專利名稱：：甲氨喋呤和abc抑制劑在制備治療銀屑病藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及治療銀屑病藥物的藥用途徑具體的，本發(fā)明涉及聯(lián)合應用甲氨喋呤、ABC抑制劑用于治療銀屑病的外用用途。
背景技術：
：銀屑病是一種多基因遺傳背景下的免疫異常疾病，因其具有發(fā)病率較高和主要累及青壯年等特點而在皮膚科臨床和科研領域倍受重視。角質形成細胞(KC)過度增生、炎癥細胞浸潤、新生血管形成為其組織病理三要素，盡管三者之間存在非常復雜的相互作用和因果關系，但一般認為，真皮內聚集并活化的T淋巴細胞是銀屑病皮損發(fā)生的始動因素，活化的τ細胞可產(chǎn)生TNF-α和IL-2等細胞/趨化因子，從而導致表皮角質形成細胞增殖和分化狀態(tài)的異常并誘導中性粒細胞向表皮內趨化和聚集。另外，銀屑病皮損處的真皮乳頭層微血管擴張迂曲，通透性增高，血管數(shù)量增多。血管的分布和形成的改變被認為是銀屑病中最先發(fā)生的病理改變，血管內皮生長因子(VEGF)及血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)等通過刺激內皮細胞上的受體或其他方式，使內皮細胞增生、血管通透性增加。在銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中，血管生成相關因子與炎癥介質，KC，炎癥細胞等相互作用，最終導致了銀屑病主要病理改變。目前銀屑病的藥物治療手段較多，藥物包括維A酸類藥物，蒽林，糖皮質激素以及新型免疫抑制劑等，但由于以上藥物治療手段各自不同的副作用和作用靶環(huán)節(jié)的相對單一性，其治療效果及運用前景尚不能完全令人滿意。甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一種抗代謝藥物，常用于腫瘤的治療，可明顯的抑制細胞增殖。1971年美國FDA批準甲氨蝶呤可用于銀屑病，是最早用于治療銀屑病的細胞毒藥物(SteiglederGK.Ambulanttreatmentofpsoriasiswithmethotrexate.Hautarzt.1971,22(9):419)。甲氨喋呤對于各型銀屑病均有效，其治療銀屑病的機理尚不清楚，過去認為甲氨喋呤通過對二氫葉酸還原酶的抑制而達到阻礙細胞DNA的合成，使銀屑病過度增殖的表皮細胞受到抑制(WeinsteinGD,GoldfadenG,FrostPMethotrexate.MechanismofactiononDNAsynthesisinpsoriasis.ArchDermatol.1971,104(3)236-43)。但近幾年研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者體內異常增殖活化的淋巴細胞是甲氨喋呤治療銀屑病的主要靶細胞。在每周低劑量甲氨喋呤治療銀屑病的體外試驗中發(fā)現(xiàn)，甲氨喋呤明顯抑制增殖的淋巴樣細胞，特別是激活的T淋巴細胞。甲氨喋呤藥物濃度在1X10_75X10_7mmol/L時與淋巴樣細胞接觸24小時后，淋巴樣細胞被殺傷達95%以上。但即使甲氨喋呤濃度在10_5mmol/L時，正常人KC被殺傷低于10%，其對甲氨喋呤毒性作用的耐受性比淋巴樣細胞高1000倍，因此認為在體內增殖的被激活的淋巴樣細胞是甲氨喋呤治療銀屑病的主要靶細胞(Eff3rd,McCulloughJL,PittelkowMR,McCormickA,AlmanzorJ,LiuG,DangΜ,VossK,VossJ,SchlotzhauerA,etal.Methotrexatetherapyofpsoriasisdifferentialsensitivityofproliferatinglymphoidandepithelialcellstothecytotoxicandgrowth-inhibitoryeffectsofmethotrexate.Jeffes.JInvestDermatol.1995，104(2):183-8)。研究發(fā)現(xiàn)甲氨喋呤可以抑制T細胞分泌TNF-α和IL-2等多種細胞/趨化因子而達到治療作用。近年來，YamasakiE等發(fā)現(xiàn)小劑量的甲氨喋呤可有效抑制血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)的表達從而抑制血管新生(JohnstonA,GudjonssonJE,SigmundsdottirH.LudvikssonBR.ValdimarssonH.Theanti-inflammatoryactionofmethotrexateisnotmediatedbylymphocyteapoptosis,butbythesuppressionofactivationandadhesionmolecules.ClinImmunol.2005,114(2):154-63),掀起MTX在血管內皮細胞的作用和機制的研究熱潮，認為甲氨喋呤抑制銀屑病皮損內血管新生是該藥物起效的又一個重要機制。甲氨喋呤在銀屑病中的療效肯定，系統(tǒng)使用可以在短時間內緩解病情，但是甲氨喋呤的副作用較大，一般認為與該藥物進入體內后在肝腎組織的富集和長期積累相關，因此，甲氨喋呤的系統(tǒng)應用在銀屑病治療中一般不做為首選。探尋增加其在靶細胞如角質形成細胞，T細胞和血管內皮細胞中的濃度的聯(lián)合制劑成為銀屑病治療的新靶向。英國和加拿大相關專利(GB19830016763和CA19870538541)公開了甲氨蝶呤軟膏和外用制劑在治療銀屑病中的應用。日本專利(JP19920214465)公開了甲氨蝶呤衍生物在治療銀屑病中的作用。甲氨喋呤在進入組織細胞后可以被ABC(ATP-bindingcassette)轉運蛋白超家族成員泵出細胞外，這在腫瘤細胞的化療過程中極為常見，甲氨喋呤的細胞外排機制直接導致了月中瘤細胞對其不敏感(BanerjeeD,MayerKuckukP,CapiauxG,Budak-AlpdoganT,GorlickR,BertinoJR.Novelaspectsofresistancetodrugstargetedtodihydrofolatereductaseandthymidilatesynthase.BiochimBiophysActa.2002,1587(2-3)164-173)ABC轉運蛋白超家族是一組跨膜蛋白，目前已知有49個成員，分為7個亞家族ABCA-ABCG，該家族在跨膜區(qū)組成通道，轉運許多結構不同的藥物由通道穿過細胞膜，2個ATP連接區(qū)位于細胞漿內面，水解ATP完成底物轉運。該家族成員在人體絕大多數(shù)組織中都存在低表達，但在皮膚組織和內皮細胞以及某些腫瘤細胞中過度表達。其主要成員ABCB、ABCC(又名多藥耐藥相關蛋白multidrugresistanceprotein,MRP)、ABCG(又名乳腺癌耐藥蛋白:breastcancerresistanceprotein,BCRP)亞家族與腫瘤多藥耐藥相關，參與介導廣譜的化療藥物包括生物堿類，抗癌抗生素，烷化劑，葡萄糖醛酸結合物和一些新型的基因靶點藥物外排。Masuda和他的同事在1997年發(fā)現(xiàn)甲氨喋呤在ABCC2基因敲除鼠的膽汁排泄受阻，提出ABCC2參與介導甲氨喋呤的細胞外轉運過程(MasudaH,I‘izukaΜ,YamazakiY,NishigakiΜ,KatoR,Ni'inumaY,SuzukiK,SugiyamaY.Methotrexateisexcretedintothebilebycanalicularmultispecificorganicaniontransporterinrats.CancerRes.1997,57:3506_351)。后續(xù)試驗證實ABCC1-5—起構成了能量依賴的甲氨喋呤轉出系統(tǒng)，在細胞對甲氨喋呤的耐藥中起重要作用(ZengH，ChenZS,BelinskyMG,ReaPA,KruhGD.Transportofmethotrexate(MTX)andfolatesbymulti-drugresistanceprotein(MRP)3andMRPl:effectofpoly-glutamylationonMTXtransport.CancerRes.2001，61:7225_7232)。Volk等于2000年首次發(fā)現(xiàn)乳腺癌耐米托嗯醌細胞株MCF/MX存在ABCG2的高表達，這種耐藥細胞株同時存在對甲氨喋呤的交叉耐藥，認為ABCG2也參與介導甲氨喋呤的外排(VolkEL，RohdeK，RheeM，McGuireJJ,DoyleLA.RossDD.SchneiderΕ.Methotrexatecross-resistanceinamitoxantrone~selectedmultidrug-resistantMCF7breastcancercelllineisattributabletoenhancedenergy-dependentdrugefflux.CancerRes·2000，60:3514_3521)。陸續(xù)有石if究證實運用ABCG2的抑制劑可有效阻斷HEK293/ABCG2轉染細胞膜泡的甲氨喋呤輸送。從而使人們對甲氨喋呤流出細胞途徑有了新的認識。如何利用ABC轉運泵抑制劑阻斷甲氨喋呤由細胞內外排將有效提高甲氨喋呤的治療效果，有良好的臨床應用前景。有關甲氨蝶呤與其他藥物聯(lián)用治療銀屑病，美國專利(US2000602949)公開了白細胞介素-10(Interleukin10)與甲氨蝶呤聯(lián)用抑制T細胞增殖治療銀屑病。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一類治療銀屑病的外用藥物。進一步地，本發(fā)明的目的是提供一種新的用于治療銀屑病的藥物組合物，聯(lián)合甲氨喋呤及ABC抑制劑的外用藥物。將甲氨蝶呤及ABC抑制劑合用用于治療銀屑病，實驗結果表明聯(lián)合應用ABC抑制劑與甲氨蝶呤與單用甲氨蝶呤相比，可以抑制甲氨蝶呤從胞內排出，增加其胞內濃度，從而增加其療效。其中以MRP5的Zaprinast與ABCG2的Lapatinib與甲氨蝶呤組合最優(yōu)。聯(lián)合甲氨蝶呤及ABC抑制劑皮膚局部試用時，所采用的制劑可以是本領域常規(guī)的外用制劑，包括軟膏、凝膠、貼劑等。藥物可以柔性納米脂質體、固體脂質納米粒、微乳等形式存在于軟膏、凝膠、貼劑基質中。將復方甲氨喋呤、ABC抑制劑軟膏局部試用時，MTX的濃度應當在0.1%-10%(wt/wt)，ABC抑制劑的濃度為0.05%-10%,MTX每次施用量相當于5_15mg，ABC抑制劑的施用量為l-20mg。盡管專利(US200060249、CA19870538541、JP199202214465)公開了甲氨蝶呤及其衍生物與其他藥物(如白細胞介素-10)聯(lián)用的各種外用制劑用于治療銀屑病，未見甲氨蝶呤與ABC抑制劑聯(lián)用用于治療銀屑病的相關報道。本申請發(fā)明人多年致力于研究銀屑病的作用及機制研究，有豐富的銀屑病病理標本和成熟的銀屑病移植鼠模型，對腫瘤耐藥及其逆轉機制也有一定的研究。聯(lián)合應用甲氨蝶呤和ABC抑制劑用于治療銀屑病，抑制甲氨蝶呤的外排，可以最大限度的發(fā)揮甲氨喋呤的治療作用，避免其導致的嚴重不良反應。圖1是各MRP-5抑制劑對MRP-5介導的MTX攝取抑制作用的比較。實施例下面通過具體實施方案進一步說明本發(fā)明。所述實施例僅用于說明或解釋本發(fā)明的實施方案，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1MRP-5抑制劑對MTX外排抑制作用的研究本實驗將MRP-5抑制劑與MTX合用研究MRP-5抑制劑阻斷MRP-5介導的MTX的膜泡輸送。本實驗用到的MRP-5抑制劑有丙磺舒、MK571、曲喹新、西地那非、扎普司特(Zaprinast)、吲哚美辛、Sulfinpyrazone、雙嘧達莫、培美曲塞、5-FdUMP。ABC轉運泵依賴ATP攝取MTX可以通過膜泡輸送實驗進行評價，本實驗需要的膜泡可以從MRP-5轉染的HEK293細胞中得到。膜泡是在低溫條件下利用物理破碎細胞獲得，20μg膜泡與各抑制劑在冰上孵育lh，在含有20mMMgCl2,4mMATP或4mMAMP-PNP，磷酸肌酸和肌酸激酶ATP緩沖液系統(tǒng)中。加入100μM[3H]-MTX在37°C孵育IOmin。加入3ml終止液(0.25M蔗糖，IOOmMNaCl禾口IOmM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，PH7.5)停止反應。洗滌，膜泡內[3H]-MTX用液體閃爍計數(shù)(PackardInstrumentCompany,Inc.)進行測定。測得結果如下。本實驗可以得出以下結論，MRP-5抑制劑與MTX聯(lián)合應用組與單獨給予MTX對照組相比，膜泡攝取[3H]-MTX明顯減少，即MRP-5抑制劑對MRP-5介導的MTX的膜泡輸送有抑制作用。MRP-5抑制劑中磷酸二酯酶5抑制劑(PDE5inhibitor)扎普司特(Zaprinast)的抑制作用最強。實施例2ABCG2抑制劑對MTX外排抑制作用的研究實驗將ABCG2抑制劑與MTX合用研究ABCG2抑制劑阻斷ABCG2介導的MTX的膜泡輸送。ABCG2抑制劑中酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的抑制作用尤為突出，本實驗重點考察酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)中Nilotinib,Lapatinib,Erlotinib,Sunitinib,以FTC為陽性對照。本實驗中[3H]-MTX的膜泡輸送實驗用實施例1方法進行測定。膜泡與各濃度的抑制劑在冰上孵育Ih。加入100μM[3H]-MTX在37°C孵育IOmin。加入3ml終止液(0.25M蔗糖，IOOmMNaCl和IOmM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，PH7.5)停止反應。洗滌，膜泡內[3H]-MTX用液體閃爍計數(shù)(PackardInstrumentCompany,Inc.)進行測定。測得結果如下。酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)阻斷ABCG2介導的MTX的膜泡輸送InhibitorsConcentration%Uptake(μΜ)%ofcontrol[3H]-MTXNoinhibitor100Nilotinib160.6士8.92.536.1士7.1524.9士4.7Lapatinib516.8士4.3Erlotinib536士12Sunitinib554.5士9.4FTC2.521.2士6.7本實驗可以得出以下結論，ABCG2抑制劑與MTX聯(lián)合應用組和單獨給予MTX對照組相比，膜泡的攝取明顯減少，即ABCG2抑制劑對對ABCG2介導的MTX的膜泡輸送有抑制作用。其中拉帕替尼(Lapatinib)抑制作用最強。實施例3弓P氨蝶呤凝膠處方組成成分用量甲氨蝶呤500mg卡泊姆l.Og6三乙醇胺1.5gDMSO2ml蒸餾水加至IOOg制備方法取卡泊姆用水浸泡，使其充分溶脹，加入甘油，滴加三乙醇胺成透明凝膠。MTX用適量DMSO混勻后加至凝膠中，加水至足量，研勻。實施例4復方甲氨蝶呤、拉帕替尼凝膠處方組成成分用量甲氨蝶呤500mg拉帕替尼1.Omg卡泊姆l.Og三乙醇胺1.5gDMSO2ml蒸餾水加至IOOg制備方法取卡泊姆用水浸泡，使其充分溶脹，加入甘油，滴加三乙醇胺成透明凝膠。MTX與拉帕替尼用適量DMSO混勻后加至凝膠中，加水至足量，研勻。實施例5復方甲氨喋呤、ABC抑制劑凝膠治療銀屑病的動物模型實驗取體重2030g的ICR小鼠36只，雌雄各半，隨機分為空白組、MTX組和復方ABC抑制劑與MTX組3組，每組12只。各組每日涂抹小鼠尾部2次(0.2g·只-^cT1)。連續(xù)用藥14d后處死小鼠，取距尾根約1.8cm處的背部表皮，進行常規(guī)組織切片，HE染色。光鏡下觀察，凡兩個毛囊口之間的鱗片表皮有連續(xù)成行的顆粒細胞層者，稱為有顆粒層形成的鱗片。計數(shù)每100個鱗片中有顆粒層的鱗片數(shù)，比較各組數(shù)據(jù)。復方MTX、拉帕替尼凝膠對小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成的影響注與空白組相比，*P<0.01與MTX凝膠組相比，#P<0.05結果顯示，與空白凝膠基質對照組比較，MTX凝膠組與復方MTX、拉帕替尼凝膠組對鼠尾鱗片表皮顆粒層形成有明顯的促進作用，有顆粒層的鱗片數(shù)顯著增多，與空白對照組相比(均為P<0.01)其中以復方MTX、拉帕替尼凝膠組作用最明顯，與MTX凝膠組，兩組間有顯著性差異(P<0.05)。實施例6復方甲氨喋呤、ABC抑制劑凝膠治療銀屑病志愿者的效果病例選擇72例尋常性斑塊狀銀屑病(已做病理確診)志愿者，臨床表現(xiàn)典型。隨機分為3組。MTX凝膠組24例，年齡2258歲，平均35.1士10.2歲，男14例，女10例，病地塞米松組24862833.3358.331044611.6758.33MTX凝膠組241052741.6762.501351554.,1775.,00復方MTX、拉帕替尼凝膠鉬241431658.3370.831651266.,6787.,50注復方MTX、拉帕替尼凝膠組與MTX凝膠組相比P<0.05與地塞米松組相比P<0.05結果顯示，復方MTX、拉帕替尼凝膠組第3周和第6周治愈率與總有效率均比地塞米松組和MTX凝膠組大，且第6周復方MTX、拉帕替尼凝膠組與MTX凝膠組相P<0.05，與地塞米松組相KP<0.05。程5個月15年；復方MTX、拉帕替尼凝膠組24例，年齡1856歲，平均37.2士12.2歲，男11例，女13例，病程5個月至15年；外用激素(地塞米松軟膏)組24例，年齡2054歲，平均36.4士10.1歲，男12例，女12例，病程5個月至15年。三組的年齡、性別、病情、病程差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。三組患者均無其他系統(tǒng)疾患。治療方法MTX凝膠組采用MTX凝膠涂于局部皮損處，一天兩次，復方MTX、拉帕替尼凝膠組與外用激素組用同樣的給藥方法。連續(xù)給藥6周。療效判定標準①臨床痊愈或基本痊愈紅斑、鱗屑等皮損消退90%以上或完全消退；②顯效紅斑、鱗屑等皮損消退>60%；③好轉紅斑、鱗屑等皮損消退>30%；④無效紅斑、鱗屑等皮損消退<30%。采用銀屑病皮損面積-嚴重性指數(shù)(PASI評分)對治療前后的銀屑病患者進行評分，分析其變化。結果3組斑塊狀銀屑病患者治療第3周和第6周的情況權利要求甲氨喋呤和ABC抑制劑在制備治療銀屑病藥物中的用途。2.按照權利要求1的用途，其中所述的藥物是局部外用的藥物。3.按照權利要求1的用途，其中所述ABC抑制劑包括ABCA-G抑制劑，其中優(yōu)選ABCC抑制劑與ABCG2抑制劑。4.按照權利要求3的用途，其中所述的ABCC抑制劑包括MRP1-5抑制劑，其中優(yōu)選MRP5抑制劑。5.按照權利要求4的用途，其中所述的MRP5抑制劑包括但不限于維拉帕米、丙磺舒、MK571和磷酸二酯酶5抑制劑，其中優(yōu)選磷酸二酯酶5抑制劑。6.按照權利要求5的用途，其中磷酸二酯酶5抑制劑包括但不限于他達那非、西地那非、扎普司特、曲喹辛、伐地那非，其中優(yōu)選扎普司特。7.按照權利要求3的用途，其中所述的ABCG2包括但不限于GF120918、FTC、Kol43、泮托拉唑、XR9576、VX-710、槲皮素和小分子酪氨酸酶抑制劑。其中優(yōu)選小分子酪氨酸酶抑制劑(TKI)。8.按照權利要求7的用途，其中所述小分子酪氨酸酶抑制劑包括但不限于伊馬替尼、尼羅替尼、吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、Erlotinib、拉帕替尼、達沙替尼、舒尼替尼和Bosutinib；其中優(yōu)選拉帕替尼。9.按照權利要求1-9之一的用途，其中所述的制劑中MTX的濃度應當在0.1%-10%(wt/wt)，ABC抑制劑的濃度為0.05%-10%。10.按照權利要求1-9之一的用途，MTX每次施用量相當于5-15mg，ABC抑制劑的施用量為l-20mg。全文摘要本發(fā)明涉及聯(lián)合甲氨喋呤、ABC抑制劑在治療銀屑病中的應用。更具體的，在治療銀屑病時，聯(lián)合甲氨喋呤、ABC抑制劑以局部外用的形式施用。文檔編號A61K45/00GK101926996SQ20101025322公開日2010年12月29日申請日期2010年8月13日優(yōu)先權日2010年8月13日發(fā)明者丁勁松,匡葉紅,陳翔申請人:中南大學