專利名稱：六味地黃復方制劑在防治泌尿系結(jié)石中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及預防和治療泌尿系結(jié)石的藥物，具體涉及預防和治療 泌尿系結(jié)石的中藥。
背景技術(shù)：
泌尿系結(jié)石，是一種威脅人類健康的常見疾病。具統(tǒng)計，至2000年初發(fā)達國家中 泌尿系結(jié)石的發(fā)病率為10% 12%，其中絕大多數(shù)是草酸鈣結(jié)石，草酸鈣結(jié)石占尿石癥的 80%左右。隨著體外沖擊波碎石術(shù)等現(xiàn)代高新科技的臨床應(yīng)用，泌尿系結(jié)石的治療取得了 長足的進步，但泌尿系結(jié)石被摘除或排出后復發(fā)率很高，可達60% 80%。同時體外震波 碎石法可能會造成腎實質(zhì)損傷，使腎功能下降，而且碎石后的結(jié)石碎片和可能并發(fā)的感染 給結(jié)石治療帶來一些嚴重問題。目前尚缺乏預防及治療尿石癥的有效藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種用于預防和治療泌尿系結(jié)石的藥物。實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的這種用于預防和治療泌尿系結(jié)石的藥物是六味地黃復方制劑，所述 的六味地黃復方制劑是以下列組分為原料，按常規(guī)方法制備的藥物制劑熟地黃、山茱萸(制)、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉。這六位中藥材是六味地黃丸的成份，因由六位中藥材組成，其中熟地黃為君藥，故 名為六味地黃丸。六味地黃丸源于宋代醫(yī)學家錢乙的《小兒藥證直訣》，是滋補腎陰的基礎(chǔ) 方劑，配伍組方上具有“三補三瀉”的特點?，F(xiàn)代醫(yī)學研究，六味地黃丸還具有增強免疫、抗 衰老、抗疲勞、抗低溫、耐缺氧、降血脂、降血壓、降血糖、改善腎功能、促進新陳代謝及較強 的強壯作用。但畏寒怕冷、痰多濕重之人不宜服用。參見《中華人民共和國藥典》2005年版 一部。目前，市場上也有以這六位中藥材制備的膠囊制劑，如北京亞東生物制藥有限公司生 產(chǎn)的六味地黃膠囊。本發(fā)明研究表明，六味地黃制劑具有防治泌尿系結(jié)石的作用，能有效抑制大鼠體 內(nèi)尿草酸鈣結(jié)石的形成，六味地黃制劑能夠用于預防和治療泌尿系結(jié)石。實驗資料一六味地黃復方制劑的制備及其防治泌尿系結(jié)石的體外藥理研究(一 )六味地黃復方制劑的制備1、實驗儀器及試藥1.1 儀器電子分析天平(精確至萬分之一，Sartorious)AS2060B 型超聲波清洗儀(Automatic Science Instrument Co. Ltd)1.2 藥材澤瀉Alisma orientalis (Sam. ) Juz印(購于武漢劉天保藥業(yè)有限責任公司，產(chǎn)地 福建，批次080907。)
車前子Plantago asiatica L (購于武漢劉天保藥業(yè)有限責任公司，產(chǎn)地江西，批 次080801)
081026) 081026)

茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf (購于亳州千草藥業(yè)，產(chǎn)地湖北，批次081026，) 熟地黃Radix rehmanniae preparata (購于毫州千草藥業(yè)，產(chǎn)地河南，批次
山萸肉Cornus officinalis Sieb. et Zucc.(購于亳州千草藥業(yè)，產(chǎn)地浙江，批次
干山藥Dioscorea opposita(購于亳州千草藥業(yè)，產(chǎn)地河南，批次081026) 牡丹皮Paeonia suffruticosa Andr.(購于武漢劉天保藥業(yè)有限責任公司，產(chǎn)地
安徽，批號080801) 50g。
2.藥物的提取 2. 1處方 組1 澤瀉50g ；
組2:茯苓50g 山藥66. 6g 山茱萸66. 6g 熟地133. 3g 牡丹皮50g 澤瀉
2. 2提取(按六味地黃丸質(zhì)量標準)
各組方按比例稱取一定量藥材，加水至浸沒藥材3cm，浸泡0. 5h。采用煎煮法，煎 煮3次，前兩次煎煮2h，第三次lh。過濾(第一遍兩層紗布，第二遍3000r/5mins離心取 上清，第三遍濾紙抽濾)，合并濾液，備用。2. 3 濃縮將濾液濃縮(直火濃縮至500ml，其后沸水浴濃縮)至相當于lg/ml生藥材的濃 度，得六味地黃湯，用安瓿分裝保存待用。(二)體外藥理實驗1、實驗儀器及試藥1. 1 儀器:電子分析天平(精確至萬分之一，Sartorious)AS2060B 型超聲波清洗儀(Automatic Science Instrument Co. Ltd)HH-4型恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市陽光儀器廠)瓦里安原子吸收光譜儀AA240島津原子吸收光譜儀AA-68000. 22um，0. 45um微孔濾膜(由sigma公司提供)精密PH試紙1.2 試劑鈣單元素標準溶液(中國計量科學研究院，1000ug/ml GBW (E) 080118)，氯化鍶 (天津市光復精細化工研究所，陽離子符合光譜測定)，硝酸、鹽酸、氯化鈣、草酸鈣、草酸 鈉、TRIS均為分析純。2.方法及過程2. 1配制氯化鍶和草酸鈣亞穩(wěn)過飽和溶液2. 2取草酸鈣亞穩(wěn)飽 和溶液，分別依次加入2. 5ml澤瀉、六味地黃湯和蒸餾水(空白對照)，每組各平行操作(加入)3份。以上各組在37°C恒溫水浴箱振蕩IOmin后，分別 取樣2ml (用針頭過濾器經(jīng)直徑0. 45um微孔濾膜過濾于離心管內(nèi))，然后每組均加入0. 5ml 一水草酸鈣籽晶懸液(濃度為5mg/ml)，攪拌30s繼續(xù)置恒溫水浴箱振蕩孵育2h。然后從 各組取2ml溶液同樣經(jīng)0. 45um微孔濾膜過濾并收集在離心管內(nèi)。實驗結(jié)束后取各離心管 內(nèi)溶液0. 5ml，加入4. 5ml氯化鍶。3、樣品抑制草酸鈣結(jié)晶生長的抑制指數(shù)的測定3. 1用原子吸收分光光度法測各樣品加籽晶前后的鈣離子濃度，每組平行測三次。3. 2按下式計算各組對草酸鈣晶體生長的抑制指數(shù)(I. I)草酸鈣晶體生長抑制指數(shù)(I. 1)%= [1-(C0-Ct)/C0]*100%上式中，Ctl為各組加籽晶前濾液中Ca離子的濃度，Ct為各組加籽晶孵育后的Ca 離子的濃度。每實驗組和對照組的3份平行操作結(jié)果，用均數(shù)士標準差表示草酸鈣晶體生 長抑制指數(shù)(I. I)，并進行統(tǒng)計學分析。4.六味地黃湯的深入研究在確定六味地黃湯具有抑制草酸鈣結(jié)晶生長的基礎(chǔ)上，重復制備六味地黃湯和澤 瀉樣品，并配制不同稀釋濃度的六味地黃湯樣品，分別測定其對草酸鈣晶體生長的抑制指 數(shù)，用均數(shù)士標準差表示，并與澤瀉單味進行比較，進行統(tǒng)計學分析。(三)結(jié)果1、樣品抑制草酸鈣結(jié)晶生長的抑制指數(shù)的測定將測得的鈣離子濃(其結(jié)果用均數(shù)士標準差表示)，帶入公式計算出草酸鈣晶體 生長抑制指數(shù)(I. I)。如表一所示，并與蒸餾水對照組用t檢驗進行顯著性檢驗。表一.各組方的草酸鈣晶體生長抑制指數(shù) 由結(jié)果可知，澤瀉、六味地黃湯的抑制指數(shù)明顯大于蒸餾水對照組，將其與蒸餾水 對照進行t檢驗，P < 0. 05，具有顯著性差異，說明有體外抗結(jié)石能力。而且六味地黃湯的 抑制指數(shù)大于澤瀉。
將蒸餾水組作為空白，得出澤瀉與六味地黃湯對于蒸餾水的相對抑制指數(shù)，如表
表二.以蒸餾水為空白各組方的相對抑制指數(shù)
組別_m^_六味地黃湯_
抑制指數(shù) I 54.73 士2.1380.88士25.25
2.六味地黃湯的深入研究
測定六味地黃湯在稀釋10倍、5倍、2. 5倍下的抗結(jié)石能力。其結(jié)果均用均數(shù)士
二所示。
注A為六味地黃湯，B為澤瀉水煎液，阿拉伯數(shù)字表示稀釋倍數(shù)。由結(jié)果可以看出在體外模擬實驗中澤瀉與六味地黃湯有極其相似的抑制結(jié)石能 力，且數(shù)據(jù)分析顯示無顯著性差異(p>0. 05)，而稀釋了 10倍、5倍、2. 5倍的六味地黃湯對 抑制能力的影響不大，樣本間無顯著性差異(P >0.05)。六味地黃湯與蒸餾水對照在統(tǒng)計 學上具有顯著性差異，說明其具有防治結(jié)石的能力。單純對抑制指數(shù)分析，六味地黃湯的抑 制指數(shù)在數(shù)值上大于澤瀉的抑制指數(shù)，說明六味地黃湯的抑制結(jié)石的能力好于澤瀉單味。實驗資料二六味地黃制劑防治泌尿系結(jié)石的作用1.材料六味地黃制劑六味地黃膠囊(北京亞東生物制藥有限公司產(chǎn)品)阿法骨化醇片(重慶藥友制藥有限責任公司產(chǎn)品)枸櫞酸鉀溶液華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院，配制批號091014取六味地黃膠囊，稱取一定量膠囊內(nèi)容物，用蒸餾水溶解分散，配成濃度為0. 16g/ ml的藥液。取一定量0. 16g/ml的藥液，分別稀釋成0. 04g/ml及0. 02g/ml的藥液，分別供 高、中、低劑量組給藥。2.實驗方法2. 1動物分組及給藥方法8 9周齡Wistar雄性健康大鼠60只，體重180 220g,常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)。隨機分為6組(A、B、C、Dh、Dm、Dl)，每組10只。各組大鼠在相同 的環(huán)境下飼養(yǎng)五周，第一周先適應(yīng)環(huán)境，從第二周開始給藥。動物分組及給藥方案如表1 表1動物分組及給藥方案 2. 2觀察指標及檢測方法實驗結(jié)束前Id稱重比較實驗前后大鼠體重的變化，并 用代謝籠收集并測24h尿量、尿pH值、24h尿草酸(Ox)的分泌量。斷頸處死大鼠，下腔靜脈 穿刺取血4ml，離心(5000r/min)15min后，取上層血清(_20°C保存)，測血尿素氮(BUN)Jjl 酐(Cr)，P，Ca2+、Mg2+含量。切取雙腎，縱向剖開，取左側(cè)腎臟用10%中性福爾馬林固定，作 常規(guī)HE石蠟切片和Von-kossa’ s染色，偏光顯微鏡觀察腎組織草酸鈣結(jié)晶形態(tài)分布及腎組 織的病理改變。原子吸收光譜儀進行右腎組織Ca2+，Mg2+含量，尿總Ca2+，Mg2+含量測定。高 錳酸鉀退色法測定24h尿草酸(Ox)分泌量。2. 3統(tǒng)計學分析所有檢驗結(jié)果均用均數(shù)士標準差表示，組間差異用F(0ne-Way AN0VA)檢驗進行顯著性檢驗。3.實驗結(jié)果3. 1 一般情況(行為、毛色、精神、體重等)實驗期間各組大鼠生長狀況良好，毛色、行為、精神狀態(tài)、飲食及糞便均無明顯異 常。A組體重增量明顯大于其它各組，差異顯著。模型組大鼠死亡2只，體重增量小于其它 各組。3. 2血清生化檢查6組大鼠的血清生化指標結(jié)果如表2所示血清BUN方面，除Dh組外，其它各組明 顯高于A組，差異顯著(P <0.01)；各六味地黃制劑組BUN含量均低于B、C組，且隨著劑量 的升高，有下降趨勢，但差異不顯著。血清Cr方面，除隊組外，其它各組明顯低于B、C組， 差異顯著；各六味地黃制劑組隨劑量的升高有下降趨勢，但差異不顯著。血清Ca2+、P、Mg2+ 含量各組間均無顯著性差異。表2血清生化檢查結(jié)果 備注與 A 組比較 *P < 0. 05，**P < 0. 01 ；與 B 組比較□ P < 0. 05，□□ P < 0. 01 ；與 C 組比較·Ρ < 0. 05，"P < 0. 01
3.3 2處尿量、尿？!1、尿(^、032+、]\%2+分泌量6組大鼠24h尿量、尿pH、尿Ox、Ca2+、Mg2+分泌量結(jié)果如表3所示24h尿量方面， A組大鼠尿量明顯低于其它各組，差異顯著(P<0.01) ;(、011、0 、隊組尿量高于模型組，但 無顯著性差異。24h尿Ox分泌量方面，B組明顯低于其它各組，差異顯著(P<0.05)；各六 味地黃制劑組隨劑量的升高有下降趨勢，24h尿Ox分泌量明顯低于B組，且與A組無顯著性 差異。24h尿Ca2+分泌量方面，模型組B組明顯高于A組，差異顯著；各六味地黃丸組隨劑 量的升高有下降趨勢，但差異不顯著；DH、Dm組分泌量低于B組，但差異不顯著。24h尿Mg2+ 分泌量方面，除隊組與C組間有顯著性差異(P < 0. 05)外，各組間無顯著性差異。各組藥 物對大鼠尿PH值無明顯影響。表3 2處尿量、尿？!1、尿(^、032+、1%2+分泌量 備注與A 組比較 *P < 0. 05，**P < 0. 01 ；與 B 組比較□ P < 0. 05，□□ P < 0. 01 ；與 C 組比較·Ρ < 0. 05，"P < 0. 013. 4右腎系數(shù)、腎組織Ca2+、Mg2+含量6組大鼠右腎系數(shù)、腎組織Ca2+、Mg2+含量結(jié)果如表4所示Α組右腎系數(shù)、腎組織 Ca2+含量明顯低于其它各組，差異極顯著(P < 0. 01)。各六味地黃制劑組右腎系數(shù)、腎組織 Ca2+含量隨著劑量的升高有下降趨勢，但差異不明顯；DH組右腎系數(shù)明顯低于B、C組，差異 顯著(P<0.05) ;DH組腎組織Ca2+含量低于B、C組，但差異不顯著。腎組織Mg2+含量方面， B、C組明顯低于其它各組(P < 0. 05)，其它各組間均無顯著性差異。表4右腎系數(shù)、腎組織Ca2+、Mg2+含量 備注與A 組比較 *P < 0. 05，**P < 0. 01 ；與 B 組比較□ P < 0. 05，□□ P < 0. 01 ；與 C 組比較·Ρ < 0. 05，"P < 0. 013. 5腎組織病理學檢查及偏光顯微鏡檢查肉眼觀察各組大鼠腎臟外觀Α組腎臟大小正常，表面顏色較紅潤，色澤均勻；其 它各組腎臟明顯腫大，表面顏色蒼白，其中以B組最為顯著。切面觀Α組切面鮮紅色；B組 切面蒼白色，用手觸摸有明顯的細砂摩擦感，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界不清楚，其它各組則不明顯。常規(guī)病理切片HE染色后，草酸鈣晶體在鏡下呈淡藍色晶體，不規(guī)則、折光性較強； Von-Kossa's染色后，草酸鈣晶體呈黑褐色。A組為正常腎組織結(jié)構(gòu)，無結(jié)晶形成；B組腎組 織有多數(shù)結(jié)晶形成，主要存在于腎皮質(zhì)內(nèi)，部分結(jié)晶成堆且相互連接成片，腎髓質(zhì)內(nèi)也有少 量結(jié)晶形成，高倍鏡下可見近曲小管和遠曲小管上皮細胞明顯腫脹、變性、壞死，管腔明顯 擴張，管腔內(nèi)可見嗜伊紅染色樣壞死物質(zhì)及部分脫落上皮細胞，周圍有晶體聚集，腎間質(zhì)有 明顯的慢性腎炎性細胞浸潤；Dh組結(jié)晶明顯少于B組，僅有少量結(jié)晶分布在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)， 結(jié)晶大多數(shù)不成堆，管腔內(nèi)僅見散在草酸鈣晶體，管腔擴大明顯比B組輕，腔內(nèi)也無明顯的 壞死脫落樣物質(zhì)；DM、DpC組情況與B組類似，但相對較輕。見圖1至圖8。本發(fā)明采用乙二醇(EG)飲水和Ια-羥基維生素D3灌胃誘導SD大鼠腎草酸 鈣結(jié)石模型形成。動物實驗表明，B組大鼠的血清BUN、Cr、24h尿0x、24h尿Ca2+分泌量、右 腎系數(shù)及腎組織Ca2+含量明顯高于A組，這與腎組織病理切片檢查結(jié)果是一致的。而六味 地黃制劑高劑量組血清BUN、Cr、24h尿0x、24h尿Ca2+分泌量、右腎系數(shù)及腎組織Ca2+含量 明顯低于B組，且能減輕草酸鈣晶體在腎組織內(nèi)的沉積，在一定程度上減輕了腎小管的擴 張及腎功能的損傷。另外，六味地黃制劑組大鼠24h尿量明顯多于空白對照組和結(jié)石模型 組，有較強的利尿作用，有利于草酸鈣結(jié)石的排出。本發(fā)明研究表明，六味地黃制劑能有效 抑制大鼠體內(nèi)尿草酸鈣結(jié)石的形成，能夠用于預防和治療泌尿系結(jié)石。


圖1為空白對照組皮質(zhì)(HE染色)圖2為空白對照組髓質(zhì)(HE染色)圖3為空白對照組(Von-Kossa’ s染色)圖4為模型組皮質(zhì)(HE染色)圖5為模型組髓質(zhì)(HE染色)
圖6為模型組(Von-Kossa’ s染色)圖7 為 Dh 組皮質(zhì)(Von-Kossa’ s 染色)圖8 為 Dh 組髓質(zhì)(Von-Kossa' s 染色)
具體實施例方式實施例1 六味地黃復方制劑的制備1.藥材澤瀉Alisma orientalis (Sam. ) Juz印(購于武漢劉天保藥業(yè)有限責任公司，產(chǎn)地 福建，批次080907。)車前子Plantago asiatica L (購于武漢劉天保藥業(yè)有限責任公司，產(chǎn)地江西，批 次080801)茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf (購于亳州千草藥業(yè)，產(chǎn)地湖北，批次081026，)熟地黃Radix rehmanniae preparata (購于毫州千草藥業(yè)，產(chǎn)地河南，批次 081026)山萸肉Cornus officinalis Sieb. et Zucc.(購于亳州千草藥業(yè)，產(chǎn)地浙江，批次 081026)干山藥Dioscorea opposita(購于亳州千草藥業(yè)，產(chǎn)地河南，批次081026)牡丹皮Paeonia suffruticosa Andr.(購于武漢劉天保藥業(yè)有限責任公司，產(chǎn)地 安徽，批號080801)

50g ；
2.藥物的提取 2. 1處方 組1 澤瀉50g ；
組2:茯苓50g 山藥66. 6g 山茱萸66. 6g 熟地133. 3g 牡丹皮50g 澤瀉
2. 2提取(按六味地黃丸質(zhì)量標準)
各組方按比例稱取一定量藥材，加水至浸沒藥材3cm，浸泡0. 5h。采用煎煮 法，煎 煮3次，前兩次煎煮2h，第三次lh。過濾(第一遍兩層紗布，第二遍3000r/5mins離心取 上清，第三遍濾紙抽濾)，合并濾液，備用。2. 3 濃縮將濾液濃縮(直火濃縮至500ml，其后沸水浴濃縮)至相當于lg/ml生藥材的濃 度，得六味地黃湯制劑，用安瓿分裝保存待用。
權(quán)利要求
六味地黃復方制劑在制備用于預防或/和治療泌尿系結(jié)石藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的六味地黃復方制劑在制備用于預防或/和治療泌尿系結(jié)石藥 物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的六味地黃復方制劑是以熟地黃、山茱萸(制)、牡丹皮、山 藥、茯苓、澤瀉為原料，按常規(guī)方法制備的藥物制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的六味地黃復方制劑在制備用于預防或/和治療泌尿系結(jié) 石藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的六味地黃復方制劑是六味地黃丸、六味地黃膠囊或六 味地黃湯。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于預防和治療泌尿系結(jié)石的藥物，該藥物是以熟地黃、山茱萸(制)、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉為原料，按常規(guī)方法制備的六味地黃復方制劑，如六味地黃丸、六味地黃膠囊、六味地黃湯等。本發(fā)明研究表明，六味地黃制劑能有效抑制大鼠體內(nèi)尿草酸鈣結(jié)石的形成，具有防治泌尿系結(jié)石的作用。
文檔編號A61K36/8945GK101879263SQ20101020797
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月24日
發(fā)明者劉博 , 尹春萍 申請人:華中科技大學