專利名稱：聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葡激酶來源于金黃色葡萄球菌，由136個(gè)氨基酸組成不含二硫鍵的單鏈，分子量約為15KD(Eur. J. Biochem. 1985,149 :557-561)。與其他溶栓劑相比，葡激酶具有良好的溶栓特異性，不引起纖維蛋白原和α-抗纖溶酶水平的降低，不易誘發(fā)全身性溶血，對(duì)富含血小板的動(dòng)脈血栓具有較強(qiáng)的溶栓能力。由于葡激酶具有上述優(yōu)良的溶纖性能，成為人們研究和開發(fā)的重點(diǎn)。目前葡激酶基因已經(jīng)分別被克隆到hcherichia coli, Bacillus subtilis，和 Mi^ptococcus sanguis 中并實(shí)現(xiàn)了表達(dá)(MGG，1987，210 :528-534) 葡激酶(Mk)是一種非酶類蛋白，本身無酶活性，而是一種輔助因子，它的活化石通過與纖溶酶原結(jié)合后能使纖溶酶原(Plg)以1 1的比例結(jié)合形成復(fù)合物，但此復(fù)合物依然沒有活性，而需要通過一系列的變化形成具有活化Plg的活性復(fù)合物。研究表明，在 Sak和pig形成復(fù)合物后，Sak的氨基端會(huì)去掉10個(gè)或6個(gè)氨基酸，形成低分子量Mk-plg 復(fù)合物，同時(shí)復(fù)合物上的Plg轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，形成具有高度活性的復(fù)合物，進(jìn)而激活更多的纖溶酶原，從而產(chǎn)生溶栓作用(Curr. Opin. Biotechnol,1994,5 ) :180-186)。血循環(huán)中的纖溶酶可因α-抗纖溶酶作用于賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)和活性中心而迅速失活。當(dāng)循環(huán)血中存在血栓凝塊時(shí)，由于纖溶酶上賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)和活性中心均被親和力較高的血纖維蛋白占據(jù)，α -抗纖溶酶僅能使之緩慢失活，這時(shí)候纖溶酶就能發(fā)揮其溶栓作用。對(duì)葡激酶進(jìn)行聚乙二醇(PEG)修飾可使其獲得更好的物理和熱穩(wěn)定性、更強(qiáng)的抗蛋白水解和酶解能力、更好的溶解性、更低的清除率以及更好的藥效等。目前國內(nèi)外已經(jīng)有很多相關(guān)的研究，主要是把葡激酶的一些賴氨酸位點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼?，然后用修飾巰基的聚乙二醇修飾劑來修飾，或者直接用非特異性的修飾劑來修飾。這些方法修飾后得到的偶聯(lián)物的最大的一個(gè)缺點(diǎn)是，偶聯(lián)的聚乙二醇大分子阻礙了葡激酶與纖溶酶的結(jié)合，使得偶聯(lián)物的生物活性相對(duì)于原蛋白有很大的下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中PEG修飾葡激酶造成其生物活性降低的問題而完成的。本發(fā)明的目的是提供一種聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物是葡激酶N端連接有聚乙二醇共價(jià)偶聯(lián)物，其中，通過聚乙二醇修飾劑將聚乙二醇共價(jià)連接到葡激酶的N 端，所述的聚乙二醇修飾劑優(yōu)選為單甲氧基聚乙二醇醛類修飾劑，其分子量?jī)?yōu)選為1000 40000，包括線型和分支型兩種結(jié)構(gòu)，所述的葡激酶優(yōu)選為重組型的人葡激酶。本發(fā)明的再一目的是提供上述的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的是提供上述聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的制備方法，所述方法包括使用聚乙二醇修飾劑共價(jià)修飾葡激酶N末端的步驟，其中，所述的聚乙二醇修飾劑優(yōu)選為單甲氧基聚乙二醇醛類修飾劑，其分子量?jī)?yōu)選為1000 40000，包括線型和分支型兩種結(jié)構(gòu)，按摩爾比，葡激酶修飾劑為1 2-10，修飾劑還原劑為1 10-50，進(jìn)行反應(yīng)，所述的葡激酶優(yōu)選為重組型的人葡激酶。具體的本發(fā)明的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的制備方法包括以下步驟1)將葡激酶用10-50mM pH4_6的乙酸鈉緩沖液溶解，配制成為0. 1-lOmg/mL的溶液；2)按照摩爾比，葡激酶修飾劑為1 2-10，修飾劑還原劑為1 10-50，在 40C _37°C下進(jìn)行反應(yīng)0. 5-24小時(shí)；3)加入IM甘氨酸終止反應(yīng)；4)以Superdex 200對(duì)步驟3得到的修飾混合物進(jìn)行純化，收集聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物，其中，洗脫液為0. 05-0. 2mol/L磷酸緩沖液(含0. 15M NaCL)，pH6_8。本發(fā)明提供的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物是利用特異性的PEG醛修飾劑，它能夠特異性的共價(jià)修飾葡激酶的N端，由于葡激酶的溶栓作用有其特殊的作用機(jī)制，當(dāng)Sak和pig 形成復(fù)合物后，Sak的氨基端去掉10個(gè)或6個(gè)氨基酸，從而才能夠形成具有高活性的復(fù)合物，此時(shí)特異性連接在Sak氨基端的PEG醛修飾劑也會(huì)隨之被切除掉，不會(huì)防礙此復(fù)合物進(jìn)一步發(fā)揮溶栓作用，影響其生物活性。目前還沒有利用PEG醛類修飾劑對(duì)葡激酶進(jìn)行修飾的報(bào)道。因此，本法明的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物既能夠大幅度的提高其體內(nèi)的半衰期，同時(shí)，還能夠完全保留原蛋白的生物活性，在治療心腦血管疾病藥物的制備中能夠發(fā)揮巨大的應(yīng)用潛力。


圖1-1、圖1-2、圖1-3聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的凝膠過濾檢測(cè)譜圖。圖2-1、圖2-2、圖2-3聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物與纖溶酶作用后的凝膠過濾檢測(cè)譜圖；圖3原蛋白和聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的生物活性比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、聚乙二醇O0000)-葡激酶偶聯(lián)物的制備將重組人葡激酶用50mM pH5. 0的乙酸鈉緩沖液溶解，配制成為lmg/mL的溶液，按葡激酶PEG醛(分子量20000)還原劑(氰基硼氫化鈉)為1 4 40的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，在4°C下反應(yīng)12小時(shí)，加入IM甘氨酸終止反應(yīng).用Superdex 200對(duì)得到的修飾混合物進(jìn)行純化，收集PEG-葡激酶偶聯(lián)物，洗脫液為0. 05mol/L磷酸緩沖液(含0. 15M NaCL)， ρΗ7· 0。實(shí)施例2、聚乙二醇(5000)-葡激酶偶聯(lián)物的制備將重組人葡激酶用50mM pH5. 0的乙酸鈉緩沖液溶解，配制成為lmg/mL的溶液，按葡激酶PEG醛(分子量5000)還原劑(氰基硼氫化鈉)為1 2 20的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，在4°C下反應(yīng)12小時(shí)，加入IM甘氨酸終止反應(yīng).用Superdex 200對(duì)得到的修飾混合物進(jìn)行純化，收集PEG-葡激酶偶聯(lián)物，洗脫液為0. 05mol/L磷酸緩沖液(含0. 15M NaCL)，ρΗ7· 0。實(shí)施例3、聚乙二醇G0000)-葡激酶偶聯(lián)物的制備將重組人葡激酶用50mM pH5. 0的乙酸鈉緩沖液溶解，配制成為lmg/mL的溶液，按葡激酶PEG醛(分子量40000)還原劑(氰基硼氫化鈉)為1 6 60的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，在4°C下反應(yīng)12小時(shí)，加入IM甘氨酸終止反應(yīng).用Superdex 200對(duì)得到的修飾混合物進(jìn)行純化，收集PEG-葡激酶偶聯(lián)物，洗脫液為0. 05mol/L磷酸緩沖液(含0. 15M NaCL)， ρΗ7· 0。實(shí)施例4、聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的純度檢測(cè)用 Hiload Superdex75 16/30prep grade Superdex200 16/30 prep grade 疑膠過濾預(yù)裝柱在AKTA purifier蛋白純化儀上進(jìn)行偶聯(lián)物純度檢測(cè)，流動(dòng)相為50mM磷酸和0. IM Na2SO4, ρΗ7· 0，平衡1個(gè)柱體積以上，上樣體積IOOuL,流速0. 5mL/min,紫外檢測(cè) 280nm。結(jié)果如圖1_1 圖1_3，可見三種偶聯(lián)物的純度均大于95%實(shí)施例5、纖溶酶對(duì)聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的作用首先把上述制備的三種純化的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物溶解于PBS緩沖液中，按照偶聯(lián)物纖溶酶為25 1的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)。在37°C下反應(yīng)12小時(shí)，以Superdex 200 對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，緩沖液為0. 05mol/L磷酸緩沖液(含0. 15M NaCL)，pH7. 0。結(jié)果如圖2-1 2-3所示，說明三種聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物均被切除掉聚乙二醇鏈。實(shí)施例6、葡激酶，聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將上述純化的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物及葡激酶通過腹腔注射給大鼠，分別于注射后20分鐘、40分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、24小時(shí)、25小時(shí)、26小時(shí)取血， 每次取200uL，加入抗凝劑20uL抗凝，1500r/min離心，15min,分離血漿，于_20°C儲(chǔ)存待測(cè)。 取樣結(jié)束后通過溶圈法分別檢測(cè)葡激酶生物活性。檢測(cè)結(jié)果表明聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的清除半衰期比葡激酶蛋白分別提高了 20倍，12倍，3倍。實(shí)施例7、葡激酶原蛋白和聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的生物活性比較1)稱取IOOmg重組人纖維蛋白原，溶于25mL的Tris-HCl溶液中；2)稱取250mg的瓊脂糖，加入到25mL的Tris-HCl溶液中，濃度為1 % (W/V)，于 60°C的水浴中加熱溶解；3)將溶解的瓊脂糖在室溫下冷卻，至約45°C ；4)取20 μ L的凝血酶溶液，加入到25mL新鮮配置的重組人纖維蛋白原溶液中，迅速混勻；5)將凝血酶/重組人纖維蛋白原溶液迅速加入到瓊脂糖溶液中，混勻，倒入2個(gè)平板中，室溫放置30min，待瓊脂糖凝固后，打孔；6)用1Tris-HCl分別將尿激酶稀釋成濃度為1，5，10，20，40，80IU/mL，每孔加樣 15 μ L，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線；7)用Bradford法分別測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度，作2倍系列稀釋，分別加入到瓊脂孔中，每孔加樣15yL ；8)將平板于37°C下倒置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至有清晰的溶圈出現(xiàn)，用游標(biāo)卡尺測(cè)定各溶圈直徑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白的活性。
活性測(cè)定結(jié)果如圖3所示，說明3種聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物生物活性與葡激酶原蛋白的生物活性均相同。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物，其特征在于，所述偶聯(lián)物是葡激酶N端連接有聚乙二醇共價(jià)偶聯(lián)物，其中，通過聚乙二醇修飾劑將聚乙二醇共價(jià)連接到葡激酶的N端，所述的聚乙二醇修飾劑是單甲氧基聚乙二醇醛類修飾劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物，其特征在于，所述的單甲氧基聚乙二醇醛類修飾劑，其分子量為1000 40000，包括線型和分支型兩種結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物，其特征在于，所述的葡激酶是重組型的人葡激酶。
4.權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物用于制備治療心腦血管疾病的藥物的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，所述方法包括使用聚乙二醇修飾劑共價(jià)修飾葡激酶N末端的步驟，其中，所述的聚乙二醇修飾劑為單甲氧基聚乙二醇醛類修飾劑；按摩爾比，葡激酶修飾劑為1 2-10，修飾劑還原劑為 1 10-50。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的單甲氧基聚乙二醇醛類修飾劑的分子量為1000 40000，包括線型和分支型兩種結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的葡激酶是重組型的人葡激酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用。所述偶聯(lián)物是葡激酶N端連接有聚乙二醇共價(jià)偶聯(lián)物，其中，通過聚乙二醇修飾劑將聚乙二醇共價(jià)連接到葡激酶的N端，所述的聚乙二醇修飾劑優(yōu)選為單甲氧基聚乙二醇醛類修飾劑，其分子量?jī)?yōu)選為1000～40000，包括線型和分支型兩種結(jié)構(gòu)。本法明的聚乙二醇-葡激酶偶聯(lián)物既能夠大幅度的提高其體內(nèi)的半衰期，同時(shí)，還能夠完全保留原蛋白的生物活性，在治療心腦血管疾病藥物的制備中能夠發(fā)揮巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)A61P7/02GK102451471SQ20101051455
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者劉永東, 王俊, 胡濤, 蘇志國, 馬光輝 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院過程工程研究所