專利名稱：一種藥物增溶載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種藥物增溶載體及其制備方法和應(yīng)用，具體涉 及一種以透明質(zhì)酸(HA)為原料的藥物增溶載體，本發(fā)明還涉及該載體的制備方法及其作 為藥物載體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鑒于普通表面活性劑膠束的高CMC和可能的毒副作用，聚合物膠束是近年發(fā)展起 來的藥物載體。目前，有關(guān)天然多糖修飾衍生成兩親性聚合物自組裝成聚合物膠束受到了 研究者越來越廣泛的關(guān)注。這是因?yàn)榕c人工合成的多聚物(如PVA，PLGA等)和天然多聚 物(如膠原、白蛋白等)相比，多糖有很多特點(diǎn)宜于作為藥物運(yùn)輸系統(tǒng)，如生物可降解性高、 免疫原性低、良好的生物相容性及容易進(jìn)行化學(xué)改性等。在合成方法上由于疏水化修飾的接枝水溶性聚合物的制備比嵌段共聚物容易，因 此開發(fā)來自疏水修飾的水溶性聚合物的自聚集體要比嵌段共聚物更有發(fā)展前途。水溶性聚 合物經(jīng)疏水化修飾后即成為兩親性分子，通常是由親水性的主鏈攜帶有一小部分疏水基團(tuán) 如長烷基鏈、膽固醇、脫氧膽酸等。以這種方法制備的納米級自組裝膠束有一些獨(dú)特的性質(zhì)，如1)納米級尺寸和窄的粒徑分布，可以使其逃脫網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞體系和腎臟的排空機(jī) 制，延長血漿半衰期；2)核殼結(jié)構(gòu)，核是指納米粒內(nèi)部存在的疏水性微結(jié)構(gòu)域；外殼則由多糖的親水骨 架構(gòu)成。其中親水外殼具有生物相容性，并對粒子分散在水中起立體穩(wěn)定作用，而內(nèi)核可以 通過非共價作用結(jié)合疏水性小分子如抗癌藥物紫杉醇、阿霉素等。其特點(diǎn)是載藥量大，在生 物體內(nèi)分布主要由粒子的物理化學(xué)性質(zhì)決定；3)臨界膠束濃度(CMC)低，與小分子表面活性劑相比，聚合物的CMC很低，使之在 各種生理?xiàng)l件下有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，保證藥物以足夠的濃度到達(dá)病灶部位；4)緩釋藥物特性藥物一般以被動擴(kuò)散方式釋放，由于聚合物膠束疏水性內(nèi)核的 剛性結(jié)構(gòu)及疏水性物質(zhì)間強(qiáng)大的內(nèi)聚力，使其釋藥速度緩慢。同時由于膠束與客體分子間 是以非共價的方式結(jié)合，使得運(yùn)載的藥物能夠更好的釋放出來。5)靶向性聚合物膠束具有被動靶向，主要因?yàn)槔媚[瘤特有的高通透性和高 截留性(Era效應(yīng))，造成膠束在腫瘤部位積蓄并釋藥，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。此外，在 聚合物膠束表面可以共價結(jié)合一些主動靶向配體分子，如葉酸，轉(zhuǎn)鐵蛋白等，可以顯著增加 腫瘤細(xì)胞對聚合物膠束的攝取，從而使得藥物得以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)蓄積，提高治療效果。HA是一種大分子糖胺聚糖，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和細(xì)胞間質(zhì)(ICM)的主要成 分。它是由約2000-25000個β -N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸單糖構(gòu)成的連續(xù)重復(fù) 的線性分子構(gòu)成。 在細(xì)胞膜的表面有4類HA的特定受體⑶44 (⑶分化群)、RHAMM (HA中介的游動性 受體)、IVd4及LEC (肝內(nèi)皮細(xì)胞受體)，其中⑶44和RHAMM在腫瘤細(xì)胞的含量較高。因此，HA可借助受體作用，將藥物主動靶向至腫瘤細(xì)胞，提高其抗腫瘤活性。HA具有來源廣泛，低免疫原性，良好的生物相容性和生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)。HA分 子鏈上帶有大量活性羧基與羥基，易于通過化學(xué)修飾而改善其物化性質(zhì)。HA的化學(xué)改性是 當(dāng)前國內(nèi)外非?；钴S的一個領(lǐng)域。在HA骨架上分別引入親水基和疏水基，形成兩親性聚合 物，在水中自發(fā)形成膠束，可作為藥物載體。目前國內(nèi)外已報道了 HA接枝PLGA，HA接枝脫氧 膽酸及HA接枝紫杉醇等衍生物作為難溶性藥物傳遞載體的應(yīng)用，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。近年來，抗腫瘤藥物靶向性傳遞的研究越來越受到人們的重視。自從發(fā)現(xiàn)葉酸受 體在絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞膜內(nèi)大量表達(dá)而在正常細(xì)胞幾乎不表達(dá)以來，葉酸/葉酸受體 介導(dǎo)靶向傳遞成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。葉酸是小分子量維生素，相對于單克隆抗體等蛋白質(zhì)，具 有化學(xué)性質(zhì)簡單、方便易得、無免疫原性等特點(diǎn)，且葉酸對葉酸受體具有高度親和性，可通 過葉酸受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，所以利用這些特點(diǎn)將葉酸作為抗腫瘤藥物的靶向配 體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種藥物增溶載體及其制備方法和應(yīng)用，是以可生物降解的 天然來源的HA作為原料，通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到的安全性好、載藥量高、靶向性好的藥物 增溶載體。本發(fā)明的另一個目的是提供上述載體的制備方法。本發(fā)明還有一個目的是提供上述載體在藥物制劑領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明在現(xiàn)有的技術(shù)基礎(chǔ)之上，改善合成工藝，在較為溫和的條件下引入烷基作 為疏水鏈，接枝靶向配體葉酸，選擇合適的載藥工藝制備低毒，高載藥量，高穩(wěn)定性的HA聚 合物膠束。本發(fā)明的目的可以通過下列技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)一種藥物增溶載體，該載體是在HA骨架上引入疏水性的烷基和主動靶向配體葉 酸，使其能在水中自組裝成納米膠束，及具有主動靶向作用的兩親性HA衍生物。所述的接枝疏水性的烷基與靶向配體葉酸是指疏水性的烷基取代透明質(zhì)酸葡萄 糖醛酸單元中的羧基，總?cè)〈? 30%，靶向配體葉酸取代透明質(zhì)酸葡萄糖胺單元中的 羥甲基，總?cè)〈? 10%。所述的藥物增溶載體，其中疏水性的烷基接枝率為10 30%，主動靶向配體接枝 率為2 10%。所述的藥物增溶載體，其中疏水性烷基的碳原子數(shù)不低于8。所述的藥物增溶載體，其中選用的HA分子量為5X IO3 IX 105。所述的藥物增溶載體的制備方法，包括下列步驟HA溶于5mL甲酰胺中，50°C水浴加熱磁力攪拌使其溶解，冷卻至室溫。加入1_乙 基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，冰浴下磁力攪拌2h。 然后將提供疏水基團(tuán)的物質(zhì)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，緩慢滴加到HA混合液 中。混合液于60°C氮?dú)猸h(huán)境下攪拌反應(yīng)5h后，于室溫繼續(xù)攪拌24h。反應(yīng)混合液于過量的 水/乙醇混合液(lv/3v lv/lv)依次透析2d，蒸餾水透析2d (透析袋截留分子量7000)， 然后過濾除去不溶性雜質(zhì)，冷凍干燥，得白色固體粉末，即疏水烷基修飾HA衍生物。
葉酸溶于無水二甲基亞砜(DMSO)中，加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和NHS，于 21°C避光活化5h，過濾除去活化生成的白色沉淀。將濾液緩慢滴入溶于甲酰胺的HA-C18溶 液中，室溫下避光反應(yīng)48h。反應(yīng)液于pH 10的NaHCO3-Na2CO3緩沖液中透析(透析袋截留 分子量7000)，直至透析液于281nm處檢測不到葉酸的紫外吸收，隨后反應(yīng)液于蒸餾水中 透析3d，冷凍干燥，得黃色固體粉末，即葉酸修飾的疏水化HA衍生物。所述的制備方法，其中提供疏水基團(tuán)的物質(zhì)是碳原子數(shù)不小于8的烷基胺，烷基 醇，提供靶向配體的物質(zhì)是葉酸。所述的藥物增溶載體在制備難溶或微溶于水的藥物的制劑中的應(yīng)用其中難溶或 微溶于水的藥物是紫杉烷類、喜樹堿類、長春堿類、蒽醌類、二氫吡啶類、環(huán)孢素類藥物。可采用超聲法和透析法應(yīng)用該藥物增溶載體制備聚合物膠束，載難溶性藥物。超 聲法是將所述的兩親性HA衍生物按1 5mg/mL的濃度溶于水，將難溶或微溶于水的藥物 用藥學(xué)上可接受的溶劑溶解后，滴入所述的兩親性HA衍生物，經(jīng)超聲處理，得到澄清透明 納米膠束溶液離心，過濾處理后，凍干制得粒徑為10 IOOOnm的聚合物膠束即可。透析法 是兩親性HA衍生物和難溶性藥物用適當(dāng)有機(jī)溶劑溶解后，于蒸餾水中透析除去有機(jī)溶劑 和游離藥物，袋內(nèi)液體經(jīng)離心，過濾后，制得粒徑為10 IOOOnm的載藥聚合物膠束。所謂 適當(dāng)溶劑是指藥學(xué)上使用的能溶解該藥物和HA衍生物的溶劑。作為新型藥物運(yùn)載系統(tǒng)的疏水修飾的HA聚合物膠束，其制備方法簡便，制備過程 較少或沒有有機(jī)溶劑的加入，膠束具有獨(dú)特的液相流變學(xué)性質(zhì)，可以形成核_殼結(jié)構(gòu)，其內(nèi) 核能夠作為小分子疏水藥物和大分子蛋白質(zhì)、DNA的良好載體，低的臨界聚集濃度使其能夠 在生理環(huán)境中保持穩(wěn)定，而納米級的半徑又使得這種運(yùn)載系統(tǒng)可以逃脫人體的免疫排除機(jī) 制，通過Era效應(yīng)和受體介導(dǎo)的靶向作用運(yùn)輸藥物到病變組織，同時由于納米粒與客體分 子間是以非共價的方式結(jié)合，使得運(yùn)載的藥物能夠更好的釋放出來。


圖1 吐溫 80 (Tween 80)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremorphor EL)、HA-C18 和 FA-HA-C18 聚合物溶血曲線。圖2 =HA-C18和FA-HA-C18熒光發(fā)射光譜I1A3與聚合物對數(shù)濃度關(guān)系圖。圖3 =Taxol (泰素)、HA-C18和FA-HA-C18載藥膠束對MCF-7細(xì)胞存活率曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (1)疏水烷基修飾HA衍生物的制備HA(IOOmg)溶于5mL甲酰胺中，50°C水浴加熱磁力攪拌使其溶解，冷卻至室溫。加 入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDC，96mg)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，58mg)，冰 浴下磁力攪拌2h。然后將提供疏水基團(tuán)的物質(zhì)溶于5mL無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中， 緩慢滴加到HA混合液中。混合液于60°C氮?dú)猸h(huán)境下攪拌反應(yīng)5h后，于室溫繼續(xù)攪拌24h。 反應(yīng)混合液于過量的水/乙醇混合液(lv/3v lv/lv)依次透析2d，蒸餾水透析2d (透析 袋截留分子量7000)，然后過濾除去不溶性雜質(zhì)，冷凍干燥，得白色固體粉末，即疏水烷基 修飾HA衍生物。(2)葉酸修飾的疏水化HA衍生物的制備
葉酸(220mg)溶于IOmL無水二甲基亞砜(DMSO)中，加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC， 1030mg)和NHS (288mg)，于21°C避光活化5h，過濾除去活化生成的白色沉淀。將濾液緩慢 滴入溶于甲酰胺的HA-C18溶液中，室溫下避光反應(yīng)48h。反應(yīng)液于pH 10的NaHCO3-Na2CO3 緩沖液中透析(透析袋截留分子量7000)，直至透析液于281nm處檢測不到葉酸的紫外吸 收，隨后反應(yīng)液于蒸餾水中透析3d，冷凍干燥，得黃色固體粉末，即葉酸修飾的疏水化HA衍 生物。反應(yīng)路線圖如下 實(shí)施例2兩親性HA聚合物空白膠束制備方法按1 5mg/mL的濃度將兩親性HA衍生物溶于水中，經(jīng)超聲處理，制備成粒徑為 10 IOOOnm的聚合物膠束。實(shí)施例3以兩親性HA衍生物作為載體材料，制備載難溶性藥物聚合物膠束超聲 法兩親性HA衍生物以1 5mg/mL的濃度溶于水后，將難溶性藥物用適當(dāng)溶劑溶解 后，緩慢滴入兩親性HA衍生物水溶液中，磁力攪拌24h，經(jīng)超聲，過濾處理，制得粒徑為10 IOOOnm的載藥聚合物膠束。所謂適當(dāng)溶劑是指藥學(xué)上使用的能溶解該藥物的溶劑。透析法兩親性HA衍生物和難溶性藥物用適當(dāng)有機(jī)溶劑溶解后，于蒸餾水中透析除去有 機(jī)溶劑和游離藥物，袋內(nèi)液體經(jīng)離心，過濾，制得粒徑為10 IOOOnm的載藥聚合物膠束。所 謂適當(dāng)溶劑是指藥學(xué)上使用的能溶解該藥物和HA衍生物的溶劑。采用兩親性HA衍生物作為載體制備載藥膠束，可用于增溶難溶性藥物?？墒褂迷搩捎H性HA衍生物作為載體的難溶性藥物有紫杉醇、阿霉素、羥基喜樹 堿、喜樹堿、多西他賽、長春新堿、尼莫地平、絲裂霉素等。尤其是對紫杉醇、多西他賽、羥基 喜樹堿、喜樹堿、阿霉素有增溶效果，但并不局限于這些所列藥物。實(shí)施例4載紫杉醇HA聚合物膠束的制備(1)超聲法HA衍生物25mg以2. 5mg/mL濃度溶解于水，將理論載藥量分別為10 %，20 %，30 % 的紫杉醇溶解于0. 5mL無水乙醇(甲醇，乙腈)中，緩慢滴加至上述水溶液中，磁力攪拌24h 后，冰浴超聲IOmin (超聲功率200W，工作2s，間歇3s)，溶液于3500rpm離心30min，上清液 過0. 45 μ m濾膜，得到澄清透明溶液，制得三種不同載藥量的納米膠束。(2)透析法
6
Folic acid
DCONHS
COR1
CH2OR2
兩親性HA衍生物25mg和理論載藥量分別為10 %，20 %，30 %的紫杉醇溶解于 5mLDMS0中，室溫下磁力攪拌使其混勻，然后將其轉(zhuǎn)移進(jìn)提前處理好的一定體積的透析袋 中，用蒸餾水進(jìn)行透析24h，除去有機(jī)溶劑和游離紫杉醇。將透析袋內(nèi)液體于3500rpm離心 30min,上清液過0. 45 μ m濾膜，得到澄清透明溶液，制得三種不同載藥量的納米膠束。載藥聚合物膠束中紫杉醇含量的測定采用HPLC法(LC-10AT泵，SPD-10A檢測器，Anastar色譜工作站)測定膠束溶液 中紫杉醇含量。色譜條件色譜柱Phenomenex C18 (250mmX4. 6mm, 5 μ m)；流動相乙腈-水 (55 45)；流速為 1. OmL/min ；柱溫35°C ；檢測波長227nm。本發(fā)明的優(yōu)勢一、該兩親性HA聚合物膠束對以上難溶性藥物均有良好的增溶作用，尤其對紫 杉醇有明顯的增溶效果。以HA接枝十八烷基(HA-C18)和葉酸修飾的HA接枝十八烷基 (FA-HA-C18)為載體材料，制得的空白膠束及載藥膠束的粒徑及其多分散系數(shù)，紫杉醇的包 封率及載藥量結(jié)果見表1。表IHA-C18及FA-HA-C18空白及載藥膠束表征 二、兩親性聚合物具有低分子表面活性劑相似的結(jié)構(gòu)，而低分子表面活性劑對血 細(xì)胞膜有著傷害作用，因此我們考察了 HA兩親性衍生物對細(xì)胞膜的傷害情況。本發(fā)明輔料 可用于血管內(nèi)或肌肉注射和口服水難溶性藥物和蛋白質(zhì)、基因類藥物的載體。作為靜脈給 藥系統(tǒng)，其溶血反應(yīng)符合靜脈注射藥用輔料標(biāo)準(zhǔn)。以HA接枝十八烷基(HA-C18)和葉酸修飾 的HA接枝十八烷基(FA-HA-C18)載體材料為例考察其溶血性。實(shí)施例5以HA接枝十八烷基(HA-C18)和葉酸修飾的HA接枝十八烷基(FA-HA-C18) 載體材料為例考察其溶血性實(shí)驗(yàn)方法取人血4mL，生理鹽水離心(2500rpm，IOmin)洗滌至上清液無色，移取 2mL的血細(xì)胞混懸液到IOOmL的容量瓶，生理鹽水定容至IOOmL,得2%血細(xì)胞混懸液。分別 配制 10mg/mL 的吐溫 80 (Tween 80)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremorphor EL)、HA-C18、FA-HA-C18, 按表1配制得到濃度為0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. OU. 5、2、4mg/mL的樣品溶液，搖勻后，置于 37°C恒溫水浴中。9號管和10號管分別為0%溶血和100%溶血。37°C孵育2h后，3000rpm 離心lOmin，取上清液，于416nm紫外分光光度計(jì)測定其吸收值，以空白樣品為對照。按下列 公式計(jì)算溶血百分?jǐn)?shù)。
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表1溶血實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以樣品在試管中的終濃度為橫坐標(biāo)，以溶血百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，得到溶血曲線，見圖 1。HA-Cli^PFA-HA-C18自組裝膠束的溶血性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Tween 80，在濃度為lmg/mL時，HA-C18 和FA-HA-C18自組裝膠束僅溶血13. 7%和15. 7%，而Tween 80組溶血為79. 1%。可見HA-C18 和FA-HA-C18自組裝膠束溶血性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Tween 80。Cremophor EL的溶血性略低于HA-C18 和FA-HA-C18自組裝膠束，但差異并不明顯。本發(fā)明中其他HA衍生物的溶血情況與HA-C18 和FA-HA-C18相似。因此，相對于Tween 80和Cremophor EL而言，HA衍生物是良好的可靜 脈注射的藥用輔料。實(shí)施例6HA兩親性衍生物的臨界膠束濃度(CMC)的測定自聚集體在水相中的形成可以用熒光光譜法進(jìn)行研究，利用芘作為分子探針。芘 是一種幾乎不溶于水，在極性環(huán)境下可以自我促滅的試劑。當(dāng)自聚集體或其它的疏水微區(qū) 在水溶液中形成的時候，芘依賴疏水相互作用會靠近或進(jìn)入疏水微區(qū)內(nèi)部，由于芘密集的 芳香族結(jié)構(gòu)對極性非常敏感，就會產(chǎn)生強(qiáng)烈的激發(fā)態(tài)熒光。CMC可以通過觀測芘散射熒光光 譜峰1與峰3之間熒光強(qiáng)度比率的變化來確定。以HA接枝十八烷基(HA-C18)和葉酸修飾 的HA接枝十八烷基(FA-HA-C18)載體材料為例考察其臨界膠束濃度。精密稱定HA-C18(FA-HA-C18) 10mg，分散于少量蒸餾水中，探頭超聲IOmin (超聲功 率200W，工作2s，間歇3s)后，以蒸餾水定容至IOmLdf lmg/mL的HA-C18(FA-HA-C18)水溶 液用水稀釋成不同濃度(終濃度分別為1 X 10_3，5 X 10_3，1 X 10_2，2 X 10_2，4X 10_2，5 X 10_2， 8 X Kr2，1 X IiT1，2 X IiT1，5 X lO^mg/mL)的 HA-C18 (FA-HA-C18)水溶液各 10mL，分別加入到經(jīng) 丙酮重結(jié)晶的定量的芘(終濃度6X 10_7mOl/L)，混合液于25°C水浴振蕩過夜，利用熒光分 光光度計(jì)測定芘的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長336nm，發(fā)射波長I1 = 373nm, I3 = 384nm。以log C(mg/mL)與芘在373nm與384nm處的熒光強(qiáng)度比值(I373A384)作圖(圖 2)，曲線的拐點(diǎn)即為該聚合物CMC值。計(jì)算得HA-C18與FA-HA-C18的CMC分別為10. O μ g/ mL和11. 2 μ g/mL，表明以HA-C18和FA-HA-C18為載體材料制成的聚合物膠束具有良好的稀 釋穩(wěn)定性。實(shí)施例7疏水化修飾HA聚合物載藥膠束體外細(xì)胞毒性研究MTT法是建立于20世紀(jì)80年代初的一種檢測細(xì)胞存活和增殖能力的一種試驗(yàn) 方法。顯色劑四唑鹽是一種能接受氫原子的生物活性染料，化學(xué)名是3-(4，5_ 二甲基噻 唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽，商品名是噻唑藍(lán)，簡稱為MTT?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物Formazan并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。Formazan的生成量與細(xì)胞釋放出的酶活性成正比，而酶活性與活細(xì)胞數(shù)目及細(xì) 胞活力成正比，通過測定Formazan的量可以直接反應(yīng)活細(xì)胞的狀態(tài)和數(shù)目。Formazan在570nm處有最大吸收，將生成的Formazan溶解于DMSO后，通過測定 570nm處的吸光度值可以間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量。MTT法在細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞生長代謝有 關(guān)的試驗(yàn)中應(yīng)用非常廣泛，也是體外評價藥物的抗腫瘤活性、篩選抗腫瘤藥物的有效方法。制劑實(shí)驗(yàn)組載紫杉醇HA-C18和FA-HA-C18膠束，培養(yǎng)液稀釋至紫杉醇終濃度為1， 10，100ng/mL,1，10，100 μ g/mL。制劑對照組市售制劑Taxol，培養(yǎng)液稀釋至紫杉醇終濃度為1，10，100ng/mL, 1， 10,100 μ g/mL。將人乳腺癌細(xì)胞株MCF_7(葉酸敏感細(xì)胞株)以3X IO4ceIls/孔的密度接種到96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時貼壁生長后，按以上實(shí)驗(yàn)方案給予含藥培養(yǎng)液和對照溶液，每一 濃度平行3孔，然后繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加2mg/mL的MTT液50 μ L，37°C繼續(xù) 培養(yǎng)3. 5h后，終止培養(yǎng)，甩板棄去上清液，每孔加200 μ L DMS0，避光振蕩IOmin使結(jié)晶物充 分溶解。以酶標(biāo)儀檢測570nm處的吸光度值(Α)。按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。
牛長抑制率(％) = (1 - 力口航·雌)χ 100% 生長抑制軍(/。) (1 對照孔吸光度值三種制劑Taxo 1，HA-C18和FA-HA-C18載藥膠束與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)48h后，用 MTT法檢測得到的細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖3所示。隨著藥物劑量的增加，不同制劑作用下的 MCF-7細(xì)胞的存活率逐漸下降。其中，HA-C18和FA-HA-C18載藥膠束的細(xì)胞存活率明顯低于 市售制劑Taxol，這表明疏水化修飾HA聚合物膠束增強(qiáng)了抗腫瘤藥物紫杉醇的細(xì)胞毒性。 而接枝靶向配體葉酸的FA-HA-C18載藥膠束對細(xì)胞的抑制作用高于HA-C18載藥膠束，可能是 因?yàn)镕A-HA-C18表面修飾的葉酸與腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體結(jié)合，介導(dǎo)納米粒內(nèi)吞進(jìn)入細(xì) 胞，從而更有效地抑制了細(xì)胞的生長。
權(quán)利要求
一種藥物增溶載體，其特征在于，該載體是在透明質(zhì)酸骨架上接枝疏水性的烷基與靶向配體葉酸，使其能在水中自組裝形成聚合物膠束，并能靶向藥物至腫瘤組織的具有兩親性的透明質(zhì)酸衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物增溶載體，其特征在于，所述的接枝疏水性的烷基與 靶向配體葉酸是指疏水性的烷基取代透明質(zhì)酸葡萄糖醛酸單元中的羧基，總?cè)〈? 30%，靶向配體葉酸取代透明質(zhì)酸葡萄糖胺單元中的羥甲基，總?cè)〈? 10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物增溶載體，其特征在于疏水性的烷基碳原子數(shù)不低 于8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物增溶載體，其特征在于所選用的透明質(zhì)酸分子量為 5X103 1X105。
5.如權(quán)利要求1所述的藥物增溶載體的制備方法，其特征在于包括下列步驟透明質(zhì)酸溶于甲酰胺中，30 50°C水浴加熱磁力攪拌使其溶解，冷卻至室溫，加入 1-乙基-3-(3- 二甲氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，冰浴下磁力攪拌2h ；然后將 提供疏水基團(tuán)的物質(zhì)溶于無水N，N-二甲基甲酰胺中，緩慢滴加到透明質(zhì)酸混合液中；混合 液于60°C水浴氮?dú)猸h(huán)境下攪拌反應(yīng)5h后，于室溫繼續(xù)攪拌24h，反應(yīng)混合液于過量的水/ 乙醇混合液1/3 1/1 (ν/ν)中依次透析2d，蒸餾水透析2d，透析袋截留分子量7000，然后 過濾除去不溶性雜質(zhì)，冷凍干燥，得白色固體粉末；葉酸溶于無水二甲基亞砜中，加入二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，于21 °C避 光活化5h，過濾除去活化產(chǎn)生的白色沉淀，將濾液緩慢滴入溶于甲酰胺的透明質(zhì)酸-C18溶 液中，室溫下避光反應(yīng)48h，反應(yīng)液于pHIO的NaHCO3-Na2CO3緩沖液透析，透析袋截留分子 量7000，直到透析液于281nm處檢測不到葉酸的紫外吸收，隨后反應(yīng)液于蒸餾水中透析 3d，冷凍干燥，得黃色固體粉末。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于提供疏水基團(tuán)的物質(zhì)是碳原子數(shù)不小 于8的烷基胺，烷基醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的藥物增溶載體，其特征在于，藥物增溶載體通過 超聲法或透析法制備聚合物膠束，包載難溶或微溶于水的小分子藥物，蛋白質(zhì)、基因類藥 物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物增溶載體，其特征在于所述的難溶或微溶于水的小分子 藥物是紫杉烷類、喜樹堿類、蒽醌類抗腫瘤藥或二氫吡啶類、非留體抗炎藥中的任一物質(zhì)或 其衍生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物增溶載體，其特征在于所述的超聲法是將所述的兩親 性透明質(zhì)酸衍生物按1 5mg/ml的濃度溶于水，將難溶或微溶于水的藥物用有機(jī)溶劑溶解 后，滴入所述的兩親性透明質(zhì)酸衍生物水溶液中，經(jīng)超聲處理，得到澄清透明納米膠束溶液 離心處理，凍干制得粒徑為10 IOOOnm的聚合物膠束即可；透析法是兩親性透明質(zhì)酸衍生物和難溶性藥物用有機(jī)溶劑溶解后，于蒸餾水中透析除 去有機(jī)溶劑，袋內(nèi)液體經(jīng)離心，過濾后，制得粒徑為10 IOOOnm的載藥聚合物膠束。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物增溶載體，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為能溶解該藥 物和透明質(zhì)酸衍生物的溶劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物可降解的藥物增溶載體透明質(zhì)酸兩親性衍生物的制備方法及其作為藥物載體的應(yīng)用。這類衍生物是通過在透明質(zhì)酸骨架引入疏水性烷基鏈和主動靶向配體分子，如葉酸，使其具有兩親性，在水中自組裝形成聚合物膠束，并有效地靶向傳遞藥物至腫瘤組織。該輔料安全性好，臨界膠束濃度低，通過疏水基團(tuán)和透明質(zhì)酸分子鏈與藥物的雙重作用將藥物包裹于疏水內(nèi)核?？梢宰鳛殡y溶性藥物，蛋白質(zhì)和基因類藥物的載體，載藥量高，藥物包封率高，穩(wěn)定性好，可用于靜脈或肌肉注射和口服途徑給藥。本發(fā)明制備方法簡單，工藝成熟，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號A61K47/22GK101897976SQ20101022896
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者何仲貴, 劉曉紅, 劉艷華, 孫英華, 孫進(jìn), 王永軍 申請人:沈陽藥科大學(xué)