專利名稱：護骨膠囊在預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及中藥護骨膠囊在預(yù)防由糖皮質(zhì)激素引起 的骨質(zhì)疏松疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)是臨床上應(yīng)用較多的一類藥物，但是大劑 量應(yīng)用GCs可能導(dǎo)致多種并發(fā)癥，GCs誘導(dǎo)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis,GI0)就是其中之一。地塞米松(Dex)是GCs的一種，因其具有良好的抗炎、 抗免疫作用而在臨床上應(yīng)用極為廣泛，但長期大劑量使用Dex，可造成GIO等一系列嚴重的 不良反應(yīng)，即使是生理劑量的Dex也可引起骨丟失等骨質(zhì)疏松綜合癥狀。GIO先是引起骨 丟失，繼而導(dǎo)致骨折，嚴重影響了患者的健康狀況和生活質(zhì)量。目前臨床上防治骨質(zhì)疏松 (osteoporosis,0P)所用的西藥多以局部靶點為作用位點，這種療法對OP這種多因多果的 代謝性疾病的治療存在著一定的局限性。中醫(yī)藥主張多途徑、多靶點的用藥機制，因此從中 醫(yī)藥中尋找治療GIO的藥物意義重大。中藥護骨膠囊(HuGu capsule, HG)，以補腎、健脾、活血化瘀組方，其中組方為何 首烏、淫羊藿、熟地、龜甲、巴戟天、杜仲、續(xù)斷、骨碎補、當(dāng)歸、山藥。前期研究發(fā)現(xiàn)HG防治 原發(fā)性骨質(zhì)疏松療效顯著，而且該藥具有多方面調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的作用。中醫(yī)認 為GIO的發(fā)病與腎虛有關(guān)，因而根據(jù)HG的組方，推測其可能具有預(yù)防GIO的作用。為了探 討HG是否可以預(yù)防GI0，本發(fā)明通過GCs誘導(dǎo)實驗動物GI0，采用骨形態(tài)計量學(xué)和骨生物力 學(xué)的方法，觀察HG對GIO的預(yù)防作用，為開發(fā)HG的新用途提供實驗依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于將中藥護骨膠囊，簡稱HG，開發(fā)出一種新用途，將其用在原發(fā) 性骨質(zhì)疏松治療的基礎(chǔ)上開發(fā)為繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的預(yù)防，即糖皮質(zhì)激素(GCS)所致的骨質(zhì) 疏松GIO的預(yù)防應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的通過動物實驗，確定藥效和定量指標。1動物模型、取材部位及實驗方法的選擇1. 1動物模型及取材部位的選擇GIO非常普遍，日益受到人們的重視。隨著GIO預(yù)防和治療的發(fā)展，需要對這一疾 病做更深入和廣泛的了解，因此，選擇并建立一個理想的動物模型和合適的研究方法，是探 討GIO病因和尋找治療藥物的關(guān)鍵。1)動物模型的選擇大鼠價格便宜，管理方便，生長迅速，生命周期短，有很好表型的骨骼系統(tǒng)，遺傳種 系清楚，能再現(xiàn)人類OP的狀態(tài)，而且重復(fù)性好。陸邦超等人以Dex lmg/kg肌肉注射大鼠，每周2次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8w后，這些大鼠 的骨密度、骨生化、骨力學(xué)、骨組織形態(tài)學(xué)指標均出現(xiàn)了顯著性變化，說明這些大鼠造模成功。為保證動物模型的高成功率及低死亡率，我們認為最佳造模劑量應(yīng)為0. 25mg/100g體 重，此劑量約為Olgaard報導(dǎo)90天成模劑量的4倍，又遠低于彭國瑞報導(dǎo)的的長期應(yīng)用激 素的最小致死量。因此本實驗以肌肉注射0以(2次/ ，2.51^/1^/次，64的方式制造GIO 的動物模型。2)取材部位的選擇骨組織是組織嚴密、排列有序的致密結(jié)締組織。骨強度與骨量、骨結(jié)構(gòu)和微結(jié)構(gòu)以 及骨質(zhì)量密切相關(guān)。依據(jù)骨結(jié)構(gòu)密度的不同，將骨分為皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨。皮質(zhì)骨體積是松 質(zhì)骨體積的4倍，但松質(zhì)骨較皮質(zhì)骨有更大的表面積，在骨代謝中發(fā)揮重要作用。皮質(zhì)骨在長骨可分為內(nèi)外骨板和骨單位，骨板為實質(zhì)，排列緊密，與最大力學(xué)載荷 相對應(yīng)。皮質(zhì)骨有兩面骨內(nèi)膜和骨外膜。骨內(nèi)膜的細胞常排列成一層，靜止時候扁平，活 躍時分化為成骨細胞，在骨轉(zhuǎn)換中起重要作用。松質(zhì)骨分布于長骨的干骺端、椎體等處，其束狀或板狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成三維分支網(wǎng)架，狀 如“腳手架”，承受力學(xué)負荷，對皮質(zhì)骨的支撐作用尤為重要。松質(zhì)骨是骨代謝最活躍的部 位，也是骨丟失最早出現(xiàn)的區(qū)域。選用鼠類做力學(xué)試驗的動物模型時，一般只能選用對長骨 的彎曲和對脊椎骨的壓力測試。因此本實驗的取材部位包括PTM、TX、LF和LV。1.2實驗方法的選擇1.2. 1骨組織形態(tài)計量學(xué)骨組織形態(tài)計量學(xué)(bone histomorphometry)是基于OP的細胞和組織學(xué)形態(tài)發(fā) 生改變導(dǎo)致功能改變而進行的一種體視學(xué)定量研究技術(shù)。該技術(shù)通過應(yīng)用數(shù)學(xué)和幾何學(xué)的 方法對骨組織水平的質(zhì)(骨結(jié)構(gòu))和量(骨量)等形態(tài)學(xué)變化的相當(dāng)部位的形態(tài)計量學(xué)觀 察，可以科學(xué)地對骨建造和骨重建兩個過程，特別是可以對實驗藥物對骨的吸收過程和骨 的形成過程進行客觀的和科學(xué)的評價，可以更清楚地了解到藥物作用于骨代謝的具體環(huán)節(jié) 以及藥物對骨的作用及作用機制，是OP防治藥物藥效學(xué)研究的重要評價指標。美國食品和 藥品管理局(FDA)對防治OP癥新藥研究的藥效學(xué)指南指出，確定藥效的定量指標，必須提 供骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)，從參數(shù)中提供該新藥的作用機制和作用環(huán)節(jié)(骨重建、骨吸收 和骨形成)。1.2. 2骨生物力學(xué)骨生物力學(xué)檢驗直接反映防治骨質(zhì)疏松藥物對骨組織結(jié)構(gòu)的力學(xué)效應(yīng)，是研制和 開發(fā)防治骨質(zhì)疏松新藥的一個重要檢驗手段。骨在受到外力時，其內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)和外部形 態(tài)都將隨之改變，這種改變直接反映在骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)性能的變化上。骨所能承 受的載荷、變形等是反映骨結(jié)構(gòu)力學(xué)特征的指標，這些指標受骨尺寸大小和幾何形狀的影 響，OP時，骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)性能參數(shù)均有不同程度的下降，骨抵抗外力的能力降低，骨脆性增 加，輕微外力即引起骨折。因此力學(xué)性能參數(shù)是反映和評價骨質(zhì)量的最直接的指標，故美國 FDA發(fā)布的《0P指南》中要求有關(guān)OP的實驗應(yīng)進行骨強度的生物力學(xué)測定。盡管骨密度測 定常作為臨床評價OP的替代方法，但是直接的生物力學(xué)測試為臨床前研究無疑能夠提供 更多有關(guān)骨力學(xué)性質(zhì)的信息，因而，將生物力學(xué)測試作為一種“金標準”測試手段。骨生物 力學(xué)測試直接反映了防治OP藥物對骨組織結(jié)構(gòu)的力學(xué)強度的影響，是研制和開發(fā)防治OP 新藥的一個重要手段。因此，本發(fā)明采用骨形態(tài)計量學(xué)和骨生物力學(xué)的方法，研究了 Dex及HG對大鼠皮質(zhì)骨TX、LF和松質(zhì)骨PTM、LV的影響情況，從而由此評價HG對GIO的預(yù)防作用。2HG對Dex造模大鼠的影響2. IHG對Dex造模大鼠體重和軟組織重量的影響本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，HG沒有增加短期使用Dex的造模大鼠的體重，其體重仍低于 Ctrl組。長期使用Dex的大鼠的體重，是否通過長期使用HG-M干預(yù)，而得以恢復(fù)，需要進行 Dex與HG的長期實驗加以證實。與Mod組相比，HG_L、M組大鼠腎臟的重量顯著增加，而且HG-M組大鼠腎臟的重量 明顯高于GSB組。其它各組大鼠的脾臟的重量與Ctrl組相比顯著減少，而HG-M組大鼠脾 臟的重量與Ctrl組相比，卻沒有變化。說明HG-M對短期使用Dex導(dǎo)致大鼠的腎臟和脾臟 的重量下降產(chǎn)生了明顯的抑制效果。2. 2HG對Dex造模大鼠TX形態(tài)計量學(xué)的影響中藥HG，可以預(yù)防Dex誘發(fā)的皮質(zhì)骨的骨丟失，其中HG-M的效果比HG-L和HG-H 好。其機理為通過增加骨內(nèi)膜的熒光周長和骨形成率，并且降低破骨細胞的骨吸收率，從而 增加皮質(zhì)骨的骨量。由此認為(I)HG增加了 Dex造模大鼠皮質(zhì)骨的骨量。低劑量的HG既可抑制Dex 導(dǎo)致的皮質(zhì)骨的減少；中劑量的HG的這種抑制作用最強；而高劑量的HG的抑制作用不如 中劑量HG。(2)HG增加了 Dex造模大鼠皮質(zhì)骨的骨量的機理與促進骨形成和抑制骨吸收有 關(guān)。(3) GSB降低骨吸收，而未提高骨形成，這提示HG防治GIO的效果可能好于GSB。2. 3HG對Dex造模大鼠PTM形態(tài)計量學(xué)的影響從本發(fā)明的研究結(jié)果可以看出雖然Dex未造成PTM的骨丟失，但HG-M與Mod相 比，仍能增加MAR、減少Oc. N，從而使骨小梁的骨量％ Tb. Ar顯著增加。而且這一作用還超 過Ctrl和GSB。HG增加了松質(zhì)骨的MAR，MAR代表了成骨細胞的活性。這個結(jié)果與HG對 皮質(zhì)骨作用的機理不同，HG對皮質(zhì)骨的作用機理是增加％ L. Pm，此指標代表成骨細胞的數(shù) 量，這也說明HG預(yù)防GIO的多途徑多靶點的特點。2. 4HG對Dex造模大鼠LV和LF骨生物力學(xué)的影響HG對Dex誘導(dǎo)的大鼠LF皮質(zhì)骨的生物力學(xué)性能參數(shù)沒有影響，可能與骨骼的幾 何形狀改變有關(guān)。在自然環(huán)境的適應(yīng)和改造過程中，骨頭得到不斷的進化，得到了最優(yōu)化的 結(jié)構(gòu)形態(tài)。也就是說，骨以最優(yōu)化的結(jié)構(gòu)形態(tài)趨適應(yīng)相應(yīng)的力學(xué)環(huán)境。同時，當(dāng)力學(xué)環(huán)境改 變時，骨的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生變化，仍以最優(yōu)結(jié)構(gòu)形態(tài)去適應(yīng)新的環(huán)境。但是HG-M組LV松 質(zhì)骨的生物力學(xué)參數(shù)中，最大載荷、最大應(yīng)力、最大變形均顯著性提高(P <0.05)。最大應(yīng) 力主要受骨骼無機相質(zhì)量的影響，屬于骨材料力學(xué)的指標，它們反映的是骨的材料本身的 力學(xué)性能，而與骨的大小及形態(tài)無關(guān)，主要由骨的構(gòu)成成分及膠原的含量、排列決定。骨最 大載荷和最大變形可反映骨力學(xué)強度和骨韌性，是骨結(jié)構(gòu)力學(xué)的重要指標，骨質(zhì)疏松時，骨 的力學(xué)強度和骨韌性下降，易于發(fā)生骨折。Pak等學(xué)者研究認為，單純骨密度的提高與實際 骨質(zhì)量的改善之間有時存在明顯偏差。單憑骨密度并不能準確地反映骨質(zhì)量的變化，還需 要觀察生物力學(xué)性能指標，它們可以反映骨的內(nèi)在質(zhì)量和性能的改變，能夠表示骨的強度 和抵抗外力的能力。在骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中，最初表現(xiàn)為松質(zhì)骨的骨量下降，隨后皮質(zhì)骨變 薄，骨髓腔增大，骨強度減弱，導(dǎo)致抗外力作用下降。其中松質(zhì)骨的生物力學(xué)檢測的敏感性 相對較高。本實驗中，HG-M組大鼠LF的骨材料和骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能與模型組相比，均明顯提
5高，表明HG可改善骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨生物力學(xué)指標，具有抗GIO的作用。3 結(jié)論本發(fā)明的治療原發(fā)性O(shè)P的中藥-HG，可以預(yù)防Dex誘發(fā)的皮質(zhì)骨的骨丟失，其中 HG-M的效果要比HG-L和HG-H好。其機理為通過增加骨內(nèi)膜的熒光周長和骨形成率，并且 降低破骨細胞的骨吸收率，從而增加皮質(zhì)骨的骨量。HG對大鼠皮質(zhì)骨生物力學(xué)性能不影響， 這是由于骨骼幾何形狀的變化符合力學(xué)的結(jié)構(gòu)有關(guān)。本實驗Dex未造成松質(zhì)骨的骨丟失， 但與Dex和Ctrl比，HG-M仍可促進松質(zhì)骨的成骨細胞的活性(MAR)，抑制破骨細胞的吸收 功能，進而增加松質(zhì)骨的骨量。而且，大鼠腰椎松質(zhì)骨的生物力壓縮實驗顯示，HG-M改善了 腰椎松質(zhì)骨的材料力學(xué)狀況。上述結(jié)果提示HG可能具有預(yù)防Dex誘導(dǎo)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松 (GIO)的作用。本發(fā)明的有益效果為短期、間斷使用Dex (6w, 2. 5mg kg-l,2/w)，僅使大鼠皮質(zhì)骨丟失，由于骨骼幾何形狀的變化符合力學(xué)的結(jié)構(gòu)要求，因而并未改變大鼠骨骼 的生物力學(xué)性能。此結(jié)果提示Dex的短期使用對大鼠不同部位的骨骼影響程度不同，先出 現(xiàn)皮質(zhì)骨的骨丟失，而未出現(xiàn)松質(zhì)骨的骨丟失。中藥HG可以預(yù)防Dex誘導(dǎo)的皮質(zhì)骨的骨丟失，其中HG-M的綜合效果要比HG_L、H 好。其機理是通過增加骨內(nèi)膜的熒光周長和骨形成率，并且降低破骨細胞的骨吸收率，從 而增加皮質(zhì)骨的骨量。雖然Dex未造成松質(zhì)骨的骨丟失，但與Dex和Ctrl比，HG-M仍可促 進松質(zhì)骨的形成和礦化，抑制破骨細胞的吸收功能，進而增加松質(zhì)骨的骨量。而且，HG-M還 改善了大鼠腰椎松質(zhì)骨的生物力學(xué)性能，也就是提高了松質(zhì)骨的材料力學(xué)和結(jié)果力學(xué)的功 能。提示HG具有預(yù)防Dex誘導(dǎo)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松(GIO)的作用。


圖1是TX的橫切面和PTM的縱切面暴露圖。
圖2是TX測量范圍圖。
圖3是PTM測量范圍圖。
圖4是股骨三點彎曲試驗圖。
圖5是椎骨壓縮試驗圖。
圖6是HG對大鼠體重的影響圖。
圖7是HG對大鼠軟組織重量的影響圖。
圖8是HG對大鼠TX形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的影響圖。
圖9是HG對大鼠TX形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的影響圖。
圖10是HG對大鼠PTM形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的影響圖。
圖11是HG對大鼠PTM形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的影響圖。
圖12是HG大鼠腰椎生物力學(xué)性能的影響圖。
具體實施例方式下面結(jié)合說明書附圖，進一步說明本發(fā)明。護骨膠囊(HG)是根據(jù)“君、臣、佐、使”的配伍，采用補肝腎，益精血，調(diào)理陰陽的治則，輔以養(yǎng)血活血，祛風(fēng)除濕，強筋壯骨，止痛鎮(zhèn)靜之法，經(jīng)一定工藝加工而成的中藥復(fù)方膠 囊制劑。其中，制何首烏、淫羊藿補肝腎，益精血，祛風(fēng)濕，在本方中為“君藥”；而熟地黃、龜 甲則滋腎陰，補血養(yǎng)陰，在方中為“臣藥”；再“佐”以巴戟天、杜仲、續(xù)斷、骨碎補等補肝腎，強 筋骨，祛風(fēng)濕藥物加強君藥的作用，還增加了鎮(zhèn)痛的效果，使本方在治療OP的同時，兼止痛 鎮(zhèn)靜進而更有效發(fā)揮本方的綜合作用；而當(dāng)歸、山藥作為“使藥”則有補血益精之效。是在 中醫(yī)理論指導(dǎo)下形成的國家中藥新藥(新藥證書編號國藥證字Z20040106)，目前已經(jīng)生 產(chǎn)銷售近五年，在臨床應(yīng)用上已獲得了很好的防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松的療效，但從HG的組方 來看，其對GIO的防治也有一定的理論基礎(chǔ)，推測其可能具有防治骨質(zhì)疏松的作用。1動物模型的準備Dex制造OP動物模型選用SPF級SD雌性大鼠，每周給予Dex兩次，每次 2. 5mg/0. 5ml/kg，共計6w。分析和研究Dex對大鼠體重、軟組織重量以及不同部位骨骼的影 響。HG對大鼠GIO的預(yù)防。Dex制造OP動物模型的同時，給予HG干預(yù)，分析HG對Dex 造模大鼠體重、軟組織重量的干預(yù)情況；選用骨形態(tài)計量學(xué)和骨生物力學(xué)的方法，研究HG 對Dex造模大鼠不同部位骨骼的干預(yù)作用，探討HG對GIO的預(yù)防。2實驗材料2. 1主要藥品
藥品廠家規(guī)格批號地塞米松磷酸鈉注射液天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司5mg/ml0807031骨松寶膠囊貴州富華藥業(yè)有限責(zé)任公司0. 5g/ 粒20080909護骨膠囊東莞萬成制藥有限公司0. 45g/ 粒200803022. 2主要試劑
碳化鎢鋼刀Leica Co. GermanyJB-2型恒溫磁力攪拌器上海雷磁儀器廠新涇分廠TEC-2500病理組織漂烘儀Histo-line laboratoryDHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科技有限公司Bioquant-Osteo骨形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)BIOQUANT USA2. 4實驗動物及飼養(yǎng)條件實驗動物SPF級SD大鼠60只，雌性，3m齡，體重(200 士 20)g。由廣州中醫(yī)藥大 學(xué)實驗動物中心提供，質(zhì)量合格證編號SCXK (粵)20080020。飼養(yǎng)條件實驗動物分籠，每籠5只，飼養(yǎng)于室溫24 28°C，相對濕度50% 70% 的清潔環(huán)境中。隔日更換墊料，自由攝食和攝水。3實驗方法3. 1動物分組和給藥方案60只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)Iw后，按照體重分層隨機分組的原則，分為6組，
正常對照組(Ctrl)................................................45d
(Mod) ********************氺* 氺*氺****+***********‘ 5 d
PHf^i^^liS (GSB) nnunmuuunuuunnnnmmu^nnnunnuuA5d HG低劑量組(HG~L) mmmmmmmmmmmmmmm@4:3d HG 中齊0 量組(HG-M) &&&M&&M&&&&M&&M&M&&&&&&M&45 d HG高劑量組(HG- 具體分組及給藥方案見下表
組別數(shù)量給藥方案Groupηdose scheduleCtrl1010ml/kg/d 0. 9% NaCl (ig) +4. 5mg/0. 5ml/kg/2/w 0. 9% NaCl (im)Mod10lOml/kg/d 0. 9% NaCl (ig) +2. 5mg/0. 5ml/kg/2/w Dex (im)GSB100. 3g/10ml/kg/d GSB (ig) +2. 5mg/0. 5ml/kg/2/w Dex (im)
9 注ig 灌胃；im 肌注。ml/kg/d/2/w 每周兩次給藥，每次每公斤大鼠體重的給藥 毫升數(shù)。大鼠給藥時間為每天9 OOam-IO 00am，每只大鼠每w稱重一次，并按重量調(diào)整給藥 量，給藥時間為6w。3. 2動物熒光標記及取材每只大鼠于處死前14d、13d和3d、2d分別皮下注射(ih)鈣黃綠素(Calcein) 5mg/ kg進行體內(nèi)熒光標記，以在骨表面形成綠色雙熒光標志，兩次熒光標記間隔為lid。用藥結(jié) 束時，用3%戊巴比妥鈉(0. 5ml/kg)腹腔注射(ip)麻醉后右心室抽血處死，取其軟組織 肝臟(liver)、脾臟(spleen)、腎臟(kidney)、肺臟(lung)以及左脛骨(left tibia, LT)、 左股骨(left femur，LF)、第五腰椎(th left of fifth lumbar vertebra，LV)，去除肌肉， Low speed saw 鋸出胚骨上段(proximal tibia, PTM)和中段(tibia shaft，TX)。3. 3骨組織形態(tài)計量學(xué)方法3. 3. 1不脫鈣骨標本的包埋3. 3. 1. 1包埋前脛骨的處理1)暴露骨髓腔用Low speed saw將TX的橫切面和PTM的縱切面暴露，見圖1。2)骨標本的固定將暴露切面的PTM和TX，立即投入4%多聚甲醛固定液中固定 24-48h。3. 3. 1. 2包埋前單體(甲基丙烯酸甲酯)的洗脫1)將1500ml的甲基丙烯酸甲酯倒入分液漏斗(3L)中；2)加入5% NaOH溶液500ml，充分搖勻，靜置，待溶液分層后，放出下層溶液，棄 去；3)重復(fù)操作“2)”三次，三次的下層溶液的總量和單體量相當(dāng)(洗脫阻滯劑)；4)加入500ml蒸餾水，充分搖勻，靜置，待溶液分層后，放出下層溶液，棄去；5)重復(fù)操作“4) ” 2-3次，直至分液漏斗內(nèi)液體澄清，三次的下層溶液的總量大約 和單體量相當(dāng)(洗脫NaOH)；6)將上述處理過的單體放入無水氯化鈣中，脫水兩次(1000ml :500g)；7)濾紙過濾，收集濾液；8)-20°C保存上述濾液，第二天取出觀察有無冰晶漂浮，若無，表明無水，可備用； 若有，則需重新脫水；3. 3. 1.3標本的脫水依次用70%、95%乙醇脫水，各2d ；100%酒精脫水兩次，各Id ；二甲苯透明Id。3. 3. 1.4骨標本的滲透先后用浸液I、浸液II、浸液III分別浸透骨標本，各2d。注三種浸液的配置方法如下
浸液I甲基丙烯酸甲酯90ml，鄰苯二甲酸二丁酯10ml，磁力攪拌器上攪拌3h。浸液II甲基丙烯酸甲酯90ml，鄰苯二甲酸二丁酯10ml，過氧化苯甲酰l.Og，磁力 攪拌器上攪拌4h。浸液III甲基丙烯酸甲酯90ml，鄰苯二甲酸二丁酯10ml，過氧化苯甲酰2. 5g，磁力 攪拌器上攪拌6h。以上為TX骨標本的浸液配置方法，其中過氧化苯甲酰使用前已干燥。PTM骨標本 的浸液中，甲基丙烯酸甲酯與鄰苯二甲酸二丁酯的比例為3 1，過氧化苯甲酰的比例不變。3. 3. 1. 5骨標本的包埋1)TX的包埋需在包埋前幾天(視當(dāng)時的溫度確定，一般提前2-3d即可)預(yù)先倒 少量(約4ml)新鮮配置的浸液III于小玻璃瓶中作TX包埋塊的底部，蓋好瓶蓋，于水平陰 涼處靜置，浸液聚合變硬后以1.5cm高為宜。包埋時將TX平放于包埋塊底部，脛腓結(jié)合處 貼靠瓶壁，每個TX的放置角度相同。在TX上加入2cm高的(約4ml)新鮮配置的浸液III， 蓋好瓶蓋，于水平陰涼處靜置，直至包埋塊形成。2)PTM的包埋將新鮮配置的浸液III倒入容積約為12ml的小瓶中，PTM剖面貼平 底中部，骨骺端離開瓶壁一定距離，倒入的包埋劑約8ml，蓋好瓶蓋，于水平陰涼處靜置，直 至包埋塊形成。3. 3. 2不脫鈣骨組織片的制備3.3.2. 1載玻片的制備1)清洗防脫玻片在酸缸中浸泡Id后，取出，先用自來水沖洗，后用單蒸水，雙蒸水 沖洗，晾干。2)上膠IOOOml蒸餾水中加入9g明膠，加熱至溶液沸騰，將另配置的4%澄清硫 酸鉻鉀溶液倒入沸騰的明膠溶液中，不斷攪拌混合液至溶質(zhì)溶解，停止加熱，待混合液(膠 液)冷卻至50°C 55°C即可，倒此膠液于恒溫水浴箱的玻璃缸中，將裝入提籃的載玻片在 此膠液中浸泡2min，使膠體粘附均勻，取出放入晾片板上，晾干備用。3)切片(1)打磨敲碎小玻璃瓶后，取出TX和PTM包埋塊。用石膏打磨機將其打磨至適當(dāng) 大小。(2)切片TX將打磨好的TX塊狀物固定在Leica SP1600型鋸片機鋸片機上，鋸出 45μπι的切片，以脛腓骨分理處為第一片，依次往下鋸，每個TX塊狀物共計鋸5片。PTM將 打磨好的PTM塊狀物固定在Leica RM2500切片機上，切出5μπι和9μπι的薄片，每個PTM 塊狀物切5 μ m的薄片10片和9 μ m的薄片6片。用兩支沾有40%乙醇的軟毛刷輕輕地將 此薄片轉(zhuǎn)移到滴有一滴70%乙醇的明膠玻片上，然后使用兩把眼科鑷慢慢地展平切片，蓋 上一張事先備好的大小合適的薄塑料片，并用濾紙將多余的乙醇吸干。每個明膠玻片貼相 同寬度的薄片2片，每個塊狀物需明膠玻片8片。(3)烤片將切好的一組片，用夾子夾緊后，于40°C左右的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中 烘約6h，取出備用。4) TX骨切片封片將上述已經(jīng)切好的45 μ m TX骨切片按下法處理步驟一 45μπι TX骨切片
步驟二 超聲波 清洗2min步驟三蒸餾水 漂洗步驟四70%乙醇浸潤步驟五95%乙醇浸潤步驟六無水乙醇浸潤步驟七二甲苯 潤濕2次步驟八中性樹膠封片5) PTM骨切片染色、封片5μπι的薄片常以Masson-Goldner Trichrome染色，染色后，骨質(zhì)為綠色，骨髓為 紅色，可以用來觀察骨小梁數(shù)量和其表面的成骨細胞和破骨細胞。9μπι的薄片封片后觀測 焚光。Masson-Goldner Trichrome染色過程如下所示(1)工作液的準備A. Weigert hematoxylin工作液配置標識為95 %乙醇的IOOOml溶液中含 Hematoxylin (蘇木素精)Ig的溶液a (已過濾)；配置標識為含29% Ferric chloride (氯化 鐵)4ml、稀鹽酸Iml (用40%的稀鹽酸加蒸餾水按照1 4稀釋)，然后加蒸餾水至IOOOml 的溶液b。等比例混合a液和b液，即得。B. Poncean Fuchsin工作液配置溶液c 標識為IOOml蒸餾水中含Poncean (麗春 紅)Ig的溶液；溶液d 標識為IOOml蒸餾水中含Acid Fuchsin (品紅)Ig的溶液，將溶液 c和d按照3 1混合成Poncean Fuchsin原液，將此液與0. 2%的冰乙酸按照1 5稀釋 成 Poncean Fuchsin 工作液。C. Phosphotungstic acid-Oranage G 工作液^！奪 4gPhosphotungstic acid ( 酸)和2g Oranage G(四號橙)加入IOOml蒸餾水中，過濾，即得。D. Light green 工作液將 0. 2g Light green(亮綠)和 0. 2ml 的冰乙酸加入 IOOml蒸餾水中，過濾，即得。(2)染色、封片等過程步驟一 5μπι和9μπι骨切片(已烘干，并去除上覆的塑料膜)步驟二2_Methyloxethyl acetate (脫塑劑)25min 2 次步驟三5 μ m骨切片繼續(xù)下述步驟9 μ m骨切片暫停下述步驟步驟四40%乙醇 5min步驟五70%乙醇 5min:ffeigert hematoxylin25min步驟七蒸餾水漂洗步驟八Poncean Fuchsin 工作液 17min步驟九的冰乙酸漂洗2次，每次Imin^ΜΛ- 羊iliit白勺 Phosphotungstic acid-Oranage G7min步驟^^一 的冰乙酸漂洗2次，每次Imin步驟十二 新鮮過濾的Light green工作液 15min_20min步驟十三1 %的冰乙酸漂洗2次，每次Imin步驟十四5μπι、9μπι切片繼續(xù)下述步驟
步驟十五95%乙醇 Imin步驟十六無水乙醇2min 2次步驟十七二甲苯 2min 2次步驟十八中性樹膠封片。3. 3. 3骨組織形態(tài)計量學(xué)測定3. 3. 3.1 測量范圍1)ΤΧ的測量范圍為其橫斷面的骨髓腔及皮質(zhì)骨，見圖2。2) PTM的測量范圍為從生長板往下畫出1mm，以避開初級骨生長區(qū)，再從Imm往下 畫3_。見圖3。3. 3. 3. 2骨形態(tài)計量學(xué)測量及計算參數(shù)本實驗所有參數(shù)采用國際通用標準骨組織形態(tài)計量學(xué)術(shù)語命名，用圖像分析系統(tǒng) 直接測出。測量參數(shù)的中英文名稱、符號及單位如表3.1和表3. 3所示。但這些參數(shù)還不 能用于分析骨量、骨結(jié)構(gòu)、骨形成和骨吸收等，要通過國際通用的公式對直接測得的參數(shù)進 行計算，才能用于分析，計算參數(shù)的中文名稱、符號及計算公式等如表3. 2和表3. 4所示。表3.1皮質(zhì)骨測量參數(shù)
表3. 2皮質(zhì)骨計算參數(shù)及計算公式 表3. 3松質(zhì)骨測量參數(shù) 表3. 4松質(zhì)骨計算參數(shù) 3. 3. 3. 3計算參數(shù)的意義1) TX靜態(tài)參數(shù)(1)皮質(zhì)面積百分數(shù)(％ Ct. Ar):反映皮質(zhì)骨在TX骨橫截面總骨組織面積中所占 的比例。(2)骨髓腔面積百分數(shù)(％ Ma. Ar):反映骨髓腔在TX骨橫截面總骨組織面積中所 占的比例。2) TX動態(tài)參數(shù)(內(nèi)膜面和外膜面)(1)熒光周長百分數(shù)(％ P-L. Pm ； % E-L. Pm):反映皮質(zhì)骨內(nèi)外膜面熒光周長占骨 表面總周長的百分率，反映成骨細胞的數(shù)量。(2)骨礦化沉積率(Ε-MAR ；P-MAR)指皮質(zhì)骨內(nèi)外膜礦化的速率。反映骨礦化的快 慢，代表成骨細胞的活性。(3)骨形成率(E-BFR/BS ；P-BFR/BS)代表皮質(zhì)骨內(nèi)外膜骨表面形成的活躍程度。(4)骨吸收周長百分數(shù)(E-% Er. Pm):皮質(zhì)內(nèi)骨表面沒有類骨質(zhì)和熒光部分的吸 收陷窩的周長，反映骨內(nèi)膜破骨細胞的骨吸收功能。3) PTM靜態(tài)參數(shù)骨量(1)骨小梁面積百分數(shù)(％ Tb. Ar, % )指骨小梁面積占骨組織面積的百分率，反 映骨量的多少。該指標是評價骨量變化的最重要的客觀指標。骨結(jié)構(gòu)(2)骨小梁寬度(Tb. Th)用于描述骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)，解釋骨量的變化。在數(shù)量一 定的情況下，寬度越厚，骨量越多。(3)骨小梁數(shù)量(Tb. N)用于描述骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)，解釋骨量的變化。在寬度一定 的情況下，數(shù)量越多，骨量越多。(4)骨小梁分離度(Tb. Sp)指骨小梁之間的平均距離，用來描述骨小梁的形態(tài)結(jié) 構(gòu)。分離度越大，骨小梁之間的距離就越大，骨就越疏松。4) PTM動態(tài)參數(shù)(1)熒光周長百分數(shù)(％ L. Pm)反映骨小梁表面熒光周長占骨表面總周長的百分 率，也反映成骨細胞的數(shù)量。(2)骨礦化沉積率(MAR)指每天礦化的寬度。反映骨礦化的快慢，代表成骨細胞的活性。(3)骨形成率(BFR/BS)每年新形成的骨小梁面積占骨小梁總周長的百分比，代 表骨表面骨形成的活躍程度。(4)骨形成率(BFR/BV):每年新形成的骨小梁面積占骨小梁總面積的百分比，代 表骨形成和骨轉(zhuǎn)換的活躍程度。此參數(shù)越高，表示骨轉(zhuǎn)換也越高，是反映骨轉(zhuǎn)換的一個重要 指標。(5)骨形成率(BFR/TV):每年新形成的骨小梁面積占骨組織面積的百分比，代表 每年骨小梁表面新形成骨的總量。此參數(shù)與BFR/BV和BFR/BS不同，它受兩個因素影響，一 是骨量的多少，骨量越多就提供越多的新骨形成所需的骨小梁表面；二是骨形成活躍程度， 骨形成越活躍，在單位長度上形成的新骨就越多。所以有時雖然骨形成很活躍，但由于骨量 太少，此參數(shù)也會下降。(6)成骨細胞數(shù)(Ob. N):單位骨小梁周長上的成骨細胞數(shù)，反映與成骨細胞有關(guān) 的骨形成情況。(7)單位骨小梁周長破骨細胞數(shù)(Oc.N)單位骨小梁周長上的破骨細胞數(shù)，反映 與破骨細胞有關(guān)的骨吸收情況。3. 4骨生物力學(xué)研究方法骨生物力學(xué)研究的是骨組織在外力作用下的力學(xué)特性及受力后的生物學(xué)效應(yīng)，是 骨量、骨結(jié)構(gòu)及骨質(zhì)量的綜合反映。對骨進行生物力學(xué)實驗研究，不但有助于對骨質(zhì)量進行 直接評價，而且也是評價各種對抗骨丟失措施的最佳方法之一。由于很多情況下骨折與彎 曲載荷有關(guān)，因此有必要掌握骨在彎曲載荷下的力學(xué)性質(zhì)。彎曲試驗常用來測量骨干皮質(zhì) 骨的力學(xué)性能，最常見的彎曲試驗?zāi)Ｊ绞侨c彎曲?！睹绹称放c藥品管理委員會-骨質(zhì)疏 松研究指南》建議應(yīng)用標準嚙齒類動物-大鼠的股骨做為力學(xué)測試研究對象，從而對股骨的 測試在防治骨質(zhì)疏松實驗中比其它部位更有臨床意義。壓縮試驗是一種常用的測量松質(zhì)骨骨力學(xué)性能的技術(shù)。其優(yōu)點是骨樣本受力方向 與生理狀態(tài)相近，而且使用時簡單方便，常用于松質(zhì)骨力學(xué)性能的測試。因此，本實驗選用 椎骨壓縮試驗的方法來評價松質(zhì)骨的生物力學(xué)性能。3. 4.1實驗方法3. 4. 1. 1股骨皮質(zhì)骨生物力學(xué)測定取大鼠LF置于Z005型萬能試驗機(Zwick/Roell，Germany)行三點彎曲試驗。加 載點位于股骨中段測量處，兩施力點間距為20cm，加載速度為2mm/min，記錄并得出最大 荷載(N)，最大應(yīng)力(MPa)和最大應(yīng)變(% )03. 4. 1. 2椎骨松質(zhì)骨骨生物力學(xué)測定取上述LV5，生理鹽水包裹，0°C以下保存，使用上述萬能試驗機進行椎骨試件壓縮 實驗，加載速度為Imm ·8-1，記錄并得出下述實驗數(shù)據(jù)最大荷載(N)，最大應(yīng)力(MPa)和最 大應(yīng)變(％ )。椎骨和股骨的受力情況見圖4和圖5。3.4. 2參數(shù)意義最大荷載(Max load, N)骨斷裂前所承受的最大外力，最大載荷代表在載荷-變 形曲線最高點處骨標本所承受的外力，反映股骨抗壓縮的能力；代表了骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)特性，
16也受骨的幾何形狀的影響。最大應(yīng)力(Max stress, MPa)骨標本單位面積上所承受的最 大載荷值，表明骨材料在壓縮力作用下發(fā)生破壞時出現(xiàn)的最大抗壓強度；最大變形(Max deflection, %)在載荷作用下，骨標本的變形與標距之比，標識骨的塑性能力。3. 5統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差(^ ±s)來表示，采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件處理，多個樣 本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way AN0VA)，方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊采用 Dunnett' s T3檢驗。以P < 0. 05，P < 0. 01表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。4 結(jié)果4. IDex及HG對大鼠體重和軟組織的影響4. 1. 1對大鼠體重的影響如圖6所示Ctrl組大鼠的平均體重增長迅速，每w平均增長12. 31g ；而相應(yīng)的 Mod組的體重卻增長緩慢，每w平均增長4. 94g。由表4. 1. 1可知Mod組的平均體重從服用 Dex第2w開始，就小于Ctrl組大鼠的平均體重(P < 0. 01)，持續(xù)到實驗結(jié)束時(P < 0. 01)。HG_L、M、H和GSB組的平均體重與Mod組的平均體重相比無差別。均低于Ctrl組 (P < 0. 01)。表4. 1. 1 Dex及HG對大鼠平均體重的影響(η = 10) 4. 1. 2 Dex及HG對大鼠不同軟組織重量的影響由表4. 1. 2和圖7可知與Ctrl組相比，Mod組大鼠肝臟、腎臟、脾臟的重量顯著 降低(前兩者P < 0. 01 ；后者P < 0. 05)，而肺臟的重量無差別。與Mod組相比HG_L、HG-M組大鼠的腎臟的重量顯著升高(P < 0. 05)，HG-M組大 鼠腎臟的重量與GSB組大鼠腎臟的重量相比，顯著增加(P < 0. 05)。表4. 1. 2 Dex及HG對大鼠軟組織的影響(η = 10) 4. 2 Dex及HG對大鼠TX和PTM形態(tài)計量學(xué)的影響
4. 2. 1 Dex及HG對大鼠TX形態(tài)計量學(xué)的影響4. 2. 1. 1 Dex及HG對靜態(tài)參數(shù)的影響由表4.2. 1和圖8可知與Ctrl組比Dex明顯減少了 TX的骨量(％Ct.Ar)，增大 了骨髓腔的面積(％Ma. Ar)，兩組之間這兩個指標的差異均達到了顯著性水平(P<0.01)， 與Mod組相比，HG-L組和HG-M組大鼠的皮質(zhì)骨％ Ct. Ar的升高和％ Ma. Ar的降低均達到 了顯著性水平(P < 0. 01)，這與GSB組的結(jié)果一致。表4. 2. 1 Dex及HG對大鼠TX形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的影響(η = 10) *Ρ < 0. 05 VS Ctrl ；**P < 0. 01 VS ctrl ;#P < 0. 05 VS Mod ；ttttP < 0. 01 VS Mod如表4. 2. 2和圖9所示Dex造成了大鼠骨內(nèi)膜的骨形成指標％ E-L. Pm、E-BFR/ BS顯著降低(前者P < 0.01，后者P < 0. 05)和骨吸收指標％ E-Er. Pm的顯著增加(P < 0.01)，兩組之間骨外膜的各項指標沒有顯著性差異。與Mod組相比，HG-L、M和H增加了骨內(nèi)膜的％ E-L. Pm (分別為35. 11 %、56. 37 %， 73. 71%,52. 15% )，而且高于GSB組和Ctrl組，低中濃度的HG存在劑量依賴關(guān)系；HG-L、 M 還增加了 E-BFR/BS(155. 36% ) (P < 0. 05)，且高于 GSB 組和 Ctrl 組；HG-M、H 組的 E-% Er. Pm顯著減小(P < 0. 01)，而且低于HG-L組(前者P < 0. 05，后者P < 0. 01)，這與GSB
組的結(jié)果一致。表4. 2. 2 Dex及HG對大鼠TX形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的影響(η = 10) *P < 0. 05 VS Ctrl ；**P < 0. 01 VS Ctrl ;#P < 0. 05 VS Mod ；抑P < 0. 01 VS Mod ；aP < 0. 05 VS GSB >AP < 0. 01 VS GSB ；·Ρ < 0. 05 VS HG-L ；eeP < 0. 01 VS HG-L ；< 0. 05 VS HG-M4. 2. 2 Dex及HG對PTM形態(tài)計量學(xué)的影響4. 2. 2. 1 Dex及HG對PTM形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的影響由表4. 2. 3和圖10可知與Ctrl組相比，Mod組大鼠的PTM形態(tài)計量學(xué)靜態(tài)參數(shù)
無變化。與Mod組相比，HG-M組骨小梁的骨量(％ Tb. Ar)顯著增加(ρ < 0. 05)，并且高于 Ctrl組和GSB組(ρ < 0. 05) ；HG-H組骨小梁的寬度(Tb. Wi)顯著寬于GSB組(ρ < 0. 05)。表4. 2. 3 HG對Dex模型大鼠PTM靜態(tài)參數(shù)的影響
20
*P < 0. 05 VS Ctrl ;#P < 0. 05 VS Mod >P < 0. 05 VS GSB4. 2. 2. 2 Dex及HG對PTM形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的影響如表4. 2. 4和圖11所示與Ctrl組相比，Mod組PTM的動態(tài)參數(shù)不變。與Mod相比，HG-M組的MAR顯著增加(P < 0. 01)，并且高于HG-L組和GSB組(P < 0. 05) ；HG-M組的骨吸收指標Oc. N顯著降低(P < 0. 05)，且低于Ctrl組和HG-L組(與 Ctrl 組相比 P < 0. 01 ；與 HG-L 組相比 P < 0. 05)。表4. 2. 4 Dex及HG對大鼠PTM形態(tài)計量學(xué)動態(tài)參數(shù)的影響(η = 10) *Ρ < 0. 05 VS Ctrl ；**P < 0. 01 VS Ctrl ;#P < 0. 05 VS Mod ；抑P < 0. 01 VS Mod ；aP < 0. 05 VS GSB ;·Ρ < 0. 05 VS HG-L ；*P < 0. 05 VS HG-M4. 3 Dex及HG對大鼠LF和LV生物力學(xué)性能的影響4. 3. 1 Dex及HG對大鼠LF生物力學(xué)性能的影響如表4. 2. 5所示與Ctrl組相比，Mod組LF皮質(zhì)骨的生物力學(xué)參數(shù)無變化。其它各藥物組LF的生物力學(xué)參數(shù)無差別。表4. 2. 5 Dex及HG大鼠LF生物力學(xué)性能的影響(η = 10)
4. 3. 2 Dex及HG對大鼠LV生物力學(xué)性能的影響由表4. 2. 6和圖12可知Mod組LV的生物力學(xué)參數(shù)與Ctrl組相比無變化。與Mod組相比，HG-M組LV松質(zhì)骨的最大載荷(Max load)最大應(yīng)力(Max stress)、 最大變形(Max deflection)均顯著升高(P < 0. 05)。HG-H組的最大變形Max deflection 與HG-M相比，顯著降低(P <0.05)。表4. 2. 6 Dex及HG大鼠LV生物力學(xué)性能的影響(η = 10) flP < 0. 05 VS Mod ；*P < 0. 05 VS HG-M
權(quán)利要求
護骨膠囊在預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的新用途，其特征在于將中藥組方為，何首烏、淫羊藿、熟地、龜甲、巴戟天、杜仲、續(xù)斷、骨碎補、當(dāng)歸、山藥的護骨膠囊，用于預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的開發(fā)研究。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的護骨膠囊在預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的新用途，其特征在于所 述的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松為糖皮質(zhì)激素引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松病癥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的護骨膠囊在預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的新用途，其特征在于通 過動物實驗得出護骨膠囊增加了地塞米松Dex造模大鼠皮質(zhì)骨的骨量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的護骨膠囊在預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的新用途，其特征在于通 過動物實驗得出護骨膠囊增加了地塞米松Dex造模大鼠松質(zhì)骨的骨量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的護骨膠囊在預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的新用途，其特征在于通 過動物實驗得出護骨膠囊HG增加了 Dex地塞米松造模大鼠皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的骨量的機理 與促進骨形成和抑制骨吸收有關(guān)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的護骨膠囊在預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的新用途，其特征在于通 過動物實驗得出陽性藥物組GSB降低骨吸收，而未提高骨形成，護骨膠囊HG預(yù)防骨質(zhì)疏松 GIO的效果好于陽性藥物組GSB。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的護骨膠囊在預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的新用途，其特征在于通 過動物實驗得出護骨膠囊HG-M組LV松質(zhì)骨的最大載荷、最大應(yīng)力、最大變形較模型組有 顯著升高(P < 0. 05)。
全文摘要
本發(fā)明屬于中醫(yī)藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體是指中藥護骨膠囊在預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的新用途。本發(fā)明通過骨組織形態(tài)計量學(xué)探討護骨膠囊(HG)對由糖皮質(zhì)激素(GCs)誘導(dǎo)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松(GIO)的預(yù)防作用，實驗結(jié)果證實，GCs短期即可誘導(dǎo)大鼠皮質(zhì)骨的骨丟失，HG45天的干預(yù)，可阻止GCs誘導(dǎo)大鼠皮質(zhì)骨的骨丟失，為開發(fā)中藥護骨膠囊(HG)預(yù)防繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的新用途提供實驗依據(jù)。
文檔編號A61K36/8945GK101890127SQ20101023044
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者曾昭利 申請人:東莞萬成制藥有限公司