專利名稱：抗氧化活性真菌提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品和保健品、生物制藥和酶工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)是利用木瓜蛋白 酶、中性蛋白酶、果膠酶等三種不同的酶生產(chǎn)真菌高抗氧化活性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代研究表明，人體內(nèi)的自由基被認(rèn)為是引起生物細(xì)胞氧化性損傷，進(jìn)而引起 腫瘤、衰老、心腦血管疾病等多種疾病的重要因素之一，在人體內(nèi)的自由基中，主要是 超氧陰離子自由基和羥自由基等氧自由基，超氧陰離子自由基是在生命活動(dòng)的代謝過(guò)程 中產(chǎn)生的一種重要的自由基，具有很強(qiáng)的氧化能力，羥自由基是最活潑的自由基，也是 毒性最大的自由基，它們可以與活細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng)造成損害，且反應(yīng)速度極 快，被破壞的分子遍及糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂、磷脂、核苷和DNA等，因此，研究 和開(kāi)發(fā)抗氧化劑對(duì)延緩衰老、防治疾病和開(kāi)發(fā)食品與保健品等具有重大意義。研究表明，高等真菌細(xì)胞內(nèi)含有抗氧化物質(zhì)，并可通過(guò)熱水、乙醇、乙酸乙酯 等溶劑提取，但是，由于真菌細(xì)胞壁的存在，限制了胞內(nèi)物質(zhì)的提取效果。近年來(lái)，隨 著酶工程的發(fā)展，研究者將酶解技術(shù)用于真菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的提取，因?yàn)槊缚梢越到饧?xì)胞 壁，消除了其機(jī)械阻礙，利于胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，從而明顯提高提取效果。盡管利用酶法降解真菌細(xì)胞壁可顯著提高胞內(nèi)物質(zhì)的提取產(chǎn)量，但是，酶法生 產(chǎn)的真菌胞內(nèi)提取物的抗氧化生物活性如何目前尚沒(méi)有報(bào)道。我們對(duì)多種酶類的比較研 究表明，與熱水提取法相比，不同酶類不僅對(duì)真菌菌絲體胞內(nèi)物質(zhì)的提取率有顯著的影 響，而且，對(duì)提取物的抗氧化活性也有顯著的影響，深入研究表明，提取物中的抗氧化 活性物質(zhì)主要是醇不溶提取物，而且，有些酶盡管使醇不溶提取物產(chǎn)量顯著提高，但同 時(shí)卻導(dǎo)致獲得的醇不溶提取物的抗氧化活性也顯著降低，這顯然不利于利用酶法生產(chǎn)高 抗氧化活性醇不溶提取物，更會(huì)導(dǎo)致酶法制備的醇不溶提取物的藥效降低，嚴(yán)重影響對(duì) 疾病的治療，用于保健品的開(kāi)發(fā)時(shí)也會(huì)顯著降低其抗氧化、延緩衰老、提高健康水平等 保健作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗氧化活性 真菌提取物的制備方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是一種抗氧化活性真菌提取物的制 備方法。其包括如下步驟(1)按(干重比)的比例向菌絲體中加入木瓜蛋白酶、或中性蛋白酶、或果 膠酶；(2)以重量比1 10的比例加入蒸餾水，勻漿；(3)在pH4.5-7.5和溫度45_50°C下酶解2小時(shí)；(4)酶解結(jié)束后，將酶解混合液加熱升溫到100°C滅活酶，并維持2小時(shí)以便釋放提取其胞內(nèi)物質(zhì)；(5)將提取液于5000轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘，收集上清液；(6)在50°C溫度下，減壓濃縮上清液至原體積的1/4。(7)向濃縮液中加入3倍體積的食用乙醇，于4°C下沉淀24小時(shí)；(8) 5000轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘，收集沉淀。(9)將沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后，即獲得抗氧化活性的醇不溶提取物凍干粉末。本發(fā)明方法與熱水提取法制備真菌醇不溶提取物相比，不僅一定程度上提高了 醇不溶提取物的產(chǎn)量，而且更重要的是顯著提高了醇不溶提取物的抗氧化活性，經(jīng)本發(fā) 明可使不同種類的真菌的菌絲體醇不溶提取物產(chǎn)量提高10.0-74.1%，總抗氧化活性提高 9.8-78.4%,超氧陰離子自由基清除活性提高48.5-192.2% ；與熱水提取法相比，本發(fā)明 方法也顯著減少了操作時(shí)間和降低了能量消耗。本發(fā)明是一種簡(jiǎn)便、高產(chǎn)、低耗制備高 抗氧化活性真菌醇不溶提取物的方法。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1一種木瓜蛋白酶高產(chǎn)制備高抗氧化活性菌絲體醇不溶提取物的方法，其首先向 1000克發(fā)酵菌絲體中，按重量比的比例加入木瓜蛋白酶10克，并以重量比1 10 的比例加入蒸餾水后，勻漿，在50°C溫度和PH7.0下進(jìn)行酶解2h;酶解結(jié)束后，將酶解 混合液加熱升溫到100°C滅活酶，并維持2小時(shí)提取其胞內(nèi)物質(zhì)，將提取液在5000rpm 離心20min，收集上清液，向上清液中加3倍體積的食用乙醇后于4°C下沉淀24小時(shí)， 5000rpm離心20min，收集沉淀，即為醇不溶提取物，將醇不溶提取物經(jīng)真空冷凍干燥 后，即獲得抗氧化活性的醇不溶提取物凍干粉末。經(jīng)測(cè)定本發(fā)明制備的醇不溶提取物 產(chǎn)量為9.73克，比對(duì)照熱水法產(chǎn)量提高74.1%，經(jīng)試劑盒法測(cè)定，醇不溶提取物的總抗 氧化活性比對(duì)照熱水法提高了 20.0%，超氧陰離子自由基清除活性比對(duì)照熱水法提高了 192.2%。實(shí)施例2一種中性蛋白酶高產(chǎn)制備高抗氧化活性菌絲體醇不溶提取物的方法，其首先向1000克發(fā)酵菌絲體中，按重量比的比例加入中性蛋白酶10克，并以重量比1 10 的比例加入蒸餾水后，勻漿，在45°C溫度和PH7.5下進(jìn)行酶解2h;酶解結(jié)束后，將酶解 混合液加熱升溫到100°C滅活酶，并維持2小時(shí)提取其胞內(nèi)物質(zhì)，將提取液在5000rpm 離心20min，收集上清液，向上清液中加3倍體積的食用乙醇后于4°C下沉淀24小時(shí)， 5000rpm離心20min，收集沉淀，即為醇不溶提取物，將醇不溶提取物經(jīng)真空冷凍干燥 后，即獲得抗氧化活性的醇不溶提取物凍干粉末。經(jīng)測(cè)定本發(fā)明制備的醇不溶提取物 產(chǎn)量為8.75克，比對(duì)照熱水法產(chǎn)量提高56.5%，經(jīng)試劑盒法測(cè)定，醇不溶提取物的總抗 氧化活性比對(duì)照熱水法提高了 9.8%，超氧陰離子自由基清除活性比對(duì)照熱水法提高了 48.5%。實(shí)施例3一種果膠酶高產(chǎn)制備高抗氧化活性菌絲體醇不溶提取物的方法，其首先向1000克發(fā)酵菌絲體中， 按重量比的比例加入果膠酶10克，并以重量比1 10的比例加入 蒸餾水后，勻漿，在45°c溫度和PH4.5下進(jìn)行酶解2h;酶解結(jié)束后，將酶解混合液加熱 升溫到100°C滅活酶，并維持2小時(shí)提取其胞內(nèi)物質(zhì)，將提取液在5000rpm離心20min， 收集上清液，向上清液中加3倍體積的食用乙醇后于4°C下沉淀24小時(shí)，5000rpm離心 20min,收集沉淀，即為醇不溶提取物，將醇不溶提取物經(jīng)真空冷凍干燥后，即獲得抗氧 化活性的醇不溶提取物凍干粉末。經(jīng)測(cè)定本發(fā)明制備的醇不溶提取物產(chǎn)量為6.15克，比 對(duì)照熱水法產(chǎn)量提高10.0%，經(jīng)試劑盒法測(cè)定，醇不溶提取物的總抗氧化活性比對(duì)照熱 水法提高了 78.4%，超氧陰離子自由基清除活性比對(duì)照熱水法提高了 77.4%。
權(quán)利要求
1.抗氧化活性真菌提取物的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)按(干重比)的比例向菌絲體中加入木瓜蛋白酶、或中性蛋白酶、或果膠酶；(2)以重量比1 10的比例加入蒸餾水勻漿；(3)在pH4.5-7.5和溫度45-50°C下酶解2小時(shí);(4)酶解結(jié)束后，將酶解混合液加熱升溫到100°C滅活酶，并維持2小時(shí)以便釋放提 取其胞內(nèi)物質(zhì)；(5)將提取液于5000轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘，收集上清液；(6)在50°C溫度下，減壓濃縮上清液至原體積的1/4。(7)向濃縮液中加入3倍體積的食用乙醇，于4°C下沉淀24小時(shí)；(8)5000轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘，收集沉淀。(9)將沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后，即獲得具有抗氧化活性的醇不溶提取物凍干粉末。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗氧化活性真菌提取物的制備方法，其按1％的重量比向菌絲體中加入木瓜蛋白酶、或中性蛋白酶、或果膠酶，并以重量比1∶10的比例加入蒸餾水勻漿，在45-50℃和pH4.5-7.5下酶解2小時(shí)后，將酶解混合液直接放入100℃水浴中提取2小時(shí)，離心收集上清液，上清液經(jīng)濃縮后加入3倍體積的食用乙醇于4℃下沉淀24小時(shí)，離心收集沉淀，將沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后，即獲得具有抗氧化活性的醇不溶提取物凍干粉末。本發(fā)明與熱水提取法相比，可使真菌菌絲體醇不溶提取物產(chǎn)量提高10.0-74.1％，提取物總抗氧化活性提高9.8-78.4％，超氧陰離子自由基清除活性提高48.5-192.2％，并且也顯著減少了操作時(shí)間和降低了能量消耗。本發(fā)明是一種簡(jiǎn)便、高產(chǎn)、低耗制備高抗氧化活性真菌醇不溶提取物的方法。
文檔編號(hào)A61K36/06GK102008068SQ20101028787
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者曹立新, 閆培生, 馬麗雅, 高秀君 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)