專利名稱：：具有苯磺酸衍生物內水相的脂質體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種具有苯磺酸衍生物鹽內水相的脂質體及其制備方法，及其在制備用于治療腫瘤疾病的藥物中的用途。
背景技術：
：脂質體作為藥物載體，具有提高藥物療效、減輕藥物不良反應及靶向、緩釋等特點，尤其是作為抗腫瘤藥物的載體時可以使藥物靶向腫瘤區(qū)而起到減毒、增效作用。目前臨床上應用的抗腫瘤藥物眾多，大致可分為細胞毒類、激素類、生物反應調節(jié)劑、單克隆抗體以及其他抗腫瘤藥物這五類。其中細胞毒類藥物占市場份額最大，其按照作用機制可以分為以下五類⑴作用于DNA化學結構的藥物，如燒化劑和鉬類；(2)影響核酸合成的藥物，如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶等；(3)作用于核酸轉錄的藥物，如阿霉素、表阿霉素等；(4)作用于微管蛋白合成的藥物，如紫杉類、長春堿類；作用于拓撲異構酶的藥物，如喜樹堿類；(其他細胞毒藥。其中第二、四類藥物具有細胞周期特異性，它們只對惡性腫瘤細胞增殖周期的某一間期細胞有殺滅作用，本發(fā)明重點研究的長春瑞濱和拓撲替康即為此類藥物。將細胞周期特異性抗腫瘤藥物制備成脂質體，從而達到減毒增效的作用，需要控制脂質體中藥物的釋放速度。若藥物從脂質體中釋放過快則會導致如下結果(1)一部分藥物在到達瘤區(qū)之前即從脂質體中釋放出來，接著在血液中被快速清除，而不能進入腫瘤區(qū)；(2)由于同一時間腫瘤細胞所處的生長周期各不相同，因此即使進入瘤區(qū)的藥物也無法對處于非特定周期的腫瘤細胞產生殺傷作用，這樣藥物對腫瘤細胞的暴露大大減少，不利于藥效的發(fā)揮，反而引起對正常組織細胞的毒性反應。所以，對于細胞周期特異性藥物來說，控制藥物從脂質體中的釋放就顯得尤為重要。脂質體藥物的釋放受到多種因素的影響，包括粒度、脂膜組成、內水相以及載藥方法等。脂質體的載藥方法分為主動載藥和被動載藥兩種，脂溶性藥物一般選擇被動載藥技術，水溶性藥物采用主動載藥技術。由于長春瑞濱和拓撲替康均為水溶性弱堿性藥物，所以選擇主動載藥技術來制備脂質體。目前常用的主動載藥技術主要有三種，PH值梯度法、硫酸銨梯度法以及絡合梯度法(1)ρΗ值梯度法該方法在19世紀80年代由加拿大學者發(fā)明，他們通過實驗發(fā)現(xiàn)阿霉素等生物堿類藥物由于PH值梯度的存在，可以實現(xiàn)主動轉運，特異性的向脂質體內聚集。其制備過程為首先根據藥物的性質選擇內水相緩沖液和外相緩沖液，這一步驟非常關鍵，因為它直接決定了藥物在儲存期內的穩(wěn)定性和藥物在體內的釋放行為。然后使用內水相緩沖液水化制備空白脂質體，將制得的空白脂質體經過進一步處理使其粒度降低到所需的范圍后，則可以使用交叉流透析、柱層析以及PH值調整等手段置換脂質體的外相，造成磷脂膜內外的pH梯度。形成跨膜梯度后，可以在適宜的溫度完成藥物的裝載。也可以使用離子載體制造跨膜pH梯度。在制備空白脂質體的過程中，將2價離子鹽，如硫酸錳包封在脂質體中，之后用含有離子載體如A23187和EDTA的緩沖液置換脂質體的外相。離子載體可以特異性的向膜外轉運2價離子，同時將H+轉移到脂質體內部。使用上述方法，同樣可以制造膜內外的PH值梯度。對于pH梯度法載藥的機理，已經進行了較系統(tǒng)的研究。目前上市的3個蒽環(huán)類抗生素脂質體制劑中，有2個產品使用了pH值梯度法載藥技術。(2)硫酸銨梯度法硫酸銨梯度法在20世紀90年代初期由以色列學者發(fā)明。該方法的制備過程和傳統(tǒng)的PH值梯度法有相似之處。首先使用硫酸銨緩沖液制備空白脂質體，之后采用交叉流透析等手段除去脂質體外相的硫酸銨，造成脂膜內外的硫酸銨梯度，然后在加熱的條件下完成藥物的裝載。起初的研究表明，硫酸銨梯度法之所以能夠實現(xiàn)藥物的裝載，可能和游離的氨跨膜擴散，造成磷脂膜內外的PH值的差異有關。但是嚴謹的理論推導表明，使用硫酸銨梯度法完成藥物的裝載，可能是一個比較復雜的雙向擴散的過程，PH值梯度的形成可能只是其中的一個影響因素。硫酸銨梯度法的優(yōu)勢在于制備空白脂質體的過程中，接近中性的硫酸銨水溶液不會引起過多的磷脂分子水解。因為如果使用飽和磷脂制備脂質體，需要在較高的溫度下完成。使用傳統(tǒng)的PH值梯度法，可能使得磷脂更容易發(fā)生水解。此外，使用硫酸銨梯度法制備的脂質體，其在體內釋放藥物的行為可能也有所不同。(3)絡合梯度法該方法使用過渡態(tài)金屬離子的鹽，如硫酸銅、硫酸鎳作為內水相緩沖液制備空白脂質體，之后采用交叉流透析等手段除去脂質體外相的金屬離子，造成脂膜內外的金屬離子梯度，然后在加熱的條件下完成藥物的裝載。其載藥原理為藥物在脂質體內水相中與過渡態(tài)金屬離子結合生成穩(wěn)定的絡合物從而滯留在脂質體中。長春瑞濱和拓撲替康作為抗腫瘤領域的一線藥物，其脂質體制劑的研究一直是國際上的熱點，目前已經有許多國家的研究小組對長春瑞濱和拓撲替康脂質體的載藥技術進行了多種研究，但大都存在一些問題，下面詳述。加拿大的hex公司使用鞘磷脂和膽固醇以摩爾比5545作為脂膜，以硫酸鎂溶液為內水相制備空白脂質體，然后利用離子載體A23187向膜外轉運鎂離子，同時將H+轉移到脂質體內部，形成PH梯度，從而實現(xiàn)藥物的裝載。用該方法制備得到的長春瑞濱脂質體包封率大于90%，2-8°C條件下可穩(wěn)定儲存一年。(Optimizationandcharacterizationofasphingomyelin/cholesterolliposomeformulationofvinorelbinewithpromisingantitumoractivity.Journalofpharmaceuticalsciences,2005Vol.94No.5.)加拿大哥倫比亞大學的IgorVjhigaltsev等人同樣以鞘磷脂和膽固醇以摩爾比5545作為磷脂雙層制備大單室脂質體，使用苯磺酸和羥基苯磺酸的鈉鹽、鈣鹽作為內向，同樣采用離子載體A23187創(chuàng)造脂質體內外pH梯度，再進行長春瑞濱裝載。用該方法制備得到的長春瑞濱脂質體包封率為90-99%。體外釋放實驗顯示與硫酸鎂為內相的長春瑞濱脂質體比，羥基苯磺酸內相能夠顯著延長藥物的滯留時間；小鼠藥代動力學實驗同樣顯示羥基苯磺酸內相的半衰期顯著長于硫酸鎂內相的處方。(!formationofdrug-arylsulfonatecomplexesinsideliposomes:Anovelapproachtoimprovedrugretention.JournalofControlledRelease2006,Vol110)。但該方法也存在很多缺陷1.該方法工藝復雜不利于放大，處方中使用的A23187必須除去，否則在體內將會將血鈣與藥物反轉加速藥物釋放，并且A23187本身具有一定毒性；2.該方法使用羥基苯磺酸的鈣鹽作為內相，為了避免鈣鹽出現(xiàn)沉淀，內相PH值需要調節(jié)到3.5-4.0，普通磷脂在此環(huán)境下很快水解，因此只能使用價格昂貴的鞘磷脂；3.由于羥基苯磺酸與藥物作用不夠強，長春堿類藥物與普通的長循環(huán)材料有作用從而導致藥物裝載不穩(wěn)定，因此必須使用價格昂貴的PEG-CerC14ο美國的研究者使用雙硬脂酸卵磷脂(DSPC)、膽固醇和甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-mPEG)作為脂膜，以蔗糖八硫酸酯的三乙胺(TA)鹽為內水相制備空白脂質體。之后采用交叉流透析等手段除去脂質體外相的蔗糖八硫酸酯TA，造成脂膜內外的蔗糖八硫酸酯TA梯度，然后完成藥物的裝載。原理與硫酸銨梯度法基本相同，但由于蔗糖八硫酸酯每一個分子攜帶8個酸根所以能夠與長春瑞濱形成致密的結合，達到更好的滯留作用。該方法制備的長春瑞濱脂質體血漿半衰期能達到9.2小時。不過其缺陷在于蔗糖八硫酸酯價格昂貴，不易獲得；且其三乙胺鹽沒有市售，需使用其鈉鹽通過離子交換樹脂制得酸型，再用三乙胺中和得到銨鹽，步驟繁瑣、收率低。(Improvedpharmacokineticsandefficacyofahighlystablenanoliposomalνinorelbine.Thejournalofpharmacologyandexperimentaltherapeutics.2009Vol.328No.1.)加拿大以Bally為核心的研究小組則使用了兩種方法制備得到了高包封率的拓撲替康脂質體。方法一以DSPC和膽固醇作為脂膜，以硫酸錳溶液為內水相制備空白脂質體，然后利用離子載體A23187形成pH梯度，實現(xiàn)藥物裝載。該法與hex公司的方法機理相同。方法二以DSPC和膽固醇作為脂膜，以硫酸銅溶液為內水相制備空白脂質體，但是不需要加入A23187即可實現(xiàn)拓撲替康的裝載，這是由于銅離子與拓撲替康形成了穩(wěn)定的絡合物，該原理即為上述絡合梯度法。該方法的缺陷在于制劑中殘留的金屬離子在血液中可能會產生毒性。(Anevaluationoftransmembraneiongradient-mediatedencapsulationoftopotecanwithinliposomes·Journalofcontrolledrelease.96(2004)；Copper-topotecancomplexationmediatesdrugaccumulationintoliposomes.Journalofcontrolledrelease114(2006).)美國的Alza公司使用氫化卵磷脂(HSPC)、膽固醇和DSPE_mPEG作為脂膜，以多陰離子聚物為內水相，如硫酸葡聚糖、硫酸蛋白聚糖、硫酸纖維素等等。之后釆用交叉流透析置換外相形成多聚物梯度，完成載藥。其原理與硫酸銨梯度法類似，目的是利用多價陰離子聚合物與拓撲替康更緊密的結合從而穩(wěn)定滯留。該方法的缺陷也是所述多陰離子聚合物均不常用，價格昂貴且不易獲得°(Liposome—entrappedtopoisomeraseinhibitors.US6465008B1)。由以上研究實例分析可知目前研究的方向主要是廣義硫酸銨梯度法和絡合梯度法，但都只是實驗室階段，均不適應大生產和我國的國情。原因如下(1)以上研究者使用的多陰離子鹽有蔗糖八硫酸酯三乙胺鹽、硫酸多聚物等，這些化學物質國內無法獲得，即便國外也只是小批量生產，根本無法供給大生產；且價格十分昂貴，與我國用藥國情不相符。(2)以上絡合梯度法使用銅離子、鎳離子、錳離子等，均為重金屬離子，殘留在制劑中均對人體有不同程度的損害，且由于腫瘤不易治愈，用藥周期通常很長，重金屬離子在體內的不斷蓄積必然導致患者無法耐受。因此，以上研究成果均不夠理想，有必要發(fā)展新的載藥方法。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個方面提供一種脂質體，包含雙分子層和內水相，其中所述內水相含有苯磺酸衍生物的鹽和活性化合物。根據本發(fā)明的脂質體的一些實施方式，其中苯磺酸衍生物是5-磺基水楊酸或間苯二磺酸。根據本發(fā)明的脂質體的一些實施方式，其中苯磺酸衍生物的鹽是苯磺酸衍生物與胺和銨離子中的一種或更多種形成的鹽。根據本發(fā)明的脂質體的一些實施方式，其中苯磺酸衍生物的鹽是苯磺酸衍生物與氨水、三乙胺、三乙醇胺中的一種或更多種形成的鹽。根據本發(fā)明的脂質體的一些實施方式，其中所述活性化合物是弱堿性化合物，優(yōu)選為長春瑞濱、長春新堿、拓撲替康和伊立替康中的一種或更多種。根據本發(fā)明的脂質體的一些實施方式，其中所述雙分子層含有磷脂、膽固醇和親水性聚合物修飾的脂類物質。本發(fā)明的另一方面提供一種制備上市任意一項根據本發(fā)明的脂質體的方法，包括如下步驟(1)用苯磺酸衍生物的鹽的水溶液水化脂相粉末以形成含有苯磺酸衍生物的鹽的水溶液作為內水相的空白脂質體；(2)除去步驟(1)的空白脂質體的外相中的苯磺酸衍生物的鹽以形成陰離子梯度；(3)將步驟O)的空白脂質體與活性化合物的水溶液一起孵育以將活性化合物包封在脂質體內。本發(fā)明的再另一方面提供一種脂質體藥物制劑，含有根據本發(fā)明的任意的脂質體和藥學上可接受的載體和/或賦型劑。根據本發(fā)明的脂質體藥物制劑的一些實施方式，其中所述載體和/或賦型劑中含有滲透壓調節(jié)劑和/或抗氧劑。本發(fā)明的再另一方面提供上述任意一項根據本發(fā)明的脂質體在制備用于治療腫瘤患者的藥物中的用途，其中脂質體中的活性化合物是長春瑞濱、長春新堿、拓撲替康和伊立替康中的一種或更多種。實驗證明本發(fā)明能夠實現(xiàn)弱堿性藥物，如長春瑞濱、拓撲替康的高效、穩(wěn)定包封，并且能夠有效降低成本，簡化制備工藝；體外釋放和藥代試驗結果表明與傳統(tǒng)硫酸銨內水相處方相比，能夠顯著延緩藥物的釋放速率。長春新堿、伊立替康等抗腫瘤藥物，具有與長春瑞濱和拓撲替康分子類似的苯環(huán)結構，也適用于本發(fā)明的技術方案。新方法的發(fā)現(xiàn)依賴于對傳統(tǒng)載藥技術機理的探討。首先分析硫酸銨梯度法，其包括如下過程脂質體外相中高濃度藥物在濃度差和PH差驅使下，首先克服脂膜(即磷脂雙分子層)阻力進入脂質體內水相，進入內水相的藥物質子化并與SO/—形成沉淀，藥物以沉淀形式得以在脂質體內穩(wěn)定的滯留。而藥物的釋放則需要首先從沉淀上解離下來，然后跨膜擴散出來，因此，沉淀的微觀結構和溶解能力決定了藥物從脂質體中釋放的速度，進而決定了處方的安全性和有效性。藥物和SO/—形成沉淀的微觀結構和復雜程度與藥物分子的空間結構及其堿性強弱有關。有些藥物例如鹽酸多柔比星，由于堿性較強，易與S042_結合形成沉淀，并且其分子空間結構近平面，分子間能夠相互堆壘，微觀結構顯示在脂質體內部能夠形成致密的長條狀沉淀，所以鹽酸多柔比星在脂質體中能達到很好滯留，其脂質體處方在KM小鼠體內的半衰期t1/2大于15小時。而有些藥物例如長春瑞濱和拓撲替康，由于堿性較弱，與SO/—結合形成沉淀能力差，且分子結構非平面，分子間不能堆壘，所以當采用與上述鹽酸多柔比星同樣的脂類組成和制備方法得到的脂質體在KM小鼠體內t1/2小于5小時。而如此短的半衰期使得脂質體在血液循環(huán)的過程中，藥物已有大部分滲漏，不能進入瘤區(qū)；即便是少量進入瘤區(qū)的脂質體藥物，也很快釋放，極其不利于細胞周期特異性抗腫瘤藥物療效的發(fā)揮。可見，藥物與陰離子形成沉淀的復雜程度是影響藥物釋放的關鍵因素。長春瑞濱和拓撲替康等藥物的弱堿性無法改變，所以尋找能與其結合并堆壘形成致密沉淀的陰離子成為解決問題的關鍵。長春瑞濱和拓撲替康分子均含有苯環(huán)，所以考慮含有芳香環(huán)的多陰離子化合物在疏水作用力下可能與其產生穩(wěn)定沉淀。苯磺酸衍生物的鹽與硫酸銨的不同之處在于苯磺酸衍生物的分子中存在一個苯環(huán)，它能夠與長春瑞濱或拓撲替康分子結構中的苯環(huán)結合，促進藥物分子和苯磺酸衍生物分子之間的相互堆壘而形成結構復雜的沉淀結構，同時藥物分子和苯磺酸衍生物分子結構中的疏水部分存在親和力，也會促進分子間堆壘。為了得到具有優(yōu)良性質的脂質體制劑，首先需要制備苯磺酸衍生物的鹽然后采用合適的方法制備脂質體。本發(fā)明采用的方法包括苯磺酸衍生物的鹽的制備配制苯磺酸衍生物的水溶液，與三乙胺、三乙醇胺、氨成鹽；脂質體的制備將所用的脂類輔料溶解于有機溶劑中，凍干除去有機溶劑，得到疏松的脂質粉末，之后使用苯磺酸衍生物的鹽溶液水化脂相粉末，形成空白脂質體。然后用微射流設備或者高壓擠出設備降低空白脂質體的粒度，之后采用透析或者柱層析等手段除去脂質體外相的苯磺酸衍生物的鹽，從而使脂膜內外形成陰離子梯度。然后再將藥物溶液和脂質體混懸液孵育，即得到脂質體藥物。本發(fā)明所使用的苯磺酸衍生物主要是5-磺基水楊酸(下文中簡稱磺基水楊酸)、間苯二磺酸等，該系列化合物價格低廉，國內即可購買得到。綜上所述，本專利涉及到的苯磺酸衍生物作為脂質體內水相無論從藥物包封、滯留效果上還是經濟實用方面是完全可行的。具體實施例方式下面所述實施例的目的是為了更好的說明本發(fā)明，但不應對本發(fā)明的范圍構成限定。下文中所述“藥脂比”指藥物與磷脂的重量比，“DSPE-mPEG的含量”指其在脂質體雙分子層中磷脂成分總摩爾數的百分率。實施例1以苯磺酸衍生物銨鹽為內水相的脂質體制備的一般方案這里的“苯磺酸衍生物銨鹽”指苯磺酸衍生物與TA、TEA或NH3形成的鹽。將磷脂(氫化大豆卵磷脂)、膽固醇按重量比31混合，溶解于95%叔丁醇中，凍干除去有機溶劑，得到疏松的脂質粉末，之后使用苯磺酸衍生物銨鹽溶液水化脂相粉末以得到不均勻的多室脂質體。之后采用高壓擠出或微射流設備進行整粒。整粒后得到的脂質體用柱層析或透析方式以蔗糖/組氨酸溶液替換脂質體外相的苯磺酸衍生物銨鹽。按照適宜的藥脂比，在空白脂質體中加入藥物溶液，孵育載藥。實施例2不同內水相長春瑞濱脂質體載藥的比較內水相處方1苯磺酸/NH3。處方2對羥基苯磺酸/NH3處方3磺基水楊酸/NH3。藥脂比均為29.58，無DSPE-mPEG2000修飾。按照實施例1的方法將“苯磺酸衍生物銨鹽”替換為苯磺酸/NH3、對羥基苯磺酸/NH3或磺基水楊酸/NH3,分別制備脂質體。包封率的測定方法量取100μ1脂質體使用一次性纖維素GF-5脫鹽色譜柱分離脂質體和游離藥部分，0.9%氯化鈉為洗脫液，在線紫外分光光度計監(jiān)測分離情況，使用液相色譜法分別測定游離藥和脂質體部分的含量，按照公式“包封率(％)=脂質體部分/(脂質體部分+游離藥部分)X100%”計算包封率。表1不同內水相長-_瑞濱脂質體包封率結果權利要求1.一種脂質體，包含雙分子層和內水相，其中所述內水相含有苯磺酸衍生物的鹽和活性化合物。2.根據權利要求1的脂質體，其中苯磺酸衍生物是5-磺基水楊酸或間苯二磺酸。3.根據上述任意一項權利要求的脂質體，其中苯磺酸衍生物的鹽是苯磺酸衍生物與胺和銨離子中的一種或更多種形成的鹽。4.根據上述任意一項權利要求的脂質體，其中苯磺酸衍生物的鹽是苯磺酸衍生物與氨水、三乙胺、三乙醇胺中的一種或更多種形成的鹽。5.根據上述任意一項權利要求的脂質體，其中所述活性化合物是長春瑞濱、長春新堿、拓撲替康和伊立替康中的一種或更多種。6.根據上述任意一項權利要求的脂質體，其中所述雙分子層含有磷脂、膽固醇和親水性聚合物修飾的脂類物質。7.一種制備根據權利要求1-6中任意一項的脂質體的方法，包括如下步驟(1)用苯磺酸衍生物的鹽的水溶液水化脂相粉末以形成含有苯磺酸衍生物的鹽的水溶液作為內水相的空白脂質體；(2)除去步驟(1)的空白脂質體的外相中的苯磺酸衍生物的鹽以形成陰離子梯度；(3)將步驟O)的空白脂質體與活性化合物的水溶液一起孵育以將活性化合物包封在脂質體內。8.一種脂質體藥物制劑，含有根據權利要求1-6中任意一項的脂質體和藥學上可接受的載體和/或賦型劑。9.根據權利要求8的脂質體藥物制劑，其中所述載體和/或賦型劑中含有滲透壓調節(jié)劑和/或抗氧劑。10.根據權利要求1-6中任意一項的脂質體在制備用于治療腫瘤患者的藥物中的用途，其中脂質體中的活性化合物是長春瑞濱、長春新堿、拓撲替康和伊立替康中的一種或更多種。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有苯磺酸衍生物鹽內水相的脂質體及其制備方法，及其在制備用于治療腫瘤疾病的藥物中的用途。文檔編號A61P35/00GK102048693SQ20101052856公開日2011年5月11日申請日期2010年10月26日優(yōu)先權日2009年10月26日發(fā)明者修憲,張?zhí)m,張莉,李彥輝,李春雷,李永豐,梁敏,王彩霞,申東民申請人:石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限公司