專利名稱：女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物及其制備藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物及其制備藥物用途。
背景技術(shù)：
目前流行性感冒病毒日益嚴重，并且流行性感冒病毒與呼吸道疾病及引起的全身 性疾病密切相關(guān)，我國是流感高發(fā)國家之一，不但人口眾多，而且生活習慣也有利于流感病 毒的轉(zhuǎn)播，每年人平均發(fā)病次數(shù)達到0. 3 0. 7次不等，重點人群達到2 4次。流感對人 類存在嚴重威脅，尤其是新發(fā)品種流感病毒，其不但引起繼發(fā)性其它微生物感染，而且會直 接導(dǎo)致器官破壞和變態(tài)反應(yīng)致人死亡。但目前并沒有有效的治療流行性感冒病毒及其疾病 (流感)的方法和治療手段，如針對臨床癥狀進行炎癥反應(yīng)治療，治標不治本。目前最常見 的預(yù)防和治療流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接種，非特異性抗病毒中藥或西 藥磷酸奧司他韋(達菲)_神經(jīng)氨酸酶抑制劑。然而流感病毒疫苗預(yù)防接種弊端在于接種 人群有選擇性，不是人人可以接種。此外，流感病毒疫苗保護率不高，保護時間也較短(3 6個月)。目前大多數(shù)非特異性抗病毒中藥雖然宣稱有抗病毒作用，但是并非針對流感病 毒，且抗病毒作用機理不清楚。在我們以往研究的許多種治療外感風寒，西醫(yī)所認為的感冒 的中藥組方并沒有直接抗流感病毒的作用。簡單的說，不是所有的治療感冒的中藥組方都 有明確的抑制流感病毒的作用。西藥“磷酸奧司他韋(達菲，(3R，4R，5S)-4-乙酰胺-5-氨 基_3 (1-丙氧乙酯)-1-環(huán)己烯-1羧酸乙酯磷酸鹽)”是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，對流感病毒進 入細胞有特異性抑制作用，但是不僅價格昂貴，而且有一些患者服用后出現(xiàn)嘔吐、惡心、失 眠、頭痛、腹痛、腹瀉、頭暈、疲勞、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反應(yīng)。達菲是在體內(nèi)被位于肝臟和 腸道的酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物而起著抑制神經(jīng)氨酸酶作用，如果患者肝臟和腸道器官功 能不正常也將影響其藥效。此外，腎功能不全患者也要慎用。傳統(tǒng)的中醫(yī)學認山香圓葉具有清熱解毒，利咽消腫，活血止痛。用于乳蛾喉痹，咽 喉腫痛，瘡瘍腫毒，跌撲傷痛。女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷是山香圓葉的主要成分之一。女 貞子功能為滋補肝腎，明目烏發(fā)。主要用于眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發(fā)早白，目暗不明，近年 來多用于治療慢性氣管炎、肝炎、高血脂癥、糖尿病、更年期綜合征、不孕癥、動脈粥樣硬化 等，女貞苷是女貞子的主要成分之一?；偌t具有散寒，燥濕，利氣，消痰。用于風寒咳嗽， 喉癢痰多，食積傷酒，嘔惡痞悶；野漆樹苷是化橘紅的主要成分之一。貫葉金絲桃具有舒肝 解郁，清熱利濕，消腫止痛。用于情志不暢，氣滯郁悶，關(guān)節(jié)腫痛，小便不利。金絲桃苷是貫 葉金絲桃的主要成分之一，金絲桃苷對心肌缺血再灌注，腦缺血再灌注，腦梗塞都顯示良好 的保護作用，還具有鎮(zhèn)痛，抗氧化，保護心肌、肝臟作用。但并未發(fā)現(xiàn)山香圓葉及其所含的女 貞苷、野漆樹苷和金絲桃苷、女貞子及其所含的女貞苷、化橘紅及其所含的野漆樹苷、貫葉 金絲桃及其所含的金絲桃苷具有抑制流感病毒感染、復(fù)制的作用，也未發(fā)現(xiàn)其具有抑制神 經(jīng)氨酸酶的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，其可以抑制流感病毒神 經(jīng)氨酸酶水解細胞表面唾液酸，導(dǎo)致流感病毒不能與細胞表面受體結(jié)合而進入細胞內(nèi)，以 及減少流感病毒在細胞內(nèi)的產(chǎn)生，從而有效地針對性地抑制流感病毒復(fù)制，更重要地是本 發(fā)明提供一種女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物可以克服現(xiàn)有藥物的副反應(yīng)弊端。本發(fā)明提供的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，所述女貞苷的分子式 C33H4tlO18,分子量724. 2，所述女貞苷的結(jié)構(gòu)式如下 所述野漆樹苷的分子式=C27H3tlO14,分子量578. 52，所述野漆樹苷的結(jié)構(gòu)式如下所述金絲桃苷的分子式=C21H2tlO12,分子量464. 38，所述金絲桃苷的結(jié)構(gòu)式如下 其中所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷 80 % 40 %、野漆樹苷5 % 45 %、金絲桃苷1 % 40 %。優(yōu)選的，其中所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷75% 45%、野漆樹苷10% 40%、金絲桃苷5% 35%。優(yōu)選的，其中所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成 的女貞苷70% 50%、野漆樹苷15% 35%、金絲桃苷10% 30%。優(yōu)選的，其中所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成 的女貞苷65% 55%、野漆樹苷20% 30%、金絲桃苷15% 25%。優(yōu)選的，其中所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成 的女貞苷58 %、野漆樹苷25 %、金絲桃苷17 %。另一方面，本發(fā)明還提供了女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物的提取方法，其中 所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷是從山香圓葉中提取獲得的，所述提取方法如下取山 香圓葉，加5 15倍量的30% 90%乙醇回流提取1 3次，每次回流提取1 3小時，濾 過；合并濾液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱洗脫，收集洗脫部分，減壓濃縮，干燥，得女 貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)分離，分別合并女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷流份， 結(jié)晶，得到女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷純品。優(yōu)選的，其中所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山 香圓葉，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，濾渣再加10倍量70%乙醇回流提取 1. 5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱洗脫，收集洗脫部分，減 壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中水溶液通過已處理好的DlOl大孔樹脂柱，分別用水、5% 10%乙醇、 30% 55%乙醇、氫氧化鈉溶液洗脫，收集30% 55%乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中混合總苷經(jīng)硅膠柱層析、S^hadex LH-20柱層析分離，分別合并女貞 苷、野漆樹苷、金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到女貞苷、野漆樹苷和金絲桃苷的純品。本發(fā)明還提供了女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物用于制備預(yù)防和治療流感及 其并發(fā)癥疾病的藥物的用途。 優(yōu)選的，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物用于抑制流感病毒。優(yōu)選的，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物用于抑制流感病毒FM1。優(yōu)選的，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物用于抑制神經(jīng)氨酸酶。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指腎功能衰竭。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指脾損傷或/和肺損傷。本發(fā)明所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷可以是從含女貞苷、野漆樹苷、金絲桃 苷的各種藥材中如山香圓葉、女貞子、化橘紅、貫葉金絲桃葉中提取獲得女貞苷、野漆樹苷、 金絲桃苷粗品或女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷單體化合物。最后，本發(fā)明還提供了一種女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物制劑，該制劑以本 發(fā)明上述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物為主要活性成分。實驗數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物是有效的抑制神經(jīng)氨 酸酶成分，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物隨著使用劑量大小變化，其抑制神經(jīng)氨酸酶 活性的能力，即神經(jīng)氨酸酶抑制率的高低也相應(yīng)發(fā)生變化，并且成正相關(guān)，女貞苷、野漆樹 苷、金絲桃苷組合物能夠通過抑制流感病毒表面神經(jīng)氨酸酶，進而抑制流感病毒進入細胞 里面、抑制已經(jīng)進入細胞里面的流感病毒復(fù)制、增殖，從而減少了流感病毒對細胞的感染、 生長，以及預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥，還可以抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶水解細胞表面唾液酸，導(dǎo)致流感病毒不能與細胞表面受體結(jié)合而進入細胞內(nèi)，以及減少流感病毒在細胞內(nèi) 的產(chǎn)生，更重要地是本發(fā)明提供一種女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物可以克服現(xiàn)有藥物 的副反應(yīng)弊端。而醫(yī)學和藥學研究人員無法預(yù)先在不做抑制流感病毒感染、復(fù)制，或抑制神經(jīng)氨 酸酶的實驗的前提下，預(yù)先得知女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物具有預(yù)防和治療流感病 毒性感冒的良好效果。綜上所述，本發(fā)明提供的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物及其用途帶來顯著的 技術(shù)效果。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明提供的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，所述女貞苷的分子式 C33H4tlO18,分子量724. 2，所述女貞苷的結(jié)構(gòu)式如下 所述野漆樹苷的分子式=C27H3tlO14,分子量578. 52，所述野漆樹苷的結(jié)構(gòu)式如下 所述金絲桃苷的分子式=C21H2tlO12,分子量464. 38，所述金絲桃苷的結(jié)構(gòu)式如下 取山香園葉IOOOgJn 12倍量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，濾渣再加10倍 量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的 DlOl大孔樹脂柱，分別用水、10 %乙醇、45%乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集45%乙醇洗 脫部分，減壓濃縮，干燥，得30%以上女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層 析、Sephadex LH-20柱層析分離，分別合并女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到女 貞苷(3. 5g，純度98. 5%)、野漆樹苷(1.58，純度98.7%)、金絲桃苷(lg，純度98. 2%) 純品，經(jīng)分別與女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷標準品的UV、IR、ESI-MSUH-NMRU3C-NMR比 較，確定了上述三個化合物的結(jié)構(gòu)。另外，本發(fā)明提供的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷也可以分別提取獲得，如以下舉 的實施例。實施例2取女貞子lOOOg，加10倍量65%乙醇回流提取2小時，濾過，濾渣再加8倍量65% 乙醇回流提取1. 5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的DlOl大 孔樹脂柱，分別用水、8 %乙醇、40 %乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集40 %乙醇洗脫部分， 減壓濃縮，干燥，得30%以上女貞苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析分 離，合并女貞苷流份，結(jié)晶，得到女貞苷(19. 2g，純度98.6% )純品，經(jīng)分別與女貞苷標準 品的uv、IR、ESI-MSJH-WRJ3C-WR比較，確定了女貞苷的結(jié)構(gòu)。實施例3取化橘紅lOOOg，加10倍量65%乙醇回流提取2小時，濾過，濾渣再加8倍量65% 乙醇回流提取1. 5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的DlOl大 孔樹脂柱，分別用水、10%乙醇、45%乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集45%乙醇洗脫部分， 減壓濃縮，干燥，得30%以上野漆樹苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析 分離，合并野漆樹苷流份，結(jié)晶，得到野漆樹苷(4. 6g，純度98. 5% )純品，經(jīng)分別與野漆樹 苷標準品的UV、IR, ESI-MS^iH-NMR, 13C-NMR比較，確定了野漆樹苷的結(jié)構(gòu)。實施例4取貫葉金絲桃lOOOg，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，濾渣再加10倍 量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的 D101大孔樹脂柱，分別用水、10 %乙醇、45 %乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集45 %乙醇洗 脫部分，減壓濃縮，干燥，得30%以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、S^hadex LH-20 柱層析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(8. 5g，純度98. 6% )純品，經(jīng)分別與 金絲桃苷標準品的UV、IR, ESI-MS^iH-NMR, 13C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。
實施例5將女貞苷(14g)、野漆樹苷(6g)與金絲桃苷(3.6g)以7 3 1.8的比例混合， 攪拌、研磨、混合均勻后得女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物(23. 6g)。實施例6將女貞苷(12g)、野漆樹苷(8g)與金絲桃苷(4g)以3 2 研磨、混合均勻后得女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物(24g)。實施例7將女貞苷(IOg)、野漆樹苷(IOg)與金絲桃苷(6g)以5 拌、研磨、混合均勻后得女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物(26g)。實施例8將女貞苷(8g)、野漆樹苷(12g)與金絲桃苷(8g)以2 3 研磨、混合均勻后得女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物(28g)。實施例9將女貞苷(6g)、野漆樹苷(14g)與金絲桃苷(IOg)以3 拌、研磨、混合均勻后得女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物(30g)。下面結(jié)合表1給出本發(fā)明女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷質(zhì)量百分比的一些優(yōu)選實 施例，但本發(fā)明三者的組成成份的含量不局限于該表中所列數(shù)值，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員 來說，完全可以在表中所列數(shù)值范圍的基礎(chǔ)上進行合理概括和推理。 實驗數(shù)據(jù)1 女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用取實施例5制備方法所獲得的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，加適量水使溶 解，應(yīng)用神經(jīng)氨酸酶抑制劑鑒定試劑盒測定女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物抑制神經(jīng)氨 酸酶(Ni)的效價見表2。(1).標準曲線準備a.在96孔熒光酶標板內(nèi)每孔加入70 μ 1神經(jīng)氨酸酶檢測緩
91的比例混合，攪拌、 5 3的比例混合，攪 2的比例混合，攪拌、 7 5的比例混合，沖液；b.每孔再分別加入0、1、2、5、7. 5、10μ 1 H5m神經(jīng)氨酸酶；c.每孔再加入0 20 μ 1 Milli-Q 水。(2).樣品檢測的準備a.在96孔熒光酶標板內(nèi)每孔加入70 μ 1神經(jīng)氨酸酶檢測 緩沖液；b.每孔再加入10 μ 1 Η5Ν1神經(jīng)氨酸酶；C.每孔再加入0 10 μ 1女貞苷、野漆樹 苷、金絲桃苷組合物樣品；d.每孔再加入0 10 μ 1 Milli-Q水。(3).檢測步驟a.振動混勻約Imin ；b. 37°C孵育2min使抑制劑和H5W神經(jīng)氨酸酶充分相互作用，做標準曲線的樣品 也一起孵育；c.每孔加入10 μ 1神經(jīng)氨酸酶熒光底物；d.再振動混勻約Imin ；e. 37°C孵育20 30min后進行熒光測定。激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為440nm。(4).根據(jù)標準曲線計算出樣品對于H5W神經(jīng)氨酸酶的抑制百分比，以及做濃度 曲線后計算出女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對于H5m神經(jīng)氨酸酶的IC50。女貞苷、野 漆樹苷、金絲桃苷組合物達到對神經(jīng)氨酸酶的抑制率IC50為0. 13g/L。見表2。表2.女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物抑制神經(jīng)氨酸酶的活性 根據(jù)上述實驗結(jié)果可以清楚地看到(1).女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物能夠提取出有效的抑制神經(jīng)氨酸酶成 分；(2).女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物隨著使用劑量大小變化，其抑制神經(jīng)氨酸 酶活性的能力，即神經(jīng)氨酸酶抑制率的高低也相應(yīng)發(fā)生變化，并且成正相關(guān)；(3).由上述實驗可見，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物能夠通過抑制流感病毒 表面神經(jīng)氨酸酶，進而抑制流感病毒進入細胞里面、抑制已經(jīng)進入細胞里面的流感病毒復(fù) 制、增殖，從而減少了流感病毒對細胞的感染、生長，以及預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥。醫(yī)學和藥學研究人員無法預(yù)先在不做抑制流感病毒感染、復(fù)制，或抑制神經(jīng)氨酸 酶的實驗的前提下，預(yù)先得知女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物具有預(yù)防和治療流感病毒 性感冒的良好效果。實驗數(shù)據(jù)2 女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對流感病毒感染雞胚的抑制作用取實施例5制備方法所獲得的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，應(yīng)用流感病毒 亞甲型鼠肺適應(yīng)株(FMl) (HlNl)鑒定女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物抑制FMl流感病 毒在雞胚中復(fù)制和抑制的能力。(1).將FMl流感病毒液接種于IOd齡無特定病原體雞胚 尿囊腔內(nèi)，每胚0.2ml，37°C孵育72h，觀察并計算半數(shù)雞胚感染量(EID50)。(2).女貞苷、 野漆樹苷、金絲桃苷組合物對雞胚的毒性作用采用，無菌生理鹽水對女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物作系列稀釋后接種于IOd齡無特定病原體雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚0. 2ml，每個濃 度接種6胚，37°C孵育，觀察雞胚生長發(fā)育情況，以雞胚可存活96h的最大濃度作為藥物的 TD。(3).女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物在雞胚中對流感病毒的抑制作用采用，0.1ml 的流感病毒液和不同稀釋度的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物混合，37°C作用2h，接種 于IOd齡無特定病原體雞胚尿囊腔，每組接種6胚，37°C孵育72h。病毒攻擊量為50EID50， 同時設(shè)病毒對照、無菌生理鹽水正常對照，計算女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對病毒 抑制作用的半數(shù)有效劑量(ED50)。(1).FM1流感病毒對雞胚的毒力經(jīng)Reed-Muench法計算，其EID50為10_5_°7。(2). 女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物接種于雞胚后，其生長發(fā)育與正常對照組基本一致。96h 雞胚均存活。雞胚給予女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物原液未見雞胚死亡，所以可認為 TDO為2.0g/L。(3).女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物在雞胚中對流感病毒的抑制作用見
表3o表3.女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對流感病毒感染雞胚的抑制作用 與病毒對照組比較卞< 0. 05由表3可知，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物在0. 125 1. Og/L對流感病毒有 顯著的抑制作用(P < 0. 05)，ED50 為 0. 16g士0. 007g/L，TI 為 43. 75士3. 28。實驗數(shù)據(jù)3 女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對FMl流感病毒影響取實施例5制備方法所獲得的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，應(yīng)用流感病毒 亞甲型鼠肺適應(yīng)株(FMl) (HlNl)鑒定女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物抑制FMl流感病毒 毒力的能力。(1). FMl對狗腎傳代細胞(MDCK)的毒力測定采用細胞半數(shù)感染量(TCID50)微 量法。(2).女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對MDCK細胞的毒性測定采用無血清的DMEM 對女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物作系列稀釋后接種于已形成單層的MDCK細胞孔中， 每孔100 μ 1，每個稀釋度重復(fù)4個孔，同時設(shè)正常細胞對照。將培養(yǎng)板置37°C、5%C02培養(yǎng) 箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察細胞病變(CPE)，連續(xù)觀察3d，以“+ ++++”記錄結(jié)果，按Reed-Muench 法計算藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TDO)。(3).女貞苷、野漆樹苷、金絲桃 苷組合物抑制FMl流感病毒作用測定MDCK細胞5X 105/ml，每孔100 μ 1，分別于96孔板 中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日吸去孔中培養(yǎng)液，加入100TCID50流感病毒液，每孔100μ 1，37°C吸附Ih后吸去上清液。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，以藥物的TDO為第1 孔，再用無血清的DMEM液對女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物作系列稀釋，分別加入上述 已感染病毒的細胞中，同時設(shè)病毒對照和正常對照組，37°C、5% 0)2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察 流感病毒產(chǎn)生的MDCK細胞病變特征，即單層細胞變性變圓等，連續(xù)3d，計算出藥物的50% 抑制病變濃度(IC50)及治療指數(shù)(Tl)。TI的計算TI = TD50/IC50,TI值越大，表明藥物 的安全范圍越大。以Kruskal-Walis和Marm-Whitney檢驗法比較試驗組與病毒對照組細 胞病變的差異，對藥物劑量和對病毒感染細胞避免發(fā)生細胞病變(CPE)的抑制率進行相關(guān) 性分析，判斷是否存在量效反應(yīng)關(guān)系。(1). FMl流感病毒對MDCK細胞的毒力經(jīng)Reed-Muench法計算，其TCID50為10_4 81。 (2).女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物MDCK細胞的TDO分別為0.89g 士 0.037g/L。(3).將 女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物作系列稀釋后，對100TCID50流感病毒進行抑制試驗， 計算藥物的半數(shù)有效量IC50及TI值大小，結(jié)果見表4。表4.女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對FMl流感病毒的IC5(1(g/L)及TI (χ士s) 由表4可知，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物的IC50低，TI高。女貞苷、野漆樹 苷、金絲桃苷組合物抑制FMl流感病毒致細胞病變的作用均隨著藥物劑量的增加而增強。 對藥物劑量和藥物對CPE的抑制率進行的相關(guān)性分析表明，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組 合物的劑量與藥物對CPE抑制率之間呈明顯的正相關(guān)。實驗數(shù)據(jù)4 女貞苷、野漆樹苷、金 絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的脾指數(shù)和肺指數(shù)的影響取實施例5制備方法所獲得的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，應(yīng)用流感病毒 亞甲型鼠肺適應(yīng)株(FMl) (HlNl)鑒定女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染 流感病毒FMl株的死亡保護作用。(1).流感病毒FMl株病毒做10倍倍比稀釋后分別接種 每組10只BALB/C小鼠，雌雄各半。乙醚輕度麻醉后，每組分別給與不同稀釋度的病毒，每只 小鼠滴鼻接種20 μ 1。觀察IOd的小鼠死亡情況，按Reed-Muench法計算LD50為10-1.36。故 確定實驗所用的造模濃度為10LD50。(2).女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi) 感染流感病毒FMl株的死亡保護作用正常對照組、流感病毒FMl株病毒對照組、女貞苷、野 漆樹苷、金絲桃苷組合物0. 125g/L、0. 25g/L、0. 5g/L、l. Og/L劑量組等分別灌胃，灌胃容量 均為0. 4ml/只。3d后，除正常對照組外各組在乙醚輕度麻醉下用10LD50流感病毒FMl株 滴鼻感染小鼠20 μ 1/只。同時正常對照組給予同體積的生理鹽水。給藥的4組繼續(xù)給藥， 正常對照組和流感病毒FMl株病毒對照組給生理鹽水8天，劑量同上。逐日觀察動物發(fā)病和 記錄死亡數(shù)，共觀察14天，計算死亡率(死亡率=每組死亡數(shù)/每組小鼠總數(shù)X 100% )， 結(jié)果見表5。(3).女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株肺 指數(shù)的影響正常對照組、流感病毒FMl株病毒對照組、女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物0. 125g/L、0. 25g/L、0. 5g/L、l. Og/L劑量組等分別灌胃，灌胃容量均為0. 4ml/只。3天后， 除正常對照組外各組在乙醚輕度麻醉下用1. 0LD50流感病毒FMl株滴鼻感染小鼠20 μ 1/ 只。同時正常對照組給予同體積的生理鹽水。給藥的4組繼續(xù)給藥，正常對照組和流感病 毒FMl株病毒對照組給生理鹽水8天，劑量同上。于病毒感染后第8天處死小鼠，稱體重， 取肺稱肺重，計算肺指數(shù)(肺指數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量X 100%)；此外，取脾稱脾重，計算脾 指數(shù)(脾指數(shù)=脾質(zhì)量/體質(zhì)量X 100% )，結(jié)果見表6。 表5.女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的死亡 保護結(jié)果 注※※P < 0. OlVS流感病毒模型組 ※？ < 0. 05VS流感病毒模型組表6.女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的脾指
數(shù)和肺指數(shù)的影響 注:#Ρ < 0. 05VS正常對照組 注※※ρ < 0. 001VS流感病毒模型組 ※口 < 0. 05VS流感病毒模型組(1).由表5可知，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物在0. 25 1. Og/L對流感病 毒感染小鼠有顯著的保護作用(P < 0.01)。(2).由表6可知，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物在0.5 1. Og/L對流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)抑制率有顯著的作用(P < 0.01)。實驗數(shù)據(jù)5 女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對腎功能損傷的影響1) SD大鼠，200 240g，上海西普爾-必凱實驗動物責任有限公司，動物合格證號 SCXK(滬)2003-00022)試劑及藥物腺嘌呤，腺嘌呤，(含量> 98%，為進口分裝，中國上海，批號 20010520)，實施例3制備方法所獲得的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物；3)試驗方法雄性SD大鼠，體重220g左右，先用普通飼料喂養(yǎng)10天正常生長后， 按體重隨機分為正常對照組、給藥實驗組和造模對照組，每組13 15只。給藥實驗組和造 模對照組用腺嘌呤灌胃制作慢性腎功能衰竭(CRF)模型，以腺嘌呤320mg/(kg*d)灌胃，用 蒸餾水制成混懸液約2ml/只，共20天；20天后給藥，給藥實驗組以女貞苷、野漆樹苷、金絲 桃苷組合物2. 5g/(kg .d)灌胃，女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物以蒸餾水制成混懸溶液 (0. 625g/ml)，每次約2ml/只，分次灌胃，正常對照組和造模對照組以等體積水灌胃，給藥 35天后將大鼠用乙醚麻醉，鼠尾動脈采血觀察各項指標。4)結(jié)果表7.女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對CRF大鼠腎功能的影響 注經(jīng)T檢驗，給藥女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物與造模對照組和正常對照 組比較“*”表示P < 0. 05，“#”表示P < 0. 01本實驗用腺瞟呤灌胃建立大鼠CRF模型后，造模對照組大鼠精神萎靡，體重明顯 降低，血清BuruSer明顯升高，Hb明顯下降，Ret明顯升高，表明大鼠腎功能受損，經(jīng)給予女 貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物治療后與正常對照組差異不顯著，而與模型組比較差異十 分顯著，故女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物對對腎臟無毒性作用。
權(quán)利要求
女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，所述女貞苷的分子式C33H40O18，分子量724.2，所述女貞苷的結(jié)構(gòu)式如下所述野漆樹苷的分子式C27H30O14，分子量578.52，所述野漆樹苷的結(jié)構(gòu)式如下所述金絲桃苷的分子式C21H20O12，分子量464.38，所述金絲桃苷的結(jié)構(gòu)式如下其中所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷80％～40％、野漆樹苷5％～45％、金絲桃苷1％～40％。FSA00000229851300011.tif,FSA00000229851300012.tif,FSA00000229851300013.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，其中所述的女貞苷、野 漆樹苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷75% 45%、野漆樹苷10% 40%、金絲桃苷5% 35%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，其中所述的女貞苷、野 漆樹苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷70% 50%、野漆樹苷15% 35%、金絲桃苷10% 30%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，其中所述的女貞苷、野 漆樹苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷65% 55%、野漆樹苷20% 30%、金絲桃苷15% 25%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，其中所述的女貞苷、野 漆樹苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷58%、野漆樹苷25%、金絲桃苷 17%。
6.權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的組合物用于制備預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥疾病的藥 物的用途。
7.如權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述的組合物用于抑制流感病毒。
8.如權(quán)利要求7的用途，其特征在于所述的組合物用于抑制流感病毒FM1。
9.權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述的組合物用于抑制神經(jīng)氨酸酶。
10.權(quán)利要求6的用途，其并發(fā)癥是指腎功能衰竭。
11.權(quán)利要求6的用途，其并發(fā)癥是指脾損傷或/和肺損傷。
12.—種女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物制劑，其中該制劑以權(quán)利要求1 5任一項 所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物為主要活性成分。
13.權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物的提取方法，其中 所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷是從山香圓葉中提取獲得的，所述提取方法如下取山 香圓葉，加5 15倍量的30% 90%乙醇回流提取1 3次，每次回流提取1 3小時，濾 過；合并濾液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱洗脫，收集洗脫部分，減壓濃縮，干燥，得女 貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)分離，分別合并女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷流份， 結(jié)晶，得到女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷純品。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷采用如下的提 取方法獲得取山香圓葉，加12倍量70%乙醇回流提取1.5小時，濾過，濾渣再加10倍量 70%乙醇回流提取1.5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱洗 脫，收集洗脫部分，減壓濃縮，干燥。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中水溶液通過已處理好的大孔樹脂柱，分別用 水、5 % 10 %乙醇、30 % 55 %乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集30 % 55 %乙醇洗脫部 分，減壓濃縮，干燥。
16.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中混合總苷經(jīng)硅膠柱層析、SephadexLH-20柱 層析分離，分別合并女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到女貞苷、野漆樹苷和金絲 桃苷的純品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種女貞苷、野漆樹苷、金絲桃苷組合物，其是通過按女貞苷80％～40％、野漆樹苷5％～45％、金絲桃苷1％～40％的重量配比制成的組合物，該組合物可作神經(jīng)氨酸酶抑制劑用在預(yù)防和治療流感，制成藥學上可以接受的劑型。
文檔編號A61P31/16GK101890038SQ20101025377
公開日2010年11月24日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者劉地發(fā), 葉勁英, 呂武清, 李志勇, 楊小玲, 程帆, 蔡永紅, 謝寧 申請人:江西山香藥業(yè)有限公司;江西青峰藥物研究有限公司