專(zhuān)利名稱(chēng)：腎上腺素受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其涉及腎上腺素受體激動(dòng)劑在治療貧血 病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腎上腺素受體激動(dòng)劑是指一類(lèi)具有類(lèi)似腎上腺素的功能或具有能使腎上腺素受 體產(chǎn)生興奮作用的化合物，大多具有β “苯乙胺的化學(xué)基本結(jié)構(gòu)，包含苯環(huán)、碳鏈和氨基， 其所含化學(xué)基團(tuán)的不同可以決定其藥效的側(cè)重、強(qiáng)弱和時(shí)效差異。按照其主要結(jié)構(gòu)特征可 分為兒茶酚胺類(lèi)和非兒茶酚胺類(lèi)(見(jiàn)表1)。表1主要腎上腺素受體激動(dòng)劑結(jié)構(gòu)特征類(lèi)別
同時(shí)，不同的腎上腺素受體激動(dòng)劑可以選擇性地作用于α、β等受體(見(jiàn)表2)。
表2主要腎上腺素受體激動(dòng)劑與腎上腺素受體結(jié)合的特征類(lèi)別
在臨床使用的腎上腺素受體激動(dòng)劑中，去氧腎上腺素常作為非兒茶酚胺類(lèi)α受體激動(dòng)劑的代表性藥物，異丙腎上腺素常作為兒茶酚胺類(lèi)β受體激動(dòng)劑的代表性藥物，開(kāi)展腎 上腺素受體激動(dòng)劑的藥理學(xué)研究，通過(guò)對(duì)該代表性藥物的研究，了解腎上腺素受體激動(dòng)劑 的藥理學(xué)的功能研究(趙亞力，等。2008。中華老年多器官疾病雜志。2008年12月第7卷 第 6 期，495-498)。在腎上腺素受體激動(dòng)劑中的臨床應(yīng)用，已知的臨床采用例如去氧腎上腺素 (phenylephrine, ΡΕ)對(duì)血管有強(qiáng)烈的收縮效應(yīng)。在臨床上主要用于減充血?jiǎng)?，擴(kuò)瞳劑和升 壓藥。由于去氧腎上腺素是一種直接的選擇性的α-腎上腺受體刺激物，并不引起內(nèi)源的 去甲腎上腺素的釋放。因此，去氧腎上腺素一般不會(huì)引起對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的刺激、失眠、焦 慮不安等等副作用。其作為減充血?jiǎng)┑男?yīng)來(lái)自其鼻血管收縮，從而導(dǎo)致竇狀隙血管的血 流下降，減少粘膜水腫。也有用以局部的注射治療陰莖的異常勃起的療效。其使用的主要副 作用是導(dǎo)致血壓增高(Hatton et al.，2007. Annals of Pharmacology. 41: 381-390; Dai et al. , 2010. European Journal of Pharmacology. 629, 82-88)。又如異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO),異丙腎上腺素是一種擬交感(神經(jīng)) 的β腎上腺刺激藥物。其結(jié)構(gòu)上與腎上腺素相似，可以與β 1和β 2受體結(jié)合。其主要的臨 床主要用途是心動(dòng)過(guò)緩或心傳導(dǎo)阻滯。通過(guò)激活心臟的β 1受體，可以誘導(dǎo)心律的變時(shí)、心 臟神經(jīng)調(diào)節(jié)的變導(dǎo)，增強(qiáng)心肌收縮性。在沙丁胺醇(salbutamol)廣泛使用前，ISO也被作為 氣霧治療哮踹，主要通過(guò)的是作為β 2腎上腺素受體的激動(dòng)劑松弛氣管改善呼吸。其主要 的進(jìn)藥方式是靜脈注射、口服、吸入氣霧、皮下和肌肉注射等。其主要的副作用是對(duì)心血管 系統(tǒng)的影響，可以導(dǎo)致心律加快，可能使患者發(fā)生心律失常(Wallukat 2002. Herz. 27， 683-690; Evans et al. , 2010. British Journal Pharmacology. 159，1022-1038)。動(dòng)物體內(nèi)含有多種血紅蛋白基因，為有效的氧攜帶需求，有效的血紅蛋白常由2 個(gè)α-珠蛋白與另外的兩個(gè)珠蛋白組成異源蛋白四聚體，成為高效的氧氣攜帶蛋白體。而 與α-珠蛋白有效的這類(lèi)四聚體的另外兩個(gè)珠蛋白常伴隨著紅細(xì)胞的形態(tài)變化、紅細(xì)胞發(fā) 生的部位發(fā)生轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致血紅蛋白的成分發(fā)生變化。人類(lèi)的血紅蛋白在胚胎起始期主 要表達(dá)ε_(tái)珠蛋白與α-珠蛋白結(jié)合，在大約原腸期6-8周時(shí)，發(fā)生了人類(lèi)的胚胎期的血 紅蛋白轉(zhuǎn)換(embryonic switch), ε -珠蛋白的編碼基因開(kāi)始沉默，而與此同時(shí)，取而代之 的是胚胎型珠蛋白(Y-珠蛋白)基因開(kāi)始表達(dá)，此類(lèi)Y-珠蛋白表達(dá)上升并維持在整個(gè)胎 兒成長(zhǎng)期，此后再次的血紅蛋白轉(zhuǎn)換，即胎兒期轉(zhuǎn)換(fetal switch)發(fā)生于圍產(chǎn)期(出生后 1月結(jié)束)，在這一次血紅蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)換過(guò)程中，Y-珠蛋白的表達(dá)基本沉默，人體開(kāi)始表 達(dá)β-和δ-珠蛋白基因和其產(chǎn)物的合成，使胚胎期的血紅蛋白(fetal hemoglobin, HbF) 的表達(dá)在成年血紅細(xì)胞中的合成下降，在成年階段的α 2 Y2珠蛋白四聚體的含量?jī)H占成年 的血紅蛋白總含量的1%以下，成年階段主要的血紅蛋白為血紅蛋白Α，即α2β2四聚體，而 另外一種也僅在成年期表達(dá)合成的成年血紅蛋白Α2 (即Ci2 δ2)也含量較少，低于血紅蛋 白總量的2%。由于發(fā)生較晚的胎兒期轉(zhuǎn)換fetal switch)對(duì)人類(lèi)的生活影響較大，一般血 紅蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)換(hemoglobin switch)所指的便是此次轉(zhuǎn)換(Grosveld et al.，1987. Cell. 51，975-985; Bank. 2006. Blood. 107，435-443)。經(jīng)過(guò)近30年的研究，人們發(fā)現(xiàn)人類(lèi)的至少5個(gè)功能性珠蛋白的編碼基因ε、G Y、 AY、δ和β均位于第11號(hào)染色體上的一段IOOkb的位置，呈串聯(lián)狀態(tài)存在，其中至少發(fā)現(xiàn) 在人類(lèi)β-珠蛋白編碼位點(diǎn)前含有一個(gè)位點(diǎn)控制區(qū)域(locus control region, LCR)，近幾
4年的研究表明對(duì)該LCR位點(diǎn)的表觀遺傳學(xué)特性的改變和調(diào)控對(duì)于人類(lèi)的血紅蛋白的沉默、 表達(dá)和轉(zhuǎn)換具有重要的調(diào)節(jié)作用(Grosveld et al.，1987. Cell. 51，975-985; Yinet al. , 2007. Blood. 110，4101—4107)。一類(lèi)由多種不同的遺傳突變導(dǎo)致的對(duì)成年階段珠蛋白的表達(dá)發(fā)生影響的遺 傳病，其表現(xiàn)為珠蛋白的合成完全消失或出現(xiàn)了明顯的下降。這類(lèi)病例常發(fā)生于地中 海地區(qū)、中東、非洲和南亞，因此此疾病得名β型地中海貧血病。在某些病人中由于β-珠 蛋白的不足出現(xiàn)了成年階段α-珠蛋白合成未能與足量的β-珠蛋白結(jié)合成為成熟的血紅 蛋白四聚體，而導(dǎo)致血紅細(xì)胞的破裂和骨髓等生血部位發(fā)生的紅細(xì)胞前體的破壞。目前已 有超過(guò)200余種不同的人類(lèi)突變已被鑒定發(fā)生于該類(lèi)患者人群中，包括β和δ β編碼區(qū) 域的缺失、β編碼區(qū)中終止密碼的提前出現(xiàn)導(dǎo)致無(wú)功能的蛋白合成、抑制珠蛋白前體 RNA的成熟加工過(guò)程等的突變。目前在我國(guó)也已有20多種突變的發(fā)生報(bào)道(李霞，等。2008。 中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志。16卷，第43頁(yè))。根據(jù)導(dǎo)致珠蛋白缺陷的突變基因的攜帶者 主要出現(xiàn)在地中海地區(qū)，但由于種族間的通婚和移民活動(dòng)的頻繁，過(guò)去不曾發(fā)現(xiàn)患病的區(qū) 域也開(kāi)始有患者的出現(xiàn)記錄，例如隨著近期亞洲移民的涌入，北美地區(qū)β型地中海貧血病 的罹患群體也在出現(xiàn)變化，近來(lái)也主要出現(xiàn)在亞裔移民人群中(Vichinsky et al. , 2005. Pediatrics. 115，e818_825)。β型地中海貧血病也是我國(guó)南方地區(qū)最常見(jiàn)的遺傳性血液 病，主要發(fā)生于廣東、廣西和海南等省人群中，根據(jù)部分人口的調(diào)查統(tǒng)計(jì)，在廣東、廣西省攜 帶地中海貧血基因者分別達(dá)到了 11%和13%。其中在廣西橫縣2006年的一項(xiàng)調(diào)查也表明該 縣的新生兒中出現(xiàn)β型地中海貧血病的發(fā)病率高達(dá)4. 57% (顏秀梅，等。2007。中國(guó)婦幼 保健。22，1196)。鐮刀型血紅細(xì)胞貧血病是一種較為常見(jiàn)的隱性血紅蛋白突變遺傳病。是由點(diǎn)突變 導(dǎo)致人類(lèi)β-珠蛋白編碼區(qū)的第六位纈氨酸(valine)改變?yōu)楣劝彼?glutamic acid)而 導(dǎo)致S型的血紅蛋白的合成。這種突變將導(dǎo)致無(wú)氧狀態(tài)下的S型血紅蛋白的溶解度大大下 降，從而使其在低氧狀態(tài)中的S型血紅蛋白在紅細(xì)胞中形成多聚體，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞易碎。 該病例在沙哈拉以南的非洲地區(qū)、中東、地中海地區(qū)、印度此大陸、中南美洲易出現(xiàn)，純系突 變病人的伴隨著嚴(yán)重的并發(fā)癥，壽命下降(Bianchi et al. , 2007. eCAM. 6，141-151; Testa, U. 2009. Annals of Hematology. 88， 505-528)。對(duì)于上述兩種由于成年階段的β-珠蛋白的突變導(dǎo)致的貧血病，一般的有效應(yīng)急 治療方式是輸血，通過(guò)輸入健康的血液及對(duì)含有正常成年血紅蛋白的健康紅細(xì)胞的補(bǔ)充， 暫時(shí)改善患者血液的攜氧能力。然而此類(lèi)方式由于血紅細(xì)胞的代謝周期，效果僅是緩解， 需要不斷通過(guò)輸血補(bǔ)充，這將帶來(lái)費(fèi)用和對(duì)血源安全控制的高昂成本，并非根治措施。類(lèi) 似的措施也有脊髓移植，此方法要求脊髓配型以及對(duì)原有脊髓干細(xì)胞的完全破壞并培育轉(zhuǎn) 入的脊髓干細(xì)胞達(dá)致正常擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)，一般的配型基本來(lái)自近親，只能在16歲前施行該項(xiàng) 手術(shù)，并要求患者無(wú)肝病史。目前，此法仍是減輕該類(lèi)患者有前途的治療方式，其長(zhǎng)效性尚 待觀察。另外的替代治療措施是基因治療則受目前技術(shù)應(yīng)用的憂患和操作的高額成本而 在可見(jiàn)的未來(lái)難以成熟推廣(Bianchi et al.，2007. eCAM. 6，141-151; Gambari and Fibach, 2007. Current Medical Chemistry. 14， 199—212)。然而由于有人發(fā)現(xiàn)在β型地中海貧血病患者中同時(shí)伴隨著Y-珠蛋白高表達(dá)的 遺傳突變者，其癥狀大大減輕，使得許多醫(yī)療工作者開(kāi)始了對(duì)Y-珠蛋白在成年中的再誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)于上述兩種由于成年階段的珠蛋白的突變導(dǎo)致的貧血病的臨床治療效果開(kāi) 始了觀察研究，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)胚胎型血紅蛋白(HbF)，S卩Y-珠蛋白的誘導(dǎo)可以具有對(duì)上述兩 種由于成年階段的β-珠蛋白的突變導(dǎo)致的貧血病的明顯改善(Bianchi et al. , 2007. eCAM. 6, 141-151； Gambari and Fibach, 2007. Current Medical Chemistry. 14, 199-212; Testa, U. 2009. Annals of Hematology. 88， 505-528)。借助人類(lèi)血細(xì)胞前體細(xì)胞系K562作為研究平臺(tái)，根據(jù)人們對(duì)人體血紅蛋白串 聯(lián)基因簇的調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)(Rutherford et al.，1981. Proceedings of National Academy of Sciences, USA. 78, 348-352; Bianchi et al., 2007. eCAM. 6, 141-151)，近十年來(lái)，人們開(kāi)始了對(duì)具有對(duì)人體胚胎型血紅蛋白的化學(xué)品的篩選及臨床應(yīng) 用的毒副作用開(kāi)展了一些研究觀察(Bianchi et al.，2007. eCAM. 6，141-151; Gambari and Fibach, 2007. Current Medical Chemistry. 14, 199-212)
5_氮胞苷(5-azaCytidine，5-Aza)是第一種被用以作為患者胚胎型血紅蛋白誘導(dǎo)表 達(dá)，病用作對(duì)前述兩種由于成年階段的珠蛋白的突變導(dǎo)致的貧血病患者開(kāi)展治療的 化學(xué)品。其后致癌性相對(duì)較小的衍生物地他西濱(5-aZa-2’ -dexycytidine)被引入主要 開(kāi)展臨床研究，受試的100%鐮刀型貧血病患者均由于其胚胎型血紅蛋白的高表達(dá)而使病 情有所緩解。2008年此藥物進(jìn)入美國(guó)食品衛(wèi)生署批準(zhǔn)的針對(duì)鐮刀型貧血病治療的II期 臨床試驗(yàn)(Appleton et al. , 2007. Journal of Clinical Oncology. 25，4519-4521; Saunthararajah et al. , 2008. British Journal of Haematology. 141, 126—129)。許多證據(jù)表明組蛋白去乙?；傅囊种苿┛梢詫?dǎo)致胚胎型血紅蛋白的合成增加， 根據(jù)報(bào)道具有此類(lèi)特性的化合物已有丁酸鈉(sodium butyrate)、adipicin、scriptaid{6 -(1, 3-Dioxo-lH, 3H_benzo [de] isoquinolin-2-yl) -N-hydroxyhexanamide}、曲古菌素 A( trichostatin A, TSA)、MS-275、RB7、丙戊酸(valproic acid)等，其中研究較多的是丁酸 鹽，但此類(lèi)藥物的長(zhǎng)期使用竟會(huì)出現(xiàn)對(duì)胚胎型的血紅蛋白的合成抑制，因此需要間歇使用， 另外也不是100%的鐮刀型紅細(xì)胞貧血病的患者都能對(duì)丁酸鹽類(lèi)藥物發(fā)生應(yīng)答效應(yīng)(Witt et al. , 2000. Blood. 95，2391—2396; Cao, H. 2004. Hematology. 9，223—233; Johnson et al., 2005. Cell and Molecular Biology. 51, 229-238; Roondah1, G. 2006. Haematology. 81，374—376; Yin et al.，2007. Blood. 110，4101—4107)。早在1984年就在猴中發(fā)現(xiàn)羥基脲(hydroxyurea)可以刺激胚胎型血紅蛋白的產(chǎn) 生，但也不是所有的鐮刀型紅細(xì)胞貧血病的患者都能對(duì)羥基脲發(fā)生應(yīng)答效應(yīng)。2004年進(jìn) 行的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羥基脲可以減少在中度至重度鐮刀型貧血病導(dǎo)致急性胸悶的成年患者 中發(fā)生呼吸危及或休克的頻率，從而降低對(duì)其輸血和入院治療的需求，在這個(gè)以安慰劑為 對(duì)照的實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，羥基脲為美國(guó)食品衛(wèi)生署批準(zhǔn)為治療鐮刀型貧血病的藥物。多數(shù)鐮 刀型紅細(xì)胞貧血病的患者可以由羥基脲誘導(dǎo)胚胎型血紅蛋白的產(chǎn)生，但其誘導(dǎo)表達(dá)的合 成量卻明顯因人而異，這可能與血紅蛋白基因簇處的遺傳多態(tài)性有關(guān)。羥基脲是一個(gè)可 以通過(guò)促進(jìn)自由氧基產(chǎn)生的細(xì)胞毒性物質(zhì)，因此，有人擔(dān)憂其長(zhǎng)期使用對(duì)體內(nèi)遺傳物質(zhì)的 改變，從而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生，但最近有美國(guó)健康研究院組織的統(tǒng)計(jì)表明使用該藥物的鐮刀 型貧血病患者與其他該病患者并未表現(xiàn)出明顯的腫瘤發(fā)病率上的差異。同時(shí)羥基脲針對(duì) β-地中海貧血病的療效也取得了較為人滿意的結(jié)果。只是其療效也與人群的遺傳背景 相關(guān)(Steinberg et al. , 2003. JAMA. 289，1645-1652; Testa, U. 2009. Annals of
6Hematology. 88， 505-528·)。由于血液細(xì)胞的分化過(guò)程受多種血液干細(xì)胞活性因子調(diào)控，例如紅細(xì)胞生成素 (erythropoiesis,印ο)和血液干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF)。這類(lèi)因子由于可 以促進(jìn)有效的紅細(xì)胞生成，從而導(dǎo)致胚胎型血紅蛋白的重新表達(dá)達(dá)至胎兒時(shí)期，所以被認(rèn) 為具有治療β-珠蛋白缺陷導(dǎo)致的疾病。在針對(duì)再生障礙性貧血、臍帶血液移植或癌癥患 者進(jìn)行的相關(guān)臨床試驗(yàn)觀察中，紅細(xì)胞生成素和血液干細(xì)胞因子誘導(dǎo)胚胎型血紅蛋白的 作用得到證實(shí)，只是有時(shí)伴有過(guò)敏反應(yīng)，因此，有人建議如果采用紅細(xì)胞生成素和血液干 細(xì)胞因子進(jìn)行對(duì)鐮刀型貧血病和β地中海貧血病開(kāi)展臨床治療，需要考慮長(zhǎng)期低劑量的 方式，并適當(dāng)關(guān)注其患者的過(guò)敏癥狀的發(fā)生(Gabbianelli et al. , 2008. Blood. 111， 421-429.)。近來(lái)針對(duì)胚胎型血紅蛋白的誘導(dǎo)性化合物還有薩立多胺(Thalidomide)，該化 合物是一種谷氨酸衍生物，過(guò)去是用作鎮(zhèn)靜藥或治療暈船。后由于其致畸作用而被撤除 市場(chǎng)，隨后又作為免疫調(diào)節(jié)藥物、抗炎癥和抑制血管生成藥物重新獲得采用的臨床處方 藥。2007年有報(bào)道在體外實(shí)驗(yàn)中可以觀察到對(duì)胚胎型血紅蛋白的誘導(dǎo)作用。另外來(lái)那 度胺(Lenalidomide)和尼洛替尼(pomalidomide)，一類(lèi)用作腫瘤藥物的免疫調(diào)節(jié)劑，在 2008也被顯示具有誘導(dǎo)胚胎型血紅蛋白的作用，尤其是在與羥基脲聯(lián)合使用時(shí)，具有較強(qiáng) 的對(duì)誘導(dǎo)胚胎型血紅蛋白的協(xié)同效應(yīng)。近來(lái)，天然化合物中對(duì)胚胎型血紅蛋白的篩選工 作也得到重視，目前已有報(bào)道的自天然植物、微生物等產(chǎn)生的誘導(dǎo)胚胎型血紅蛋白的化合 物已有香檸檬油(Bergaptene)、異補(bǔ)骨脂素(Angelicin)、雷帕霉素(Rapamycin)、白藜蘆 醇(Resveratrol)、光神霄素(Mithramycin)禾口 5-甲氧基補(bǔ)骨月旨素(5—methoxypsoralen， 5-M0P)等。其主要篩選手段即為采用人類(lèi)K562細(xì)胞系作為效應(yīng)篩選平臺(tái)，進(jìn)行體外誘導(dǎo) 人類(lèi)胚胎型血紅蛋白的效應(yīng)化合物的篩選，目前，針對(duì)這些天然化合物所開(kāi)展的臨床應(yīng)用 觀察的報(bào)道所見(jiàn)不多(Bianchi et al. , 2007. eCAM. 6，141-151; Gambari and Fibach, 2007. Current Medical Chemistry. 14， 199—212)。由上可知，雖然大量數(shù)據(jù)已表明多種化合物在臨床上具有對(duì)胚胎型血紅蛋白的誘 導(dǎo)效應(yīng)，但也可見(jiàn)其誘導(dǎo)效率隨患者遺傳背景或多態(tài)性而異，許多影響因素甚至并非與突 變的血紅蛋白連鎖位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性相關(guān)。其中由于治療或緩解β地中海貧血癥需要更 高地對(duì)胚胎型血紅蛋白的誘導(dǎo)效率，而今主要的誘導(dǎo)劑的體內(nèi)誘導(dǎo)能力仍不足以彌補(bǔ)體內(nèi) β-珠蛋白的缺失所帶來(lái)的癥狀。以此角度看來(lái)，過(guò)去曾有學(xué)者認(rèn)為血液干細(xì)胞因子相對(duì)最 有希望，因其通過(guò)誘導(dǎo)紅細(xì)胞的生成，對(duì)胚胎型血紅蛋白的誘導(dǎo)作用相對(duì)較強(qiáng)，只是其可能 伴隨的副作用值得關(guān)注。因此，合理的解決途徑將是通過(guò)各類(lèi)效應(yīng)化合物的協(xié)同作用，通過(guò) 其誘導(dǎo)胚胎型血紅蛋白的各種誘導(dǎo)機(jī)制間的互補(bǔ)，通過(guò)長(zhǎng)效、低劑量、交替的臨床使用，達(dá) 至最大可能的避免同一種藥物的長(zhǎng)期使用對(duì)副作用的積累，并同時(shí)有效誘導(dǎo)人類(lèi)胚胎型血 紅蛋白的合成，為由于珠蛋白的缺陷或表達(dá)水平異常而產(chǎn)生的各類(lèi)血紅蛋白病、貧血 病的治療提供有力的治療手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了腎上腺素受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)。本發(fā)明的 另一目的是提供上述具有誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)作用的腎上腺素受體激動(dòng)劑用于治療β-珠蛋白自身缺陷或表達(dá)水平發(fā)生缺陷的遺傳疾病，可以緩解如β型地中海貧血病或鐮 刀型細(xì)胞貧血病的貧血癥狀。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
腎上腺素受體激動(dòng)劑通過(guò)注射或者口服，對(duì)人類(lèi)血細(xì)胞中胚胎型珠蛋白的表達(dá)具有誘 導(dǎo)作用，因此，腎上腺素受體激動(dòng)劑可用于誘導(dǎo)人類(lèi)胚胎型珠蛋白的表達(dá)。將具有誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)作用的腎上腺素受體激動(dòng)劑用于治療珠蛋白 自身缺陷或表達(dá)水平發(fā)生缺陷的遺傳疾病，可以緩解如β型地中海貧血病或鐮刀型細(xì)胞 貧血病的貧血癥狀。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果是將腎上腺素受體激動(dòng)劑用于誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)，因 而其可用于治療β-珠蛋白自身缺陷或表達(dá)水平發(fā)生缺陷的遺傳疾病，如對(duì)β型地中海 貧血病或鐮刀型細(xì)胞貧血病的患者進(jìn)行其胚胎型珠蛋白的誘導(dǎo)，以緩解貧血病人的貧血癥 狀。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例一
腎上腺素受體激動(dòng)劑通過(guò)注射或者口服，對(duì)人類(lèi)血細(xì)胞中胚胎型珠蛋白的表達(dá)具有誘 導(dǎo)作用，因此，腎上腺素受體激動(dòng)劑可用于誘導(dǎo)人類(lèi)胚胎型珠蛋白的表達(dá)。所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑采用去氧腎上腺素、或異丙腎上腺素、或腎上腺素、或 去甲腎上腺素、或麻黃堿、或多巴胺、或間羥胺、或多巴酚丁胺。所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑采用去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素。將具有誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)作用的腎上腺素受體激動(dòng)劑用于治療珠蛋白 自身缺陷或表達(dá)水平發(fā)生缺陷的遺傳疾病，可以緩解如β型地中海貧血病或鐮刀型細(xì)胞 貧血病的貧血癥狀。所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑采用去氧腎上腺素、或異丙腎上腺素、或腎上腺素、或 去甲腎上腺素、或麻黃堿、或多巴胺、或間羥胺、或多巴酚丁胺。所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑采用去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素。實(shí)施例二
用去氧腎上腺素(phenyl印hrine，ΡΕ)和異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)作用于 腎上腺素α或β受體的刺激物處理成年斑馬魚(yú)，導(dǎo)致了斑馬魚(yú)胚胎型血紅蛋白在成年階 段的再表達(dá)。其表達(dá)方法和結(jié)果如下
la、將放入含有為50微摩爾濃度的去氧腎上腺素水體中飼養(yǎng)7天的成年斑馬魚(yú)作為去 氧腎上腺素處理組；將放入含有為50微摩爾濃度的異丙腎上腺素水體中飼養(yǎng)7天的成年斑 馬魚(yú)作為異丙腎上腺素處理組；在正常水體中同期飼養(yǎng)的成年斑馬魚(yú)作為對(duì)照組；
lb、用乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)和肝素作為抗凝劑， 分別采集去氧腎上腺素處理組、異丙腎上腺素處理組和對(duì)照組的斑馬魚(yú)血液；
lc、對(duì)各組斑馬魚(yú)血樣中血細(xì)胞中血紅蛋白mRNA含量均采用下列方法進(jìn)行檢測(cè)； Id、提取血液的總RNA樣本，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)對(duì)血液 樣本中的斑馬魚(yú)的成年型α血紅蛋白和胚胎型β血紅蛋白的mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)反
8應(yīng)中使用的擴(kuò)增引物分別為
斑馬魚(yú)成年型血紅蛋白mRNA (NCBI基因文庫(kù)序列號(hào)為NM_131257) 斑馬魚(yú)成年型α血紅蛋白的正向引物5' - TACCATGAGTCTCTCTGATA -3' 斑馬魚(yú)成年型α血紅蛋白的反向引物5' - TCAGCCCAATGAGAGAAATA -3' 斑馬魚(yú)胚胎型β血紅蛋白mRNA (NCBI基因文庫(kù)序列號(hào)為ΝΜ_001080093) 斑馬魚(yú)胚胎型β血紅蛋白的正向引物5' - CGAGAAGGCCACCATTCAAG -3' 斑馬魚(yú)胚胎型β血紅蛋白的反向引物；5' - CCCAGGATGGCAGCGGCATT -3' 檢測(cè)中以斑馬魚(yú)細(xì)胞骨架蛋白，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的mRNA作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)(NCBI 基因文庫(kù)序列號(hào)為NM_131031)
斑馬魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白的正向引物5，- cgagcaggagatgggaacc-3 斑馬魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白的反向引物5’ -caacggaaacgctcattgc-3’ le、熒光實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)對(duì)血液樣本中的斑馬魚(yú)的成年型α血紅蛋白和胚胎 型β血紅蛋白mRNA的定量檢測(cè)得到如下結(jié)果
如表3所示，經(jīng)去氧腎上腺素或異丙腎上腺素處理成年斑馬魚(yú)后，其血細(xì)胞樣品中胚 胎型β血紅蛋白mRNA較對(duì)照組明顯升高，而成年型α血紅蛋白mRNA則略有下降。
表3.熒光實(shí)時(shí)多聚酶鏈反應(yīng)對(duì)斑馬魚(yú)血細(xì)胞中血紅蛋白的mRNA表達(dá)水平的檢 測(cè)結(jié)果
實(shí)施例三
分別采用去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素體外誘導(dǎo)人類(lèi)血細(xì)胞系K562中的胚胎型珠 蛋白mRNA的表達(dá)。其表達(dá)方法和結(jié)果如下
2a、人類(lèi)血細(xì)胞系K562放入培養(yǎng)液中，在溫度為37°C、濕度為95%、CO2濃度為5%的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、青霉素100單位/升、鏈霉素100毫克/升的RPM I 1640培養(yǎng)基；
2b、在培養(yǎng)箱中取K562細(xì)胞，用培養(yǎng)液將K562細(xì)胞密度調(diào)為IO5個(gè)細(xì)胞/毫升K562 細(xì)胞液；
2c、取20毫升K562細(xì)胞液，加入去氧腎上腺素，使去氧腎上腺素終濃度至5微摩爾，培養(yǎng)4天后的細(xì)胞培養(yǎng)物作為去氧腎上腺素處理組；取20毫升K562細(xì)胞液，加入異丙腎上腺 素，使異丙腎上腺素終濃度至5微摩爾，培養(yǎng)4天的細(xì)胞培養(yǎng)物作為異丙腎上腺素處理組； 取20毫升K562細(xì)胞液，培養(yǎng)4天的細(xì)胞培養(yǎng)物作為對(duì)照組； 2d、分別取三個(gè)組的細(xì)胞培養(yǎng)物5毫升；
2e、對(duì)各組細(xì)胞培養(yǎng)物中的珠蛋白mRNA含量均采用下列方法進(jìn)行檢測(cè)； 2f、在細(xì)胞培養(yǎng)物中提取總RNA，取5微克總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量 多聚酶鏈反應(yīng)對(duì)K562細(xì)胞培養(yǎng)物樣本中的成年型β珠蛋白和胚胎型珠蛋白的mRNA進(jìn)行 定量檢測(cè)，檢測(cè)反應(yīng)中使用的擴(kuò)增引物分別為
人類(lèi)胚胎型珠蛋白mRNA (NCBI基因文庫(kù)序列號(hào)為NM_000559. 2) 人類(lèi)胚胎型珠蛋白的正向引物5' -AATGTGGAAGATGCTGGAGGAGAA -3' 人類(lèi)胚胎型珠蛋白的反向引物5' -CTTCTTGCCATGTGCCTTGACTT -3' 人類(lèi)成年型β-珠蛋白mRNA (NCBI基因文庫(kù)序列號(hào)為NM_00518. 4) 人類(lèi)成年型β-珠蛋白的正向引物5' -CCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTAC -3' 人類(lèi)成年型β -珠蛋白的反向引物；5 ‘ -TAGACCACCAGCAGCCTGCC -3 ‘ 檢測(cè)中以人類(lèi)細(xì)胞骨架蛋白，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的mRNA作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)(NCBI基 因文庫(kù)序列號(hào)為NM_001101.3)
人類(lèi)β -肌動(dòng)蛋白的正向引物5 ‘ -AAGAGCTACGAGCTACCTGAC -3 ‘ 人類(lèi)β -肌動(dòng)蛋白的反向引物5 ‘ -ATGCCACAGGACTCCATGCC -3 ‘ 2g、熒光實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)對(duì)Κ562細(xì)胞樣本中的人類(lèi)胚胎型珠蛋白mRNA和成年 型β -珠蛋白mRNA的定量檢測(cè)得到如下結(jié)果
如表4所示，經(jīng)去氧腎上腺素或異丙腎上腺素處理K562細(xì)胞后，細(xì)胞中的人類(lèi)胚胎型 珠蛋白mRNA較對(duì)照組明顯升高，而成年型β珠蛋白mRNA則略有下降。
表4.熒光實(shí)時(shí)多聚酶鏈反應(yīng)對(duì)人類(lèi)血細(xì)胞系K562培養(yǎng)物中珠蛋白mRNA表達(dá)水 平的檢測(cè)結(jié)果
上述結(jié)果表明，去氧腎上腺素或異丙腎上腺素具有對(duì)成年斑馬魚(yú)的胚胎型血紅蛋白在 成年階段再表達(dá)的誘導(dǎo)作用；去氧腎上腺素或異丙腎上腺素體外處理人類(lèi)血細(xì)胞系K562， 可以誘導(dǎo)人類(lèi)胚胎型珠蛋白mRNA的表達(dá)。因而去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素可用于治 療由人類(lèi)β-珠蛋白自身缺陷或表達(dá)水平發(fā)生缺陷的遺傳疾病，如β型地中海貧血病或鐮刀型細(xì)胞貧血病的患者進(jìn)行其胚胎型珠蛋白的誘導(dǎo)，以緩解貧血病人的貧血癥狀。
綜上研究結(jié)果，說(shuō)明斑馬魚(yú)或人體血細(xì)胞通過(guò)接觸腎上腺素α或β受體激動(dòng)劑 的去氧腎上腺素或異丙腎上腺素，可以誘導(dǎo)處理后的斑馬魚(yú)或人類(lèi)血液細(xì)胞中的胚胎型血 紅蛋白的表達(dá)，因此，去氧腎上腺素或異丙腎上腺素通過(guò)注射和口服，導(dǎo)致的對(duì)人類(lèi)血細(xì)胞 中的胚胎型珠蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)作用，可以用以對(duì)由于β _珠蛋白自身缺陷或表達(dá)水平發(fā)生 缺陷的遺傳疾病，如β型地中海貧血病或鐮刀型細(xì)胞貧血病的患者進(jìn)行其胚胎型血紅蛋 白的誘導(dǎo)，以緩解貧血癥狀。
權(quán)利要求
腎上腺素受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)，其特征在于，腎上腺素受體激動(dòng)劑用于誘導(dǎo)人類(lèi)胚胎型珠蛋白的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)，其特征在于， 所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑采用去氧腎上腺素、或異丙腎上腺素、或腎上腺素、或去甲腎上 腺素、或麻黃堿、或多巴胺、或間羥胺、或多巴酚丁胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)，其特征在于， 所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑采用去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素。
4.權(quán)利要求1所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)的用途，其特征在 于，腎上腺素受體激動(dòng)劑用于治療人類(lèi)β型地中海貧血病或鐮刀型細(xì)胞貧血病。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)的用途，其特征 在于，所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑采用去氧腎上腺素、或異丙腎上腺素、或腎上腺素、或去 甲腎上腺素、或麻黃堿、或多巴胺、或間羥胺、或多巴酚丁胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白表達(dá)的用途，其特征 在于，所述的腎上腺素受體激動(dòng)劑采用去氧腎上腺素或者異丙腎上腺素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了腎上腺素受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白的表達(dá)及其用途，涉及化合物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其涉及腎上腺素受體激動(dòng)劑在治療貧血病中的應(yīng)用。本發(fā)明將腎上腺素受體激動(dòng)劑用于誘導(dǎo)胚胎型珠蛋白的表達(dá)，因而這些物質(zhì)可用于治療β-珠蛋白自身缺陷或表達(dá)水平發(fā)生缺陷的遺傳疾病，如對(duì)β型地中海貧血病或鐮刀型細(xì)胞貧血病的患者進(jìn)行其胚胎型珠蛋白的誘導(dǎo)，以緩解貧血病人的貧血癥狀。
文檔編號(hào)A61P7/06GK101926998SQ20101027774
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者尹乃達(dá), 梅蕓, 殷戰(zhàn), 賀江燕 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所