專利名稱：朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷i的提取方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淫羊藿為小檗科植物淫羊藿(Epim edium brevi2cornum Maximl)、箭葉淫羊藿 [El sagitta tum(Sieblet Zuecl)Maximl](El pubescen sMax2iml)
羊藿(El wushanense Tl Sl Ying)或朝鮮淫羊藿(Elkoreanam Nakai)的干燥地上部分， 具補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕之功效，常用于治療陽痿不舉、小便淋漓、腰膝無力以及冠 心病、慢性氣管炎、神經(jīng)衰弱和小兒麻痹等癥。現(xiàn)代化學(xué)成分研究顯示，淫羊藿的主要有效成份是淫羊藿總黃酮(淫羊藿苷、淫 羊藿次苷)和淫羊藿多糖，其總黃酮中的活性成分被認(rèn)為是8位具有異戊烯基(及其衍生 基團(tuán))的黃酮醇及其苷類。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿黃酮具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)雄性生殖功能，擴(kuò) 張血管，改善血液流變學(xué)，促進(jìn)造血系統(tǒng)功能，抗氧化輻射，抗骨質(zhì)疏松等多種功效。近年 來，對淫羊藿苷的口服代謝研究表明，在腸道菌群的作用下，淫羊藿苷主要代謝成次苷和苷 元，原型的生物利用度低。淫羊藿次苷I是淫羊藿苷的體內(nèi)代謝產(chǎn)物之一，Lenoble等報道 了淫羊藿次苷I對PDE-25酶具有很好的抑制作用。目前，對淫羊藿總黃酮的提取工藝及淫羊藿苷的分離提取、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)確證等 研究已有大量報道，但對淫羊藿次苷I的提取方法研究甚少。國內(nèi)常以水或乙醇為溶劑(張琳，張瑾，現(xiàn)代中藥研究與實踐Vol. 18(5)2004， 63-64)提取淫羊藿中總黃酮；采用柱色譜法(鄭訓(xùn)海等，中草藥=Vol. (11)2002,964-967) 對淫羊藿中不同化學(xué)成分進(jìn)行分離。國外也有采用柱色譜法分離提取淫羊藿次苷的報道 (Lenoble, et al. “ Compositions comprising icariside I and anhydroicaritin and methods for making the same " Unit States Patent 2002 (6399579)) 。fefei普^屯U 黃酮類化合物存在由不可逆吸附導(dǎo)致產(chǎn)率低的缺點，而且分離過程十分耗時、耗力，不利于 黃酮化合物的大量分離提取。因此，雖然對淫羊藿中各類黃酮化合物的研究十分迫切，但由 于分離提取困難，研究進(jìn)展十分緩慢。

發(fā)明內(nèi)容
為了消除因為柱色譜分離純化黃酮類化合物存在由不可逆吸附導(dǎo)致產(chǎn)率低，而且 分離過程十分耗時、耗力，不利于黃酮化合物的大量分離提取的缺點，本發(fā)明提供了朝鮮淫 羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法及應(yīng)用，不僅可以避免因為色譜柱的的不可逆吸附而導(dǎo) 致產(chǎn)率低，而且可以大量提取高純度的淫羊藿次苷I，從而更加推動了對其研究的進(jìn)展。本發(fā)明的目的是提供朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，其步驟和條件如 下a將朝鮮淫羊藿葉用是其質(zhì)量15倍的體積濃度為70%乙醇回流4小時，濾出乙醇
3提取液，將回流過的藥渣用是朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量10倍的體積濃度為70%乙醇回流提取2小 時，濾出乙醇提取液，合并兩次濾液；b濾液在50°C下減壓蒸出溶劑，得到提取物，提取物中所含的水分不多于其質(zhì)量 的5% ；c用朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量2倍的無水乙醇溶解步驟b中所得到的提取物，加入濃鹽 酸，朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量克濃鹽酸的體積HiL為1 0. 05 0. 15，在50°C水浴加熱15 25 小時，室溫放置過夜，過濾；d濾液在50°C減壓濃縮至其體積的20%，加入朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量2倍的蒸餾水析 出沉淀，沉淀在50°C下用體積濃度為20%的乙醇溶液洗滌，洗滌后的沉淀在50°C下真空干 燥，得到淫羊藿次苷I粉末。本發(fā)明的淫羊藿次苷I具有對垂體后葉素誘發(fā)大鼠心肌缺血的保護(hù)作用。其具體 表現(xiàn)在可以抑制T波的作用；可以抑制J點位移變化的作用。還證實淫羊藿次苷I對豚鼠 離體心臟有保護(hù)作用。其具體表現(xiàn)在可以增加豚鼠的冠脈流量，具體見實施例8-9。本發(fā)明的朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的應(yīng)用，其用于制備治療心臟病的藥物。有益效果本發(fā)明提供了朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，不僅可以避 免因為色譜柱的的不可逆吸附而導(dǎo)致產(chǎn)率低，而且可以大量提取高純度的淫羊藿次苷I，從 而更加推動了對其研究的進(jìn)展。本發(fā)明提供了朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法。經(jīng)高效液相色譜法含量 測定，淫羊藿次苷I的質(zhì)量提取率在60%以上，質(zhì)量易控，方法簡便快速。本發(fā)明對淫羊藿次苷I進(jìn)行了藥理方面的研究，證實淫羊藿次苷I具有對垂體后 葉素誘發(fā)大鼠心肌缺血的保護(hù)作用。其具體表現(xiàn)在可以抑制T波的作用；可以抑制J點位 移變化的作用。淫羊藿次苷I對豚鼠離體心臟有保護(hù)作用。其具體表現(xiàn)在可以增加豚鼠的 冠脈流量。本發(fā)明的朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的應(yīng)用，其用于制備治療心臟病的藥物。


圖1實施例1的總黃酮含量測定的HPLC譜圖。圖2為實施例2的200-600nm波長范圍內(nèi)的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品的掃描圖。圖3為實施例3的標(biāo)準(zhǔn)品淫羊藿苷在270nm下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為實施例4所得到的淫羊藿次苷I單體200-800nm的紫外掃描圖。圖5為實施例5所得到的淫羊藿次苷I的HPLC譜圖。圖6為實施例6所得到的淫羊藿次苷I的HPLC譜圖。圖7為實施例7所得到的淫羊藿次苷I的HPLC譜圖。上述圖1、圖5-圖7中的液相條件如下梯度洗脫波長272nm，流速lml/min，柱溫30°C，色譜柱采用ODS-C18填料色譜 柱(4. 6 X 250mm, 5 μ m)島津公司
時間(min)
0102025303545505具體實施例方式實施例1稱取朝鮮淫羊藿葉5克，用75mL體積濃度為70%乙醇回流4小時，濾出乙醇提取 液，將回流過的藥渣用50mL的體積濃度為70%乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提取液，合 并兩次濾液，將濾液定溶至200mL。精密量取0. 2mL濾液定溶至25mL的容量瓶中，在270nm 下測定吸光度值為0. 730 ；取IOuL該溶液測其HPLC色譜圖，HPLC色譜圖結(jié)果見附圖1。實施例2取2. 30mg淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中，用甲醇定溶，其濃度為0. 092mg/mL 的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。在200 600nm下進(jìn)行紫外掃描，270nm為淫羊藿苷最大吸光度值。 結(jié)果見附圖2。實施例3根據(jù)實施例2制備濃度為0. 092mg/mL的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取此標(biāo)準(zhǔn)溶 液1. OmLU. 5mL、2. OmL,2. 5mL、3. OmL于5mL的容量瓶中，甲醇定溶，配置成濃度分別為 0. 0184mg/mL、0. 0276mg/mL、0. 0368mg/mL、0. 0460mg/mL、0. 0552mg/mL 的溶液，測定其吸光 度值。繪制淫羊藿苷濃度相對于吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出，實施例1中 朝鮮淫羊藿總黃酮的提取率可達(dá)12%。結(jié)果見附圖3。實施例4用質(zhì)量含量為99 %以上的淫羊藿次苷I單體配置濃度分別為0. 0404mg/mL、 0. 1212mg/mL、0. 2020mg/mL、0. 2828mg/mL、0. 3636mg/mL 的淫羊藿次苷 I 標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取 IOuL進(jìn)行高效液相考察。以峰面積對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得出工作曲線方程。結(jié) 果見附圖4。質(zhì)量含量為99%以上的淫羊藿次苷I單體的制備方法如下a按體積比為5 5 4. 5 5. 5分別量取正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水于IOOOmL 的分液漏斗中，充分震蕩，靜置，放置過夜；b以澄清的上相為固定相，下相為流動相，以lOmL/min的流速使固定相充滿螺旋 管柱，然后螺旋管柱以1600rpm/min的速度旋轉(zhuǎn)，穩(wěn)定IOmin后，以1. OmL/min的速度泵入 流動相，使體系達(dá)到流體動力學(xué)平衡；c根據(jù)高速逆流色譜的進(jìn)樣系統(tǒng)選擇進(jìn)樣體積，以1. Omg/mL的溶液濃度進(jìn)樣，下 相溶解淫羊藿次苷I提取物樣品，檢測器波長為272nm，溫度為10°C。其中所述的體積不得 少于3mL ；d第一個出現(xiàn)的大峰不是淫羊藿次苷I，第二個出現(xiàn)的峰為朝鮮淫羊藿葉中提取 的淫羊藿次苷I單體，溶液顏色呈熒黃色，經(jīng)過冷凍干燥，得淫羊藿次苷I單體粉末。
實施例5a稱取朝鮮淫羊藿葉100克，用1500mL體積濃度為70%乙醇回流4小時，濾出乙 醇提取液，將回流過的藥渣用IOOOmL的質(zhì)量濃度為70%乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提 取液，合并兩次濾液；b濾液在50°C下減壓蒸出溶劑，，提取物中所含的水分不能多于其質(zhì)量的5% ；c用200mL無水乙醇溶解b步驟中所得的提取物，用朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量2倍的無水 乙醇溶解步驟b中所得到的提取物，加入濃鹽酸，朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量克濃鹽酸的體積mL 為1 0. 05，在50°C水浴加熱15小時，室溫放置過夜，過濾；d濾液在50°C減壓濃縮至原體積的20%，加入200mL蒸餾水析出沉淀，沉淀在 50°C下用濃度為20%乙醇溶液洗滌四次，每次用IOOmL,洗滌后的沉淀在50°C下真空干燥， 得到得到淫羊藿次苷I提取物。該提取物稱重為5. 6760克。其HPLC色譜圖結(jié)果見附圖5。實施例6a稱取朝鮮淫羊藿葉100克，用1500mL質(zhì)量濃度為70 %乙醇回流4小時，濾出乙 醇提取液，將回流過的藥渣用IOOOmL的質(zhì)量濃度為70%乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提 取液，合并兩次濾液；b濾液在50°C下減壓蒸出溶劑，得到的提取物中所含的水分不能多于其質(zhì)量的 5% ；c用200mL無水乙醇溶解b步驟中所得的提取物，加入濃鹽酸，朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量 克濃鹽酸的體積HiL為1 0. 15，在50°C水浴加熱25小時，室溫放置過夜，過濾；d濾液在50°C減壓濃縮至原體積的20%，加入200mL蒸餾水析出沉淀，沉淀在 50°C下用濃度為20%乙醇溶液洗滌四次，每次用IOOmL,洗滌后的沉淀在50°C下真空干燥， 得到得到淫羊藿次苷I提取物。該提取物稱重為5. 3560克。其HPLC色譜圖結(jié)果見附圖6。實施例7a稱取朝鮮淫羊藿葉100克，用1500mL體積濃度為70%乙醇回流4小時，濾出乙 醇提取液，將回流過的藥渣用IOOOmL的體積濃度為70%乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提 取液，合并兩次濾液；b濾液在50°C下減壓蒸出溶劑，得到的提取物中所含的水分不能多于其質(zhì)量的 5% ；c用200mL無水乙醇溶解b步驟中所得的提取物，加入濃鹽酸，朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量 克濃鹽酸的體積HiL為1 0. 1，在50°C水浴加熱20小時，室溫放置過夜，過濾；d濾液在50°C減壓濃縮至原體積的20%，加入200mL蒸餾水析出沉淀，沉淀在 50°C下用濃度為20%乙醇溶液洗滌四次，每次用IOOmL,洗滌后的沉淀在50°C下真空干燥， 得到得到淫羊藿次苷I提取物。該提取物稱重6560克。其HPLC色譜圖結(jié)果見附圖7。實施例8淫羊藿次苷對垂體后葉素誘發(fā)大鼠心肌缺血的保護(hù)作用將雄性Wistar大鼠(180g-220g) 40只，隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為模型對 照組淫羊藿次苷組、復(fù)方丹參滴丸組。復(fù)方丹參滴丸組和1、2號樣品組以200mg/kg的劑量 灌胃相應(yīng)的藥物，每天一次，共7天，模型對照組灌胃等體積的蒸餾水。第七天給藥后30min，將大鼠用25%烏拉坦(1. 2g/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，
6記錄標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)心電圖。5min后舌下靜脈注射垂體后葉素0. 5U/kg。在IOs內(nèi)推完。分 別記錄注射前(Os)及注射后第15，30s及l(fā)，2，5，10min的心電圖，觀察T波和J波的變化。統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)結(jié)果以f 土 S表示，進(jìn)行F檢驗和組間t檢驗。1.淫羊藿次苷I對T波的影響。結(jié)果見表1。結(jié)論淫羊藿次苷I組在注射PIT后的T波抬高均明顯低于模型組，淫羊藿次苷有 抑制T波的作用。2.淫羊藿次苷I對J波的影響。結(jié)果見表2。結(jié)論淫羊藿次苷I在注射PIT后的J點位移變化均明顯低于模型組，結(jié)果顯示淫 羊藿次苷I具有抑制J點位移變化的作用。實施例9淫羊藿次苷I對豚鼠離體心臟的保護(hù)作用健康雄性豚鼠30只，體重為350g_380g，腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻 醉后，固定，打開胸腔，剪斷腔靜脈、主動脈及心臟周圍組織，迅速摘出心臟置于 4°C Krebs-Henseleit液(K_H液)中輕輕擠出心臟余血并適當(dāng)修剪后，主動脈插管，置于 Langendorf灌注裝置行經(jīng)主動脈灌注，K-H液灌流(K-H液成分如下(g/L) =NaCl 6. 92，KCl 0. 35，CaCI2 ·2Η20 0. 38, KH2PO4 0. 16，MgSO4O. 29, NaHCO3 2. 1，葡萄糖 2. Ο,ρΗ 7. 4)裝入密閉 灌流瓶中，下放出一定量的灌流液，上與氧氣瓶相連充入相應(yīng)量的氧氣(95% O2, 5% CO2), 用力搖勻。超級恒溫器維持灌流液恒溫37°C，排盡灌流管道內(nèi)空氣。灌流壓力由一插入灌 流瓶底與大氣相通的玻璃管維持恒定(灌流液面距心臟70cm)。用蛙心夾夾住心尖，經(jīng)滑 輪與彈簧裝置連接到張力換能器，用BL-420生物機(jī)能實驗系統(tǒng)記錄心率；調(diào)節(jié)灌流液流速 使心臟冠脈流量為5-8ml/min，心臟灌流適應(yīng)IOmin后趨于穩(wěn)定，測量每分鐘冠脈流量，連 續(xù)測3min，若相差不大，則取其平均值作為給藥前冠脈流量。然后分別給淫羊藿次苷(6mg/ ml)和陽性藥(西地蘭0. 8mg/ml)，給藥體積lmL，給藥結(jié)束后連續(xù)測量IOmin內(nèi)每分鐘冠脈 流量并開始記錄心跳，以其平均值作為給藥后的冠脈流量和心率。統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，進(jìn)行F檢驗和組間t檢驗。結(jié)果見表3。結(jié)論淫羊藿次苷I可以使大鼠離體心臟冠脈流量比給藥前明顯增加，具有顯著 性差異，淫羊藿次苷I有增加大鼠心臟冠脈流量的作用。
表3受試藥物對豚鼠離體心臟冠脈流量的影響(i 土S) 與給藥前比較*P < 0. 05。
權(quán)利要求
朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，其特征在于，其步驟和條件如下a將朝鮮淫羊藿葉用是其質(zhì)量15倍的體積濃度為70％乙醇回流4小時，濾出乙醇提取液，將回流過的藥渣用是朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量10倍的體積濃度為70％乙醇回流提取2小時，濾出乙醇提取液，合并兩次濾液；b濾液在50℃下減壓蒸出溶劑，得到提取物，提取物中所含的水分不多于其質(zhì)量的5％；c用朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量2倍的無水乙醇溶解步驟b中所得到的提取物，加入濃鹽酸，朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量克∶濃鹽酸的體積mL為1∶0.05～0.15，在50℃水浴加熱15～25小時，室溫放置過夜，過濾；d濾液在50℃減壓濃縮至其體積的20％，加入朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量2倍的蒸餾水析出沉淀，沉淀在50℃下用體積濃度為20％的乙醇溶液洗滌，洗滌后的沉淀在50℃下真空干燥，得到淫羊藿次苷I粉末。
2.如權(quán)利要求1所述的朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，其特征在于，所述的 步驟c，朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量克濃鹽酸的體積mL為1 0.05，在50°C水浴加熱15小時，其 余的同權(quán)利要求1。
3.如權(quán)利要求1所述的朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，其特征在于，所述的 步驟C，朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量克濃鹽酸的體積mL為1 0.15，在50°C水浴加熱25小時，其 余的同權(quán)利要求1。
4.如權(quán)利要求1所述的朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法，其特征在于，所述的 步驟c，朝鮮淫羊藿葉質(zhì)量克濃鹽酸的體積mL為1 0.10，在50°C水浴加熱20小時，其 余的同權(quán)利要求1。
全文摘要
本發(fā)明涉及朝鮮淫羊藿葉中淫羊藿次苷I的提取方法及應(yīng)用。所述的提取方法，不僅可以避免因為色譜柱的的不可逆吸附而導(dǎo)致產(chǎn)率低，而且可以大量提取高純度的淫羊藿次苷I。所述的提取方法，經(jīng)高效液相色譜法進(jìn)行含量測定，淫羊藿次苷I的質(zhì)量提取率在60％以上，質(zhì)量易控，方法簡便快速。本發(fā)明對淫羊藿次苷I進(jìn)行了藥理方面的研究，證實淫羊藿次苷I具有對垂體后葉素誘發(fā)大鼠心肌缺血的保護(hù)作用。其具體表現(xiàn)在可以抑制T波的作用；可以抑制J點位移變化的作用。淫羊藿次苷I對豚鼠離體心臟有保護(hù)作用。其具體表現(xiàn)在可以增加豚鼠的冠脈流量。本發(fā)明得到的淫羊藿次苷I，其用于制備治療心臟病的藥物。
文檔編號A61K31/7048GK101899077SQ20101020603
公開日2010年12月1日 申請日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者丁一迪, 劉志強(qiáng), 劉忠英 申請人:吉林大學(xué);中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所