專利名稱：治療骨關(guān)節(jié)炎的草本復(fù)方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一個(gè)包含萵苣、沉香、稻米、乳香、白術(shù)、菟絲子的草本復(fù)方用來治療骨關(guān)節(jié)炎。
背景技術(shù)：
罹患骨關(guān)節(jié)炎的人比任何其它關(guān)節(jié)疾病都多。根據(jù)美國疾病管制局(CDC)2005 年的統(tǒng)計(jì)，25歲以上的美國人，13. 9 %被骨關(guān)節(jié)炎影響，而65歲以上的人，有33. 6 % (12400000人)的人被影響。1997年估計(jì)花費(fèi)7. 9千萬美元來作膝及臀部關(guān)節(jié)的取代 手術(shù)。2000年估算每年治病費(fèi)用是5700美元與工作有關(guān)的骨關(guān)節(jié)炎則每年花費(fèi)3. 4至 13. 2 千萬美元(www, cdc. gov/arthritis/osteoarthritis. html)。西方世界老人 有膝骨關(guān)節(jié)炎癥狀，中國則60歲以上15%女性，6%男性有骨關(guān)節(jié)炎(Lai，H-Y, et. al.， Intra—articular hyaluronic acid for treatment of osteoarthritis :a nationwide study among the older population of Taiwan. BMC Health Serv Res. 2008 ；8 :24)。在自宅居住的成年人中有五項(xiàng)最會(huì)導(dǎo)致失能的疾病，其中之一就是骨關(guān)節(jié)炎，罹 患者生活品質(zhì)極度受影響。載力關(guān)節(jié)(膝、臀)出了毛病在臨床上影響極大。大約35 50%的骨關(guān)節(jié)炎與遺傳有關(guān)，其它危險(xiǎn)因子包括體重過重、關(guān)節(jié)受傷、大量機(jī)械性壓力、排 列不準(zhǔn)、女性、老人(Weiss E and R. Jurmain. Osteoarthritis revisited :A contemporary review of aetiology. Int. J. Osteoarchaeology，2007，17 :437_450)。軟骨、骨骼、關(guān)節(jié)滑 膜三者交互作用導(dǎo)致關(guān)節(jié)退化。軟骨是由水分、膠原蛋白和蛋白多醣所組成。在健康軟骨中，內(nèi)部的再塑一直進(jìn) 行，軟骨細(xì)胞合成大分子來取代分解掉的分子。骨關(guān)節(jié)炎中，退化性改變導(dǎo)致失能，軟骨 細(xì)胞的生成及分解活性失衡而使軟骨膠退化和不正常的修補(bǔ)增加。不正常的修補(bǔ)形成骨 贅(osteophyte)和囊狀空洞(subchondral cysts) 0軟骨細(xì)胞維持及修補(bǔ)受損軟骨表 面的能力不足是關(guān)節(jié)退化原因的一(Goldring MB and SR Goldring. Osteoarthritis. J. Cell. Physiol. 2007, 213 626-634.Krasnokutsky S. ,et. al. ,Current concepts in the pathogenesis of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 2008,16 :S1_S3)。骨關(guān)節(jié)炎不被歸類到發(fā)炎性關(guān)節(jié)炎，發(fā)炎反應(yīng)通常是輕微的，但是它會(huì)有偶發(fā) 的滑液囊炎，其癥狀包括疼痛、腫脹、僵硬、產(chǎn)生白三稀素(由5-脂肪氧合胸作用而來) 和前列腺素(由環(huán)加氧酶作用而來)。這些媒介質(zhì)更進(jìn)一步促進(jìn)白間素-1 β (IL-Ιβ) 和瘤壞死因子-α (TNF-α)的表現(xiàn)而使分解酵素包括基質(zhì)金屬蛋白分解酵素(Matrix metalloproteinase, MMP)及聚蛋白分解酵素(aggrecanase)的表現(xiàn)增力口 (Pelletier H. W.，et. al.，Synthesis of interleukine 1 beta, tumor necrosis factor-alpha, and interstitial collagenase (MMP-I) is eicosanoid dependent in human osteoarthritis synovial membrane explants interactions with anti-inflammatory cytokines. 2002 ； J. Rheumatol. 29(3) :546_553)。老化是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生最重要的一個(gè)因子。與老化相關(guān)的改變包括細(xì)胞外基質(zhì)分 子的改變，軟骨細(xì)胞修復(fù)細(xì)胞基質(zhì)的能力降低。老化也會(huì)使高度醣化終產(chǎn)物(advancedglycation end product)累積。軟骨細(xì)胞有高度醣化終產(chǎn)物的受體(receptor for advanced glycation end product，RAGE)，其數(shù)目隨年齡或退化性關(guān)節(jié)炎而增加。RAGE 訊號(hào)傳遞會(huì)使基質(zhì)金屬蛋白分解酵素_1，3，13增加，而這幾個(gè)基質(zhì)金屬蛋白分解酵素是與 骨關(guān)節(jié)炎有關(guān)的代謝酵素(Loeser R F.，et. al.，Articular chondrocytes express the receptor for advanced glycation end products,potential role in osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2005 ；52 (8) :2376_2385· ；Boileau C.，et. al.，The regulation of human MMP-13by licofelone,an inhibitor of cyclo-oxygenases and 5-lipoxygenase, in human osteoarthritic chondrocytes is mediated by the inhibition of the p38MAP kinase signalling pathway. Ann Rheum Dis 2005 ；64 :891_898· Nah SS.，et.al·， Advanced glycation end products increases matrix metalloproteinase-1, —3， -13 and TNF-alpha in human osteoarthritic chondrocytes. FEBS Lett. 2007 ；581 (9) 1928-1932)。動(dòng)態(tài)的壓力和剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)軟骨的合成和分解作用，一般低壓剌激合成活性[聚 蛋白質(zhì)(aggrecm)和二型膠原蛋白質(zhì)合成]，高壓剌激分解活性(基質(zhì)金屬蛋白分解酵素 MMP 禾口聚蛋白質(zhì)分角軍酵素 aggrecanase) (Fitzgerald J. et. al.，Shear and compression differentially regulate clusters of functionally related temporal transcription patterns in cartilage tissue. J. Biol. Chem. 2006，281 (34) :34095_34103)。高剪切 應(yīng)力，例如關(guān)節(jié)排列不準(zhǔn)，引起環(huán)加氧酶二型的表現(xiàn)，消耗抗氧化劑，及引起軟骨細(xì)胞凋 亡(Zachary R. H.，et. al.，Divergent responses of chondrocytes and endothelial cells to shear stress :Cross_talk among C0X—2， the phase 2 response， and apoptosis. Proc. Nat. Acad. Sci. 2005,102 (39) 14010-14015. Abulencia J. P. ， et. al., Shear-induced cyclooxygenase-2 via a JNK2/c-Jun-dependent pathway regulates prostaglandin receptor expression in chondrocytic cells. J. Biol. Chem.，2003 ； 278(31) =28388-28394) 0剪切應(yīng)力也會(huì)刺激氧化氮合成酶活性而產(chǎn)生氧化氮，骨關(guān)節(jié)炎患 者的關(guān)節(jié)滑液中發(fā)現(xiàn)氧化氮增加，軟骨內(nèi)發(fā)現(xiàn)有氮氧化酪胺酸(nitrotyrosine)加成物， 這種氮氧化作用是引起軟骨細(xì)胞活性作用降低、衰老和軟骨退化的因子之一(Yudoh K.， et. al. . Potential involvement of oxidative stress in cartilage senescence and development of osteoarthritis :oxidative stress induces chondrocyte telomere instability and downregulation of chondrocyte function. Arthritis Res.Ther 2005,7 :R380-R391)。氧化氮、活性氧分子、氧化氫、過氧化氫、(N0，O2-, HO, H2O2)這些活性氧物質(zhì)族 群可以使軟骨細(xì)胞衰老、凋亡。在這種代謝緩慢細(xì)胞不再分裂的組織如軟骨中，傷害尤 大。有實(shí)驗(yàn)顯示骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞其死亡率達(dá)22. 3% (Sanshiro H.，et. al.，Linkage of chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in human osteoarthritis. Arthritis Rheum. 1998 ；41 (9) 1632-1638. Marcello D.C.Jr. and Loeser R. F.. Increased oxidative stress with aging reduces chondrocyte survival Correlation with intracellular glutathione levels Arthritis Rheum. 2003 48(12) 3419~3430) 活性氧物質(zhì)族群和老化使軟骨細(xì)胞衰老不再能維持及修復(fù)軟骨膠因而導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎。目前骨關(guān)節(jié)炎的治療方法大多為緩解癥狀的，例如休息、運(yùn)動(dòng)、減重、熱/冷敷減痛、物理療法、止痛劑、非類固醇抗發(fā)炎藥物、皮質(zhì)酮、滑潤劑，最后的選擇是關(guān)節(jié)置換手術(shù) (Buckwalter J. A. and Martin J. Α. , Drug delivery in degenerative joint disease. Advanced Drug Delivery Reviews. 2006 ；58 (2) : 150-167)。一些食品補(bǔ)充劑例如葡萄糖胺 (Glucosamine)、軟骨素硫酸鹽(Chondroitin Sulfate)臨床上有效性未確定，目前沒有改 變疾病程序的藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)用于治療骨關(guān)節(jié)炎的草藥組合。本發(fā)明包含萵苣、沉 香、稻米、乳香、白術(shù)、菟絲子以5-20 0.2-1 1-5 0.2-1 0.1-1 0. 2_1的重量 百分比，較優(yōu)的比例是5 0. 5 4 0. 5 0. 25 0. 5，在每日3_12克(g)生藥劑 量下用來治療骨關(guān)節(jié)炎。整株或植物的某一部分可以使用。較優(yōu)的是沉香含樹脂的樹 干、稻米的種子、萵苣的種子、乳香的樹脂。本發(fā)明可以以藥劑可接受的稀釋劑、載體及 輔型劑制成各種劑型。藥劑可接受的稀釋劑包括，但不限于，山梨醇(sorbitol)，甘露醇 (mannitol)，淀粉(starch)，乳糖(lactose)，粉狀或微晶狀纖維素(cellulose in powder form or microcrystalline form), 二 丐憐酸鹽(dicalcium phosphate),三 丐憐酸鹽 (tricalcium phosphates)，糖(sugar)和相似物。其它藥劑可接受的載體及輔型劑包括， 但不限于，結(jié)合劑(binders)，崩解佐劑(disintegrants)，潤滑劑(lubricants)，流動(dòng)佐 齊[J (glidants),助溶或助濕齊[J (solubility or wet enhancers),復(fù)合形成齊[J (complex forming agents)，釋放控齊[J (release controlling agents)，月莫衣齊[J (film formers), 塑化劑(plasticizers)，著色劑(colorants)，調(diào)味劑(flavoring agents)，甜味劑 (sweeteners)，黏度增強(qiáng)劑(viscosity enhancers)，保存劑(preservatives)，抗氧化劑 (antioxidants)和相似物，制成錠劑、軟膠囊、散劑、粉劑、水劑、膠囊、溶液、霜?jiǎng)⑷閯?、?霧劑、植入劑、經(jīng)皮貼片等劑型來使用于各種投予途程。本發(fā)明公開的是一個(gè)治療骨關(guān)節(jié)炎的草本復(fù)方。它針對骨關(guān)節(jié)炎多因子病理，包 括機(jī)械性剪力(產(chǎn)生氧化氮攻擊)、氧化壓力(活性氧化族群；高度醣化終產(chǎn)物累積以及其 訊號(hào)傳遞)，老化引起軟骨細(xì)胞失去活力(衰老、凋亡)，使用/耗損軟骨(不足的取代、膠 原蛋白質(zhì)/含醣蛋白的合成降低、基質(zhì)金屬蛋白分解酶/聚蛋白質(zhì)分解酶活性增加)，滑膜 細(xì)胞釋放的發(fā)炎介質(zhì)(環(huán)加氧酶產(chǎn)生前列腺素、5-脂肪氧合胸產(chǎn)生白烯三酸)而導(dǎo)致的腫 脹疼痛癥狀以及軟骨膠退化作用。如實(shí)施例1所揭示的草本復(fù)方，在實(shí)驗(yàn)1中所示，本發(fā)明可以刺激軟骨細(xì)胞增生， 刺激的程度在取代老化失去細(xì)胞數(shù)的范圍。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)2中所示，可增加軟骨細(xì)胞膠原 蛋白和糖胺聚多糖的沉積，在過氧化氫下，本發(fā)明仍具對抗過氧化的作用而增加膠原蛋白 及糖胺聚多糖的沉積。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)3中所示，可增加骨髓間質(zhì)干細(xì)胞膠原蛋白和糖胺 聚多糖的沉積，可以促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分化成軟骨細(xì)胞。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)4所示，可 以抑制二型環(huán)加氧酶。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)5所示，可以抑制5-脂肪氧合胸。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn) 6所示，可以抑制基質(zhì)金屬蛋白分解酶-3(MMP-3)。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)7所示，可以抑制基質(zhì) 金屬蛋白分解酶-13(MMP-13)。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)8所示，可以抑制軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)MMP-2 的活性。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)9所示，可以抑制細(xì)胞外MMP-2的活性。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)10所示， 具擬超氧化物歧化胸(Superoxide dismutase, SOD)去自由基作用。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)11所
5示，具去除二苯代苦味胼基(2，2-diphenyl-l-picrylbydraZyl ；DPPH)自由基作用。實(shí)施例 1如實(shí)驗(yàn)12所示，含具抗氧化作用的多酚。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)13所示，依劑量抑制脂質(zhì)過氧 化。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)14所示，可以刺激軟骨細(xì)胞及人類骨髓干細(xì)胞與軟骨膠代謝有關(guān)基因 的表現(xiàn)。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)15所示，可以抑制福爾馬林引起的小鼠急性及發(fā)炎疼痛。實(shí)施例 1如實(shí)驗(yàn)16所示，可以促進(jìn)小鼠負(fù)重游泳的能力。實(shí)施例1如實(shí)驗(yàn)17人類使用經(jīng)驗(yàn)所示， 腰背疼痛緩解67.3%，髖及膝部關(guān)節(jié)疼痛減緩65.8%，僵直程度減緩63. 8 %，日常生活行 動(dòng)困難減少62.3%。參試者四肢更具活力，全身肌肉骨骼筋骨系統(tǒng)更具活動(dòng)力。本發(fā)明萃取物顯現(xiàn)它能刺激軟骨細(xì)胞分裂來取代因骨關(guān)節(jié)炎引起的軟骨細(xì)胞衰 老、凋亡。它也可以經(jīng)由刺激二型膠原蛋白質(zhì)及聚蛋白質(zhì)基因的表現(xiàn)，抑制MMP活性來促 進(jìn)軟骨細(xì)胞沉積膠原蛋白質(zhì)和糖胺聚多糖于軟骨膠，它可以刺激骨髓干細(xì)胞朝向軟骨細(xì)胞 系列的分化，例如使細(xì)胞聚集，就如在胚胎發(fā)育期，四肢芽發(fā)育時(shí)的情況。它也可以刺激骨 髓干細(xì)胞膠原蛋白質(zhì)和糖胺聚多糖的合成。本發(fā)明萃取物(SOlOlC)也可以刺激在軟骨 細(xì)胞中與軟骨膠新陳代謝相關(guān)的基因表現(xiàn)，包括聚蛋白質(zhì)、聚蛋白質(zhì)分解酶、二型膠原蛋 白質(zhì)、轉(zhuǎn)形生長因子-β (TGF-β)、骨骼型態(tài)發(fā)育蛋白質(zhì)-2(ΒΜΡ-2)。它也可以刺激骨髓 干細(xì)胞朝向軟骨細(xì)胞分化的基因表現(xiàn)。本發(fā)明萃取物抑制軟骨細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白分解 酶-2(ΜΜΡ-2)的表現(xiàn)及活性。在細(xì)胞外系統(tǒng)中，它也可以抑制ΜΜΡ-3，-13的活性。本發(fā)明 萃取物含酚類化合物(Phenolics)具抗氧化作用，例如去除二苯代苦味胼基(DPPH)自由 基、抗脂質(zhì)過氧化、擬超氧化物歧化胸(SOD)活性。同時(shí)，本發(fā)明萃取物也具抑制二型環(huán)加 氧酶，5-脂肪氧合胸的作用，抑制發(fā)炎及疼痛相關(guān)的媒介物質(zhì)的產(chǎn)生。在動(dòng)物模型中，它可 以抑制由福爾馬林引起急性及慢性發(fā)炎的疼痛。本發(fā)明萃取物也可以加強(qiáng)負(fù)重游泳，四肢 筋骨活力。本發(fā)明萃取物在人類使用經(jīng)驗(yàn)中證實(shí)它有治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。


圖1顯示二苯代苦味胼基(DPPH)自由基截取。圖1 中1-空白對照；2-S0101C(本發(fā)明萃取物)0. 01mg/ml ；3-S0101C0. 03mg/ ml ；4-S0101C 0.lmg/ml ；5-S0101C 0.3mg/ml ；6-S0101C lmg/ml ；7-Vitamin C 0.OlmM ； 8-Vitamin C 0. 03mM ；9-Vitamin C 0. ImM ； 10-Vitamin E 0. OlmM ；Il-Vitamin E 0. 03mM ； 12-Vitamin E 0. ImM。圖2顯示抑制脂質(zhì)過氧化的作用。圖2 中1-空白對照；2-S0101C(本發(fā)明萃取物)0. 03mg/ml ；3-S0101C0. lmg/ml ； 4-S0101C 0. 3mg/ml ；5-Vitamin E 0. 003mM ；6-Vitamin E0. OlmM ；7-Vitamin E 0. 03mM。圖3顯示SOlOlC對福爾馬林引起疼痛的鎮(zhèn)痛作用。圖4顯示SOlOlC對小鼠負(fù)重游泳能力的促進(jìn)作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11500克萵苣、150克沉香、600克稻米、150克乳香、75克白術(shù)、150克菟絲子于3公 升去離子水中以攝氏100士5°C加熱2. 5小時(shí)。萃取液收集。再重復(fù)一次。二次萃取液合并 過100目篩。萃取液濃縮后噴霧干旱成粉末(是為S0101C)。
實(shí)驗(yàn)1 刺激軟骨細(xì)胞增生人類軟骨在病人知情同意下關(guān)節(jié)取代手術(shù)中取得，軟骨以細(xì)菌二級/四級膠原 胃白_ (Collagenase, Worthington Chemical, Freehold, NJ) lmg/mlDMEM+10%月臺(tái)+ 青 (FCS) +25 μ g/ml 艮他霉素(Gentamicin, Grand Island, NY) (C-DMEM)，在 37°C下隔夜消化， 取得的細(xì)胞以高密度培養(yǎng)于C-DMEM，5 % 二氧化碳，37°C下。每孔IX IO4細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)皿中，48小時(shí)后以含不同濃度本發(fā)明草本復(fù)方 培養(yǎng)液取代，72小時(shí)后，培養(yǎng)液吸掉，以內(nèi)含3-(4，5_二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴 鹽(3~(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)~2,5-diphenyltetrazolium bromide ；MTT)0. 5mg/ml 的PBS溶液取代。在5 % 二氧化碳，37 °C下培養(yǎng)四小時(shí)。吸掉MTT溶液后，形成的formazan 用含0. 04N鹽酸的異丙醇(Isopropanol)溶解，吸光值在波長570nm下讀取。
權(quán)利要求
一個(gè)用于治療骨關(guān)節(jié)炎的草藥組合，包括萵苣、沉香、稻米、乳香、白術(shù)、菟絲子，其重量百分比例為5 20∶0.2 1∶1 5∶0.2 1∶0.1 1∶0.2 1。
2.權(quán)利要求1所述的草藥組合，其中，萵苣、沉香、稻米、乳香、白術(shù)、菟絲子的重量百分 比例為 5 0. 5 4 0. 5 0. 25 0. 5。
3.權(quán)利要求1所述的草藥組合，有效劑量是每天生藥重量在3到12克之間。
4.權(quán)利要求1所述的草藥組合，其中，沉香是其含樹脂的樹干。
5.權(quán)利要求1所述的草藥組合，其中，稻米是其種子。
6.權(quán)利要求1所述的草藥組合，其中，萵苣是其種子。
7.權(quán)利要求1所述的草藥組合，其中，乳香是其樹脂。
8.權(quán)利要求1所述的草藥組合，其中，草藥組合具有之功用系選自下列群組所組成之 組刺激軟骨細(xì)胞分裂、刺激軟骨細(xì)胞沉積膠原蛋白及糖胺聚多糖胺、刺激人類骨髓干細(xì)胞 分化成軟骨細(xì)胞、刺激軟骨細(xì)胞與軟骨膠代謝有關(guān)基因、刺激人類骨髓干細(xì)胞與軟骨膠代 謝有關(guān)基因、抑制基質(zhì)金屬蛋白分解酵素MMP-2的活性、抑制基質(zhì)金屬蛋白分解酵素MMP-3 的活性、草藥組合可以抑制基質(zhì)金屬蛋白分解酵素MMP-13的活性、具有抗氧化的活性、具 有抗發(fā)炎的活性、具有抑制疼痛的活性、以及具有增強(qiáng)筋骨活動(dòng)的能力。
9.權(quán)利要求1所述的草藥組合，其中，草藥組合能與藥學(xué)上可接受的輔型劑、載體或稀 釋劑或各種劑型用于各種投予途徑。
10.權(quán)利要求9所述的草藥組合，其中，各種劑型為口含錠、錠劑、膜衣錠、膠囊軟、膠 囊、顆粒、粉劑、丸劑、溶液、乳化液、針劑、軟膏、霜?jiǎng)?、噴霧劑、鼻吸劑、軟膠、水劑、乳液、植 入劑和經(jīng)皮貼片。
全文摘要
一個(gè)草本復(fù)方包括萵苣、沉香、稻米、乳香、白術(shù)、和菟絲子，可以用來治療退化性關(guān)節(jié)炎。
文檔編號(hào)A61K36/899GK101954005SQ201010222438
公開日2011年1月26日 申請日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月13日
發(fā)明者劉素瑩 申請人:佰研生化科技股份有限公司