng)歸補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛；赤芍涼血活血，具有行血，破瘀，散血塊，緩急止痛功效；川芎活血祛瘀，行氣止痛，三藥相配，動(dòng)靜結(jié)合，滋而不膩，溫而不燥，補(bǔ)而不滯，剛?cè)嵯酀?jì)，陰陽(yáng)調(diào)和，營(yíng)血得生，共奏補(bǔ)血活血之功，再配伍蒲黃、沒(méi)藥、延胡索和五靈脂，使組方補(bǔ)血而不留瘀，行血而不傷血，增加補(bǔ)氣行氣止痛、活血化瘀之功，主治經(jīng)脈氣血凝滯，內(nèi)分泌紊亂導(dǎo)致的婦科疾病。本發(fā)明在中醫(yī)藥辨證施治的指導(dǎo)下組方，并根據(jù)組方藥味的理化性質(zhì)特點(diǎn)，對(duì)整方的提取物通過(guò)現(xiàn)代分離純化手段進(jìn)行去粗存精，根據(jù)現(xiàn)代分析儀器和藥理篩選結(jié)果表明，所得的有效部位活性成分更明確，活血化瘀、止痛抗炎作用強(qiáng)，不良反應(yīng)更低。
本發(fā)明提供的制備具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的方法，具體包括以下步驟 (1)取由當(dāng)歸10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黃10-50份、五靈脂8-35份、沒(méi)藥3-20份、延胡索3-20份組成的中藥復(fù)方，加入總藥材5～10倍量的水或醇水煎煮，合并煎煮液在20～70℃減壓濃縮得濃縮液； (2)取步驟(1)得到的濃縮液加入乙醇，使乙醇的濃度達(dá)到70～90％，放置沉淀，分離上清液，濃縮，得濃縮物； (3)取步驟(2)得到的濃縮物上大孔吸附樹(shù)脂柱，用濃度20％至70％的乙醇梯度洗脫，洗脫液回收溶劑，得中藥復(fù)方有效部位。
作為優(yōu)選方案，以上所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的制備方法，步驟(1)中煎煮溶劑醇水中乙醇濃度為0-80％，煎煮次數(shù)為1～3次。
作為優(yōu)選方案，以上所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的制備方法，步驟(2)中加入乙醇，使乙醇的濃度達(dá)到75～85％，放置沉淀，此操作的目的是加入乙醇使溶液中乙醇的濃度達(dá)到75～85％，放置，進(jìn)行沉淀，可以沉淀去除提取液中大量極性大的大分子化合物，如多糖、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)和果膠等，有利于后續(xù)的分離純化工藝，提高純化效率。
作為優(yōu)選方案，以上所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的制備方法，步驟(3)中所述的大孔吸附樹(shù)脂為D101、D102或AB-8型大孔吸附樹(shù)脂。本發(fā)明通過(guò)對(duì)不同極性和不同型號(hào)樹(shù)脂進(jìn)行吸附和純化能力的篩選，確定型號(hào)為D101、D102或AB-8型的大孔吸附樹(shù)脂吸附和純化效果做好，同時(shí)本發(fā)明對(duì)5％～95％不同濃度乙醇的洗脫能力進(jìn)行了優(yōu)選，以總洗脫物得率和機(jī)酸類、黃酮類、內(nèi)酯類和萜苷類的含量作為指標(biāo)，確定濃度為20％至70％的乙醇的洗脫物總含量高，機(jī)酸類、黃酮類、內(nèi)酯類和萜苷類有效成分含量高，且雜質(zhì)少，因此確定濃度20％至70％的乙醇為梯度洗脫溶劑，作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，濃度30％至40％的乙醇為最佳梯度洗脫溶劑。
由本發(fā)明提供的制備方法提取分離得到的中藥復(fù)方有效部位，經(jīng)HPLC/HPLC-MS分析，提取物中的有效成分由黃酮類、萜苷類、內(nèi)酯類、有機(jī)酸類等四類化合物所組成，且四類有效成分在提取物中的重量百分比為20～90％。
作為優(yōu)選方案，提取物中黃酮類、萜苷類、內(nèi)酯類、有機(jī)酸類四類化合物重量百分組成為1.5％～9.5％的機(jī)酸類；1％～30％的黃酮類；1％～40％的內(nèi)酯類；13％～40％的萜苷類化合物，具體包括下列重量百分比的成分芍藥苷3.0％～26％、芍藥內(nèi)酯苷1.2％～4.8％、阿魏酸0.35％～1.56％、咖啡酸0.12％～0.48％、香草酸0.64％～2.56％、原兒茶酸1％-2％、香蒲新苷1％～4％、異鼠李素-3-O-新橙皮苷1.49％～5.96％、槲皮素0.5％-2.1％、洋川芎內(nèi)酯I 3％-15％和洋川芎內(nèi)酯H 1％-5％等成分。
本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位在制備治療婦科疾病藥物中的應(yīng)用。
作為優(yōu)選方案，所述的婦科疾病為婦女痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥或慢性盆腔炎疾??； 作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，把具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位和藥學(xué)上可接受的載體制成膠囊劑、顆粒劑、片劑、噴霧劑、注射劑、微囊、軟膏劑或透皮控釋貼劑劑型的藥物。
本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位在制成片劑時(shí)把具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方和載體乳糖或玉米淀粉，需要時(shí)加入潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位制成膠囊劑時(shí)把具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方和載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位制成顆粒劑時(shí)，把具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位和稀釋劑乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。
有益效果本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn) (1)本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方，根據(jù)中醫(yī)藥理論和婦科疾病的發(fā)病機(jī)制選取原料配伍組方，各組份配比科學(xué)合理，并根據(jù)組方各藥味化學(xué)成分的性質(zhì)特點(diǎn)，對(duì)整方進(jìn)行提取，并對(duì)提取物通過(guò)現(xiàn)代分離純化手段進(jìn)行去粗存精，根據(jù)現(xiàn)代分析方法和藥理篩選結(jié)果表明，所得的有效部位活性成分更明確，具有很好的活血化瘀、止痛、緩和婦科炎癥、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌紊亂的作用，且起效快、標(biāo)本兼治、不易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期使用無(wú)不良反應(yīng)，且本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方可以方便的和藥學(xué)上可接受的載體制備成各種劑型的藥物，方便臨床服用。
(2)本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的制備方法，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選確定最佳提取和分離工藝，可操作性強(qiáng)，提取、分離純化效率高，且制備方法成本低、環(huán)保、可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。

具體實(shí)施例方式 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例1 一種具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的方法，其制備方法為 (1)按比例稱取處方藥材當(dāng)歸10份、川芎3份、赤芍8份、蒲黃10份、五靈脂8份、沒(méi)藥5份、延胡索5份，經(jīng)粉碎至粒徑為40目，混合，用水煎煮提取2次，第一次加總藥材10倍量水煎煮1.5h，第二次加總藥材8倍量水煎煮1h，合并兩次煎出液，濃縮至1g生藥/ml，得濃縮液； (2)用濃度為95％乙醇調(diào)步驟(1)得到的濃縮液至乙醇濃度為80％，放置12h，過(guò)濾沉淀，取上清液，濃縮至5kg，得濃縮物； (3)取步驟(2)得到的濃縮物上D101大孔吸附樹(shù)脂柱，靜置12h后，分別用純水、濃度為10％～95％的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集濃度40％～50％乙醇洗脫部位，濃縮，即得具有治療婦科疾病的中藥復(fù)方有效部位。(批號(hào)001) 經(jīng)過(guò)HPLC/HPLC-MS分析，中藥復(fù)方有效部位中黃酮類、萜苷類、內(nèi)酯類、有機(jī)酸類四類化合物重量百分組成為9％的機(jī)酸類；28％的黃酮類；32％的內(nèi)酯類；20％的萜苷類化合物。
實(shí)施例2 一種具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的方法，其制備方法為 (1)取由當(dāng)歸30份、川芎10份、赤芍15份、蒲黃50份、五靈脂15份、沒(méi)藥10份、延胡索10份組成的中藥復(fù)方，混合，經(jīng)粉碎至粒徑為40目，用濃度為30％乙醇回流提取3次，第一次加8倍量30％乙醇回流2h，第二次加6倍量30％乙醇回流2h，第三次加6倍量30％乙醇回流1.5h，合并提取液，在50～70℃減壓濃縮得濃縮液6kg； (2)取步驟(1)得到的濃縮液加入乙醇，使乙醇的濃度達(dá)到70％，放置沉淀，分離上清液，濃縮，得濃縮物； (3)取步驟(2)得到的濃縮物上D102型大孔吸附樹(shù)脂柱，用濃度10％至95％的乙醇梯度洗脫，收集30％～40％乙醇洗脫部位，回收溶劑，即得具有治療婦科疾病的中藥復(fù)方有效部位。(批號(hào)002) 經(jīng)過(guò)HPLC/HPLC-MS分析，中藥復(fù)方有效部位中黃酮類、萜苷類、內(nèi)酯類、有機(jī)酸類四類化合物重量百分組成為7.6％的機(jī)酸類；26％的黃酮類；31％的內(nèi)酯類；30％的萜苷類化合物。
取以上制備得到的有效部位10g，加入藥用淀粉16g，混合均勻，加水制成軟材，過(guò)20目篩制粒，干燥，制成顆粒，裝入膠囊，每粒0.2g，或者取有效部位10g玉米淀粉20g，加入潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂5g，混合均勻，然后壓片制成片劑。
實(shí)施例3 一種具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的方法，其制備方法為 (1)取由當(dāng)歸50份、川芎20份、赤芍25份、蒲黃50份、五靈脂20份、沒(méi)藥10份、延胡索10份組成的中藥復(fù)方，混合，經(jīng)粉碎至粒徑為40目，用濃度為70％乙醇回流提取2次，第一次加10倍量70％乙醇回流2h，第二次加8倍量70％乙醇回流1.5h，合并提取液，在50～70℃減壓濃縮得濃縮液7kg； (2)取步驟(1)得到的濃縮液加入乙醇，使乙醇的濃度達(dá)到90％，放置沉淀，分離上清液，濃縮，得濃縮物； (3)取步驟(2)得到的濃縮物上AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱，靜置12h后，分別用純水、10％～95％的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集40％～60％乙醇洗脫部位，回收溶劑，即得具有治療婦科疾病的中藥復(fù)方有效部位。(批號(hào)003) 經(jīng)過(guò)HPLC/HPLC-MS分析，中藥復(fù)方有效部位中黃酮類、萜苷類、內(nèi)酯類、有機(jī)酸類四類化合物重量百分組成為8％的機(jī)酸類；23％的黃酮類；33％的內(nèi)酯類；35％的萜苷類化合物。
取以上制備得到的有效部位15g，加入藥用淀粉30g，混合均勻，加水制成軟材，過(guò)20目篩制粒，干燥，整粒，制成顆粒劑，或者取有效部位15g玉米淀粉30g，加入潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂6g，混合均勻，然后壓片制成片劑。
實(shí)施例4 一種具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的方法，其制備方法為 (1)取由當(dāng)歸30份、川芎5份、赤芍15份、蒲黃30份、五靈脂15份、沒(méi)藥5份、延胡索5份組成的中藥復(fù)方，混合，經(jīng)粉碎至粒徑為40目，用水回流提取2次，第一次加10倍量水回流3h，第二次加8倍量水回流2h，合并提取液，在50～70℃減壓濃縮得濃縮液6kg； (2)取步驟(1)得到的濃縮液加入乙醇，使乙醇的濃度達(dá)到80％，放置沉淀，分離上清液，濃縮，得濃縮物； (3)取步驟(2)得到的濃縮物上D101型大孔吸附樹(shù)脂柱，靜置12h后，分別用純水、10％～95％的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集20％～60％乙醇洗脫部位，回收溶劑，即得具有治療婦科疾病的中藥復(fù)方有效部位。(批號(hào)004) 經(jīng)過(guò)HPLC/HPLC-MS分析，中藥復(fù)方有效部位中黃酮類、萜苷類、內(nèi)酯類、有機(jī)酸類四類化合物重量百分組成為6％的機(jī)酸類；20％的黃酮類；21％的內(nèi)酯類；30％的萜苷類化合物。
實(shí)施例5 一種具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的方法，其制備方法為 (1)取由當(dāng)歸40份、川芎10份、赤芍30份、蒲黃30份、五靈脂20份、沒(méi)藥10份、延胡索10份組成的中藥復(fù)方，混合，經(jīng)粉碎至粒徑為40目，用濃度30％乙醇回流提取2次，第一次加10倍量30％乙醇回流3h，第二次加8倍量30％乙醇回流2h，合并提取液，在50～70℃減壓濃縮得濃縮液7.5kg； (2)取步驟(1)得到的濃縮液加入乙醇，使乙醇的濃度達(dá)到90％，放置沉淀，分離上清液，濃縮，得濃縮物； (3)取步驟(2)得到的濃縮物上D102型大孔吸附樹(shù)脂柱，靜置12h后，分別用純水、10％～95％的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集30％～70％乙醇洗脫部位，回收溶劑，即得具有治療婦科疾病的中藥復(fù)方有效部位。(批號(hào)005) 經(jīng)過(guò)HPLC/HPLC-MS分析，中藥復(fù)方有效部位中黃酮類、萜苷類、內(nèi)酯類、有機(jī)酸類四類化合物重量百分組成為7％的機(jī)酸類；21％的黃酮類；28％的內(nèi)酯類；26％的萜苷類化合物。
實(shí)施例6鎮(zhèn)痛抗炎試驗(yàn) 1、小鼠原發(fā)性痛經(jīng)試驗(yàn) (1)小鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型的制備與實(shí)驗(yàn) 選用KM種雌性、體重18-22g的雌性小鼠，隨機(jī)分組，以雌激素和縮宮素聯(lián)合復(fù)制原發(fā)性痛經(jīng)模型。以0.01mg·g-1·d-1給小鼠連續(xù)sc苯甲酸雌二醇8d，使小鼠子宮同步化，第8天，ip縮宮素0.01mL·g-1，制造小鼠原發(fā)性痛經(jīng)動(dòng)物模型。
檢測(cè)指標(biāo)扭體反應(yīng)。
給藥方法將小鼠隨機(jī)分成模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組(西樂(lè)葆)、實(shí)施例1制備得到的批號(hào)001有效部位的大、小劑量組；實(shí)施例2制備得到的批號(hào)002有效部位的大、小劑量組；實(shí)施例3制備得到的批號(hào)003有效部位的大、小劑量組。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予等容積生理鹽水，陽(yáng)性藥物對(duì)照組給予西樂(lè)葆0.0411mg·g-1·d-1，有效部位給藥37.0g生藥/kg、18.5g生藥/kg為大、小劑量組，各組小鼠每組10只。按上述方法復(fù)制原發(fā)性痛經(jīng)模型。從第6天起，每日上午腹腔注射苯甲酸雌二醇，下午正常對(duì)照組給予生理鹽水0.4mL/只，其余各組灌胃相應(yīng)藥物。連續(xù)3d，于末次給藥后60min，ip縮宮素0.2mL/只，記錄注射后20min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)及扭體反應(yīng)抑制率。
(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 由表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位在大、小劑量下，均具有顯著的抑制小鼠扭體反應(yīng)的作用(P＜0.05或P＜0.01)；抑制率均在50％以上，結(jié)果表明本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位具有很好的鎮(zhèn)痛作用，強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥西樂(lè)葆。
表1中藥復(fù)方有效部位對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠扭體的抑制作用

與模型組相比較，*P＜0.05；**P＜0.01 2、對(duì)小鼠離體子宮收縮的抑制作用 (1)小鼠離體子宮收縮實(shí)驗(yàn) 取未孕雌性小鼠，體重18-22g；實(shí)驗(yàn)前連續(xù)3天腹腔注射苯甲酸雌二醇1mg·kg-1·d-1，以同步化子宮并增加子宮對(duì)縮宮素的敏感性。于第4日取出小鼠子宮，置于Locke’s溶液中清洗，用細(xì)線分別扎住子宮頸端及兩側(cè)卵巢端，一端固定于浴槽底部，另一端連接在張力換能器上。置于20ml Locke’s液恒溫浴槽中，溫度為(37±0.1)℃，持續(xù)供氧，pH 7.3，通過(guò)調(diào)節(jié)螺母加1g的負(fù)荷(10mN)，平衡40min，待子宮收縮穩(wěn)定，自發(fā)節(jié)律恢復(fù)后，開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
預(yù)先記錄5-10min正常收縮曲線，繼加入縮宮素注射劑10μl，終濃度為5ul/L，作用15min后再加入各受試藥物(實(shí)施例1至3制備得到的中藥復(fù)方有效部位，批號(hào)001、002和003)，各樣品受試藥物加入的初始濃度均為10mg/ml，1L浴槽中受試藥物的終濃度為0.01mg/ml，觀察藥物對(duì)縮宮素引起子宮痙攣性收縮的抑制作用，采用T檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)給藥前及給藥后子宮的收縮頻率及收縮幅度，計(jì)算抑制子宮收縮的百分率(IR％)。計(jì)算公式IR(％)＝(給藥前參數(shù)-給藥后參數(shù))/給藥前參數(shù)×100。
(2)數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間相關(guān)指標(biāo)采用兩兩比較t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。
(3)對(duì)小鼠離體子宮收縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示 ①對(duì)小鼠離體子宮平滑肌收縮頻率的影響 由表2中可看出本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位對(duì)子宮平滑肌收縮頻率均具有顯著的抑制活性(P＜0.01或P＜0.05)。
②對(duì)小鼠離體子宮平滑肌收縮幅度的影響 由表2中可看出本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位對(duì)小鼠離體子宮平滑肌收縮幅度具有顯著的抑制活性(P＜0.01)。
③對(duì)小鼠離體子宮平滑肌肌張力的影響 由表2中可看出本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位對(duì)小鼠離體子宮平滑肌肌張力具有顯著的抑制活性(P＜0.05或P＜0.01)。
綜合分析離體子宮收縮的3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)表明，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位對(duì)抑制子宮收縮呈現(xiàn)顯著活性。其ED50為128.0μg/ml，95％可信區(qū)間為104.2μg/ml～165.9μg/ml。
表2中藥復(fù)方有效部位對(duì)小鼠離體子宮收縮的影響結(jié)果
3、小鼠甲醛致炎試驗(yàn) (1)甲醛致炎模型的制備 取80只小鼠隨機(jī)分成8組，每組10只，對(duì)照組、模型組、實(shí)施例1批號(hào)001有效部位大、小劑量組；實(shí)施例2批號(hào)002有效部位大、小劑量組；實(shí)施例3批號(hào)003有效部位大、小劑量組。對(duì)照組、模型對(duì)照組給予等容體生理鹽水，復(fù)方提取物組劑量分別為37.0g·Kg-1·d-1，為生藥量。給藥1h后在右后足墊皮下注射2.5％甲醛生理鹽水20μL，4h后，將小鼠斷頭處死，之后自膝關(guān)節(jié)切足，稱重，比較左右足差異，以此代表炎癥程度。
(2)抗小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示 由表3可知，中藥復(fù)方有效部位的大劑量均具有顯著的抑制甲醛所致小鼠足腫脹作用(P＜0.05)，抑制率可達(dá)50％以上，效果強(qiáng)于陽(yáng)性藥，表明所發(fā)明的中藥復(fù)方有效部位可顯著抑制皮下注射甲醛引起的水腫。
表3中藥復(fù)方有效部位抗足腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果
與模型組相比較，*P＜0.05；**P＜0.01 (3)對(duì)甲醛致小鼠足腫脹組織中PGE2含量的影響 將剪下的小鼠右足，剝皮后浸泡于1mL生理鹽水中1h，以2000r/min離心10min，吸取上清液0.2mL，加入0.5mol/L NaOH-CH3OH溶液1mL，在50℃水浴中異構(gòu)化20分鐘，加甲醇稀釋到10mL，于278nm處測(cè)定其吸收值，并按下述公式計(jì)算PGE2含量 PGE2含量(μg/g)＝(E278×13.13×Vt×D)/W 計(jì)算各組間差異[注Vt＝PGE2浸泡液總體積，D＝稀釋倍數(shù)，W＝右下肢重量(g)，E278＝278nm處的吸收值]。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
表4中藥復(fù)方有效部位對(duì)甲醛致小鼠足腫脹組織中PGE2含量的影響
與模型組相比較，*P＜0.05；**P＜0.01 由表4可知，所發(fā)明的中藥復(fù)方有效部位對(duì)致炎組織中所含PGE2具有非常顯著的抑制作用，表明可降低炎癥組織中的炎癥因子的合成與釋放，PGE2含量越低，其抗炎作用越顯著。
由以上鎮(zhèn)痛抗炎試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位具有很好的鎮(zhèn)痛和抗炎效果，且起效迅速，未見(jiàn)不良反應(yīng)，可用于治療婦科慢性盆腔炎疾病。
實(shí)施例7改善血液流變學(xué)及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌激素試驗(yàn) 1、急性血瘀SD大鼠模型的制備與實(shí)驗(yàn) 正常組常規(guī)飼養(yǎng)，模型組、治療組大鼠置于0℃～1℃冰水中5min，每日1次，連續(xù)七天。中藥復(fù)方有效部位治療組于造模的第1天開(kāi)始，按大、小劑量中藥復(fù)方各樣品灌胃，每日1次，連用7天，正常組、模型組給予同體積的蒸餾水。于第8天皮下注射0.1％腎上腺素0.1ml/100g，共2次，兩次間隔時(shí)間4h。之后停食，于次晨采用全自動(dòng)流變快測(cè)儀測(cè)定血流變學(xué)指標(biāo)；采用放射免疫的方法測(cè)定血清中激素水平。
2、對(duì)大鼠急性血瘀模型全血粘度的影響 由表5可見(jiàn)，與模型組相比，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位在高、低劑量均明顯降低全血粘度作用(P＜0.01或P＜0.05)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。
表5中藥復(fù)方有效部位對(duì)全血黏度的影響
與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01 3、對(duì)急性血瘀模型大鼠血漿粘度、血沉、紅細(xì)胞壓積的影響 與模型組相比，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位能明顯降低血漿黏度、血沉、紅細(xì)胞壓積(P＜0.01或P＜0.05)，但對(duì)纖維蛋白原含量未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05)。高劑量組具有明顯改善血沉、紅細(xì)胞壓積的作用(P＜0.05)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。
表6中藥復(fù)方有效部位對(duì)大鼠血漿粘度、血沉及紅細(xì)胞壓積的影響
#P＜0.05與對(duì)照組相比；*P＜0.05，**P＜0.01與模型組相比 4、對(duì)急性血瘀模型大鼠血清中E2和P含量的影響 與模型組相比，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位高、低劑量組均明顯或顯著降低血清中E2的升高(P＜0.001或P＜0.01)；而對(duì)孕酮含量均呈現(xiàn)升高作用(P＜0.05，P＜0.01)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。
表7中藥復(fù)方有效部位對(duì)寒凝血瘀型大鼠血清中內(nèi)分泌激素水平的影響 ##P＜0.01與對(duì)照組相比；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與模型組相比 由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位具有很好的活血化瘀，改善血液循環(huán)，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌混亂，恢復(fù)內(nèi)分泌正常的作用，從而可以用于治療血瘀所致的痛經(jīng)或子宮內(nèi)膜異位癥等婦科疾病。
實(shí)施例8調(diào)節(jié)免疫功能試驗(yàn) 1、對(duì)小鼠脾T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法) 各組動(dòng)物連續(xù)灌胃30天，頸椎脫臼處死動(dòng)物，無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)菌Hank’s液的平皿中，輕輕將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，用Hank’s液洗滌2次，每次離心10分鐘計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95％以上)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液(相當(dāng)于715μg/ml)，另一孔作對(duì)照。置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔輕輕吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT(5mg/ml)50μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。將溶解液移入2ml比色杯中，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值(OD)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位具有很好的促進(jìn)脾T淋巴細(xì)胞增殖的作用，從而可以起到提高免疫力的作用。
2、對(duì)小鼠靜息脾淋巴細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表8實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，與空白對(duì)照組(生理鹽水)比較，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位可明顯增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能(P＜0.01或P＜0.05或P＜0.001)，具有促進(jìn)靜息皮細(xì)胞的增殖反應(yīng)，提高免疫力的作用。
表8中藥復(fù)方有效部位對(duì)小鼠靜息脾淋巴細(xì)胞的影響
與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001. 3、對(duì)ConA誘導(dǎo)的活化脾T淋巴細(xì)胞增殖和ConA誘導(dǎo)的IFN-γ試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位在200μg/ml時(shí)和DMSO對(duì)照組相比具有明顯抑制ConA誘導(dǎo)的活化T細(xì)胞的增殖作用(P＜0.01)，和具有明顯抑制ConA誘導(dǎo)的IFN-γ炎性因子的產(chǎn)生(P＜0.01)進(jìn)一步表明本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位具有很好的調(diào)節(jié)免疫功能的活性。
本發(fā)明根據(jù)中醫(yī)藥理論辨證施治，根據(jù)婦科疾病的發(fā)病機(jī)理，進(jìn)行科學(xué)組方，并采用優(yōu)選的提取純化方法制備得到中藥復(fù)方有效部位，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位具有很好的抗子宮平滑肌痙攣、鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)雌激素、孕激素水平、調(diào)節(jié)免疫功能等活性，可用于治療多種婦科疾病，包括原發(fā)性痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥、急慢性盆腔炎等婦科疾病，并且由于去掉了大量非活性物質(zhì)，有效部位中有效成分更清楚，含量更高，臨床上用藥更少、更安全，不良反應(yīng)更低，因此本發(fā)明提供的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有望開(kāi)發(fā)成為新一代防治婦科疾病的藥物。
權(quán)利要求
1.一種具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位，其特征在于，它由下列重量份數(shù)的原料制成
當(dāng)歸10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黃10-50份、五靈脂8-35份、沒(méi)藥3-20份、延胡索3-20份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位，其特征在于，它由下列重量份數(shù)的原料制成
當(dāng)歸30-50份、川芎5-15份、赤芍15-30份、蒲黃30-50份、五靈脂15-30份、沒(méi)藥5-15份、延胡索5-15份。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的方法，其特征在于包括以下步驟
(1)取由當(dāng)歸10-50份、川芎3-20份、赤芍8-35份、蒲黃10-50份、五靈脂8-35份、沒(méi)藥3-20份、延胡索3-20份組成的中藥復(fù)方，加入總藥材5～10倍量的水或醇水提取，合并提取液在20～70℃減壓濃縮得濃縮液；
(2)取步驟(1)得到的濃縮液加入乙醇，使乙醇的濃度達(dá)到70～90％，放置沉淀，分離上清液，濃縮，得濃縮物；
(3)取步驟(2)得到的濃縮物上大孔吸附樹(shù)脂柱，用濃度20％至70％的乙醇梯度洗脫，洗脫液回收溶劑，得中藥復(fù)方有效部位。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的制備方法，其特征在于，步驟(1)中提取溶劑醇水中乙醇濃度為0-80％，提取次數(shù)為1～3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的大孔吸附樹(shù)脂為D101、D102或AB-8型大孔吸附樹(shù)脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的制備方法，其特征在于，步驟(3)得到的中藥復(fù)方有效部位中包含有重量百分比20～90％的有機(jī)酸類、黃酮類、內(nèi)酯類和萜苷類四類化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位的制備方法，其特征在于，步驟(3)得到的中藥復(fù)方有效部位中包含有重量百分比1.5％～9.5％的有機(jī)酸類；1％～30％的黃酮類；1％～40％的內(nèi)酯類；13％～40％的萜苷類化合物。
8.權(quán)利要求1或2所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位在制備治療婦科疾病藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位在制備治療婦科疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的婦科疾病為婦女痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥或慢性盆腔炎疾病。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位在制備治療婦科疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于把中藥復(fù)方有效部位和藥學(xué)上可接受的載體制成膠囊劑、顆粒劑、噴霧劑、注射劑、微囊、片劑、軟膏劑或透皮控釋貼劑劑型的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有治療婦科疾病作用的中藥復(fù)方有效部位及其制備方法和其應(yīng)用，該有效部位是由當(dāng)歸、川芎、赤芍、蒲黃、五靈脂、沒(méi)藥、延胡索組成的中藥復(fù)方的水或乙醇提取液，通過(guò)乙醇沉淀去雜，然后上大孔吸附樹(shù)脂柱，用優(yōu)化濃度的乙醇梯度洗脫純化，制備得到。本發(fā)明根據(jù)中醫(yī)藥理論和婦科疾病發(fā)病機(jī)制選取原料配伍組方，通過(guò)現(xiàn)代分析儀器和藥理實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方有效部位具有很好的抗子宮平滑肌痙攣、鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)雌激素、孕激素水平、調(diào)節(jié)免疫功能等活性，可用于治療原發(fā)性痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥、急慢性盆腔炎等多種婦科疾病，且成分更清楚，不良反應(yīng)更低，有望開(kāi)發(fā)成為新一代治療婦科疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61K35/24GK101829247SQ20101017717
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者宿樹(shù)蘭, 段金廒, 錢大瑋, 華永慶, 洪敏 , 周衛(wèi) 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)