專利名稱：抗Titin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗Titin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
重癥肌無力個(gè)體中，約85%的患者體內(nèi)存在針對AChR分子的自身抗體，致病性自身抗體的主要結(jié)合靶點(diǎn)位于AChR分子亞單位上的主要免疫原性區(qū)(main immunogenic region, MIR)。依賴抗體的補(bǔ)體溶解作用是AChR分子破壞的主要原因；同時(shí)抗體介導(dǎo)的抗原調(diào)變作用也加速了 AChR分子的內(nèi)化和溶酶體的降解作用，使得AChR分子的半衰期由 7d降至2d，體內(nèi)神經(jīng)突觸后膜上功能性AChR分子的數(shù)量急劇減少。在單純眼外肌型患者體內(nèi)，僅有50%的血清學(xué)陽性率，而這些患者自身性抗體的主要結(jié)合靶點(diǎn)是胎兒型AChR分子。胎兒型AChR分子與成人型AChR分子最大的區(qū)別是AChR五聚體分子中的亞單位替代了 t亞單位。胎兒型AChR分子主要分布于眼外肌，因此這類自身抗體導(dǎo)致了患者單純眼外肌受累，而無其它相關(guān)臨床癥狀出現(xiàn)。重癥肌無力患者血清中除乙酰膽堿受體抗體(AchRab) 外，還可以檢測到其他自身抗體。如抗肌動蛋白(actin)抗體、肌球蛋白(myosin)抗體、輔肌動蛋白(α-actinin)抗體、肌聯(lián)蛋白(titin)抗體、AChR分子相關(guān)瞄定蛋白(mpsyn)抗體和肌肉特異性酪氨酸激酶(muscle specific tyrosine kinase Musk)抗體等。在這些自身抗體中，尤其是Titin在重癥肌無力伴胸腺瘤患者和重癥肌無力晚期中與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[5-7]。調(diào)節(jié)性T (Treg)細(xì)胞在自身免疫性疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用?，F(xiàn)有研究已證實(shí)腫瘤組織局部表現(xiàn)為Treg細(xì)胞免疫功能抑制，激活Treg細(xì)胞可導(dǎo)致動物移植腫瘤消退；而在自身免疫性疾病中Treg細(xì)胞免疫功能過度激活。因而抑制Treg細(xì)胞功能可能是自身免疫性疾病治療的新方法。篩選和鑒定抗原特異性Treg細(xì)胞是免疫治療的前提和基礎(chǔ)。重癥肌無力中95%的患者外周血可檢測到抗Titin抗體，表明Titin在重癥肌無力患者中是優(yōu)勢識別抗原，提示重癥肌無力患者中存在Titin特異性Treg細(xì)胞，可從Titin 蛋白分子中篩選和鑒定抗原特異性Treg細(xì)胞識別的抗原線性表位。Titin是個(gè)巨大的微絲狀蛋白質(zhì)，在橫紋肌中單一的Titin跨越半個(gè)肌小節(jié)。Titin從Z-盤狀轉(zhuǎn)變?yōu)镸-線狀在肌肉結(jié)構(gòu)、功能和發(fā)育過程中起重要作用。微陣列和芯片診斷技術(shù)具有同時(shí)對幾十個(gè)，乃至數(shù)萬個(gè)基因或蛋白質(zhì)進(jìn)行分析， 不僅大大減少了分別檢測的人力和物力，而且同時(shí)分析時(shí)克服了實(shí)驗(yàn)室的檢測誤差。本研究采用生物信息學(xué)的手段，在微陣列檢測的基礎(chǔ)上，分別對單個(gè)表位抗體的診斷有效性進(jìn)行評估，通過對其有效性的不斷擬合，克服了單個(gè)檢測得的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供抗Titin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位及
其應(yīng)用?？筎itin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位是具有下列所示的氨基酸序列位于抗原的103-115位點(diǎn)、76-187位點(diǎn)、13211-13227位點(diǎn)，多肽序氨基酸序列分別為 CEQffVDYNLKffNPD,IVTHFPFDEQNC,EIIVTHFPFDEQNCSMK?？筎itin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位的應(yīng)用用于制備重癥肌無力藥物及診斷試劑盒。本發(fā)明通過微陣列和芯片診斷技術(shù)篩選有效性好的抗Titin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位，進(jìn)而可以通過化學(xué)合成或基因工程表達(dá)重組的方法制備相應(yīng)多肽，并用多肽制備抗體作為探針，開發(fā)重癥肌無力藥物及診斷試劑。上述方法克服了傳統(tǒng)抗原抗體制備方法及藥物篩選方法的繁瑣，不僅大大減少了分別檢測的人力和物力，而且同時(shí)分析時(shí)克服了實(shí)驗(yàn)室的檢測誤差，本研究采用生物信息學(xué)的手段，在微陣列檢測的基礎(chǔ)上，分別對單個(gè)表位抗體的診斷有效性進(jìn)行評估，通過對其有效性的不斷擬合，克服了單個(gè)檢測得的不足，并篩選出P5、P6、P9優(yōu)勢抗原表位，為重癥肌無力相關(guān)疾病治療和血清學(xué)診斷開辟了新路。根據(jù)生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)9條針對Titin蛋白胞外區(qū)多肽序列，并與牛血清白蛋白(BSA)的氨基端偶聯(lián)、點(diǎn)制蛋白質(zhì)微陣列、檢測蛋白質(zhì)微陣列、對微陣列檢測陽性結(jié)果分別用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法進(jìn)行驗(yàn)證。


圖1是重癥肌無力患者血清針對P1-P9多肽自身抗體陽性例數(shù)；圖2是本發(fā)明的P5、P6和P9識別表位交叉性鑒定；圖3是本發(fā)明的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)驗(yàn)證試驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式抗Titin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位是具有下列所示的氨基酸序列位于抗原的103-115位點(diǎn)、76-187位點(diǎn)、13211-13227位點(diǎn)，多肽序氨基酸序列分別為 CEQffVDYNLKffNPD, IVTHFPFDEQNC,EIIVTHFPFDEQNCSMK?？筎itin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位的應(yīng)用用于制備重癥肌無力藥物及診斷試劑盒。實(shí)施例1 多肽設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)偶聯(lián)根據(jù)生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)9條針對Titin蛋白胞外區(qū)多肽序列見表1。多肽合成采用固相合成法(SPPS)，合成后的多肽再采用琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷 (SMCC)雙功能交聯(lián)劑在多肽巰基端與牛血清白蛋白(BSA)的氨基端偶聯(lián)。表1.合成多肽序列
權(quán)利要求
1.抗Titin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位，其特征在于具有下列所示的氨基酸序列 位于抗原的103-115位點(diǎn)、76-187位點(diǎn),13211-13227位點(diǎn)，多肽序氨基酸序列分別為 CEQffVDYNLKffNPD,IVTHFPFDEQNC,EIIVTHFPFDEQNCSMK。
2.如權(quán)利要求1所述的抗Titin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位的應(yīng)用，其特征在于用于制備重癥肌無力藥物及診斷試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗Titin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位。它具有下列所示的氨基酸序列位于抗原的103-115位點(diǎn)、76-187位點(diǎn)、13211-13227位點(diǎn)，多肽序氨基酸序列分別為CEQWVDYNLKWNPD、IVTHFPFDEQNC、EIIVTHFPFDEQNCSMK?？筎itin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位用于制備重癥肌無力藥物及診斷試劑盒。本發(fā)明通過微陣列和芯片診斷技術(shù)篩選有效性好的抗Titin抗體識別的優(yōu)勢抗原表位，進(jìn)而可以通過化學(xué)合成或基因工程表達(dá)重組的方法制備相應(yīng)多肽，并用多肽制備抗體作為探針，開發(fā)重癥肌無力藥物及診斷試劑。上述方法克服了傳統(tǒng)抗原抗體制備方法及藥物篩選方法的繁瑣，不僅大大減少了分別檢測的人力和物力，而且同時(shí)分析時(shí)克服了實(shí)驗(yàn)室的檢測誤差，為重癥肌無力相關(guān)疾病治療和血清學(xué)診斷開辟了新路。
文檔編號A61P21/04GK102153625SQ201010206028
公開日2011年8月17日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者方序, 王軼雄, 羅陳啟, 聞樹群, 陳敏 申請人:浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司