專利名稱：多糖結(jié)合疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及多糖結(jié)合疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌的莢膜多糖是一種重要的保護(hù)性抗原。用化學(xué)方法純化的細(xì)菌莢膜多糖組分疫苗來預(yù)防傳染病，是疫苗發(fā)展史上的重要舉措之一，其中已在全世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的多糖疫苗有流行性腦膜炎球菌的A、C、Y和W135等4價(jià)多糖疫苗，以及肺炎雙球菌23價(jià)多糖疫苗。但多糖疫苗存在很大的局限性，在2歲以下嬰幼兒中的免疫原性差，不能誘導(dǎo)有效地免疫保護(hù)。用細(xì)菌的多糖(PQ與蛋白載體通過化學(xué)方法制備的疫苗，稱之為結(jié)合疫苗 (conjugate vaccine)。Goebel和Avery早于19 年就首次成功地用化學(xué)方法將肺炎球菌的第3型莢膜多糖共價(jià)結(jié)合至蛋白載體上去制備成多糖-蛋白結(jié)合疫苗。這種具有胸腺依賴性(T-cbpendent，TD)的蛋白載體可將胸腺非依賴性(T-incbpendent，!！)的多糖抗原轉(zhuǎn)變成胸腺依賴性的抗原，從而啟動T輔助淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一系列的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。自第一個(gè)多糖結(jié)合疫苗_b型嗜血流感桿菌結(jié)合疫苗(Hib)于1987年經(jīng)美國食品和藥物管理署(FDA)批準(zhǔn)投入臨床應(yīng)用以來，各種多糖蛋白結(jié)合疫苗的研究發(fā)展迅速，已成為當(dāng)今疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前的結(jié)合疫苗主要有流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、肺炎球菌結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌結(jié)合疫苗、痢疾桿菌結(jié)合疫苗、傷寒Vi結(jié)合疫苗、乙型溶血性鏈球菌結(jié)合疫苗等。大多數(shù)的多糖結(jié)合疫苗主要以破傷風(fēng)類毒素(TT)和白喉內(nèi)毒素的脫毒突變體 (CRM197)作為載體，種類比較單一，會造成多糖抗體應(yīng)答低下的現(xiàn)象，這是由于結(jié)合疫苗中相同的載體蛋白只能與同一輔助性T細(xì)胞(Th)競爭性結(jié)合，從而使每種多糖抗原最終激活的B細(xì)胞數(shù)量減少，多糖特異性的抗體水平下降。載體的多樣化可以使上述問題得到改善， 其原因可能是用不同載體蛋白結(jié)合同一種多糖時(shí)激活的Th細(xì)胞克隆數(shù)要多于單一載體蛋白的Th細(xì)胞克隆數(shù)，可產(chǎn)生更高水平的特異性抗體。同時(shí)，結(jié)合疫苗可同時(shí)產(chǎn)生針對多糖和蛋白載體的免疫應(yīng)答，為多聯(lián)疫苗的開發(fā)提供了思路。結(jié)合疫苗還具有載體蛋白效應(yīng)，在接種結(jié)合疫苗時(shí)，載體蛋白能產(chǎn)生類似佐劑的作用。因此，對載體蛋白的研究和開發(fā)勢在必行。許多研究者致力于開發(fā)粘膜投遞型疫苗，這種投遞途徑與大多數(shù)病原體的自然感染途徑相同，而且粘膜投遞途徑簡單、安全，避免了注射疫苗所需的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，有利于開展大規(guī)模人群的免疫接種。許多研究表明，相對于在自然感染中通過粘膜途徑感染的一些病原體而言，通過粘膜途徑對機(jī)體進(jìn)行疫苗免疫，機(jī)體所產(chǎn)生的免疫保護(hù)是最有效的。它既能產(chǎn)生機(jī)體粘膜系統(tǒng)的局部免疫保護(hù)反應(yīng)，又能產(chǎn)生全身性的免疫反應(yīng)來預(yù)防疾病的發(fā)生。 因此，開發(fā)粘膜投遞型疫苗具有一定的科學(xué)性和必要性。有研究表明，以TT為載體蛋白的C群腦膜炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗通過滴鼻免疫小鼠，誘發(fā)了較好的粘膜免疫應(yīng)答。有的研究者將不可分型流感嗜血桿菌(NTHi)來源的寡糖類物質(zhì)與TT結(jié)合后，滴鼻免疫小鼠，結(jié)果產(chǎn)生了較好的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，TT可以作為粘膜投遞型多糖蛋白結(jié)合疫苗的蛋白載體。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)為代表的一些病原菌蛋白成分是近年來研究較多的一類粘膜佐劑。研究表明，流感病毒亞單位抗原或白喉類毒素(DT)與LTB形成疫苗，共同鼻內(nèi)免疫小鼠后，血清中產(chǎn)生了高滴度的特異性IgG抗體，口腔、陰道分泌物中和肺部表面產(chǎn)生了中等水平的粘膜IgA抗體。目前研究的C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合物主要以TT或CRM197為載體，大腸桿菌不耐熱腸毒素LT-K63只是作為佐劑來增強(qiáng)結(jié)合物的免疫原性。目前尚未見到以此類蛋白為載體蛋白的細(xì)菌多糖結(jié)合物。因此，目前要研究同時(shí)具有保護(hù)性抗原和佐劑功能的多糖載體蛋白、進(jìn)而改善和延伸現(xiàn)有多糖結(jié)合疫苗的功能正日益成為熱點(diǎn)。以這類蛋白為載體的多糖蛋白結(jié)合疫苗具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義和廣闊的市場前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多糖結(jié)合疫苗。本發(fā)明的目的還在于提供該多糖結(jié)合疫苗的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種多糖結(jié)合疫苗，包含細(xì)菌多糖與載體蛋白的化學(xué)偶聯(lián)物，其中所述載體蛋白為細(xì)菌粘膜侵襲相關(guān)蛋白。優(yōu)選地，所述載體蛋白選自大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白Al (FspAl)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2(FspA2)、肺炎球菌表面蛋白(PspA)和肺炎球菌表面黏附素(PsaA)。優(yōu)選地，所述細(xì)菌多糖選自腦膜炎球菌多糖、嗜血流感桿菌多糖和肺炎球菌多糖。優(yōu)選地，所述細(xì)菌多糖為腦膜炎球菌多糖，并且所述載體蛋白為大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位。本發(fā)明的疫苗可以是本發(fā)明方法直接制備得到的液體制劑的形式，也可以是將該液體通過濃縮得到的濃縮液形式，或是通過干燥(例如)冷凍干燥后得到的凍干粉劑形式。優(yōu)選地，所述多糖結(jié)合疫苗為液體制劑，該液體制劑中還包含有未與所述載體蛋白結(jié)合的游離細(xì)菌多糖，并且在所述液體制劑中，總細(xì)菌多糖的含量為30-800μ g/ml，載體蛋白的含量為30-900μ g/ml，以及總細(xì)菌多糖和載體蛋白之間的重量比為0. 3_3。優(yōu)選地，在本發(fā)明所述疫苗中，未與所述載體蛋白結(jié)合的游離細(xì)菌多糖的含量低于 30%。優(yōu)選地，所述多糖結(jié)合疫苗的液體制劑形式是通過注射或粘膜投遞的方式來施用的。本發(fā)明還提供一種多糖結(jié)合疫苗的制備方法，該方法包括1)提供細(xì)菌多糖；2)提供載體蛋白；3)使所述細(xì)菌多糖和所述載體蛋白化學(xué)偶聯(lián)；其中，所述載體蛋白為細(xì)菌粘膜侵襲相關(guān)蛋白。優(yōu)選地，所述載體蛋白選自大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白Al (FspAl)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2(FspA2)、肺炎球菌表面蛋白(PspA)和肺炎球菌表面黏附素(PsaA)。
優(yōu)選地，所述細(xì)菌多糖選自腦膜炎球菌多糖、嗜血流感桿菌多糖和肺炎球菌多糖。在本發(fā)明中，可利用基因工程方法體外重組表達(dá)載體蛋白，包括(例如)大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白Al (FspAl)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2(FspA2)、肺炎球菌表面蛋白(PspA)和肺炎球菌表面黏附素O^saA)，并將載體蛋白與多糖抗原進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)制備成多糖蛋白偶聯(lián)物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種偶聯(lián)物可以作為預(yù)防多糖和蛋白所對應(yīng)的病原體的疫苗。由于這些載體蛋白分別是大腸桿菌、空腸彎曲菌和肺炎球菌的保護(hù)性抗原成分，它既是一種保護(hù)性抗原又是較強(qiáng)的粘膜佐劑，因此，如果將這些蛋白作為多糖結(jié)合疫苗的載體蛋白，可以使傳統(tǒng)的多糖結(jié)合疫苗改型為粘膜投遞型疫苗。而且載體多樣化可以解決多價(jià)多糖結(jié)合疫苗中載體單一造成的抗體應(yīng)答低下現(xiàn)象和載體蛋白的毒性蓄積現(xiàn)象。不僅如此，以這些蛋白為載體的多糖結(jié)合疫苗提供了針對產(chǎn)毒性大腸桿菌、空腸彎曲菌以及肺炎球菌的交叉免疫保護(hù)反應(yīng)。


圖1為重組質(zhì)粒pET42b+LTB構(gòu)建示意圖(LTB =LTB基因；NdeI =NdeI酶切位點(diǎn)； AvrII =AvrII 酶切位點(diǎn))；圖2為重組質(zhì)粒pET30a+fspAl構(gòu)建示意圖(fspAl :fspAl基因；NdeI =NdeI酶切位點(diǎn)；Sac I =SacI酶切位點(diǎn))；圖3為重組質(zhì)粒pET30a+pspA構(gòu)建示意圖(pspA :pspA基因；NdeI =NdeI酶切位點(diǎn)；Sac I =SacI酶切位點(diǎn))。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖通過具體實(shí)施方式
的描述對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基可通過如下方法制備LB液體培養(yǎng)基胰化蛋白胨(bacto-tryptone，OXOID公司)10g，酵母提取物 (bacto-yeast extract, 0X0ID 公司)5g, NaCl 10g，加蒸餾水溶解，定容至 1000ml，高壓滅菌(0. 12Mpa，115°C，20分鐘)后4°C保存?zhèn)溆谩B液體培養(yǎng)基(Kana+)胰化蛋白胨(bacto-tryptone，0X0ID公司)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract，0X0ID公司)5g，NaCl 10g，加蒸餾水溶解，定容至1000ml，高壓滅菌(0. 12Mpa，115°C，20分鐘)，等到溫度降到50°C時(shí)，加入卡那霉素(Kana)至終濃度為 30ug/ml，4°C保存?zhèn)溆?。LB固體培養(yǎng)基(Kana+)在100ml上述LB液體培養(yǎng)基中加入1. 5g瓊脂，高壓滅菌 (0. 12Mpa, 115°C，20分鐘)，等到溫度降到50°C時(shí)，加入卡那霉素(Kana)至終濃度為30ug/ ml，鋪板，4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例1下面以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)與C群流行性腦膜炎球菌多糖 (GCMP)的結(jié)合為例，來對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。(一 )、重組大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(rLTB)的克隆和表達(dá)1)LTB基因的合成與表達(dá)載體的構(gòu)建LTB基因序列選自于GENBANK，序列號為GI :157021177。按照大腸桿菌密碼子使用頻率表(參考文獻(xiàn):Maloy, S.，V. Stewart, andR. Taylor. 1996. Genetic analysis of pathogenic bacteria. Cold SpringHarbor Laboratory Press, NY. ) iXitiitl^^i, ^Ε ψβ] C 末端加上6個(gè)組氨酸標(biāo)簽和終止密碼子，然后在序列兩端分別加上Ndel、AvrII酶切位點(diǎn)。人工合成上述LTB基因，然后用NdeI、AvrII雙酶切LTB和pET42b (購自Novagen)， 再將雙酶切LTB后的目的片段和pET42b載體連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET42b+LTB，如圖1所示。全基因合成及上述構(gòu)建工作由上海捷瑞生物工程有限公司完成。2)重組載體的酶切鑒定將步驟1)獲得的重組質(zhì)粒pET42b+LTB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，并將轉(zhuǎn)化子接種到LB固體培養(yǎng)基(Kana+)平板上，從中挑取生長狀態(tài)良好的菌落，接于LB液體培養(yǎng)基 (Kana+)中，于37°C搖床、230rpm過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，進(jìn)行NdeI、AvrII雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析證明，在相應(yīng)的位置上有LTB目的基因片段和pET42b載體片段，條帶大小與
預(yù)期一致。3)目的蛋白LTB的表達(dá)將步驟1)獲得的重組質(zhì)粒pEI^^b+LTB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，在237rpm、37°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至OD值為1. O時(shí)，加入終濃度為ImM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導(dǎo)表達(dá)2-4小時(shí)(參考文獻(xiàn)《分子克隆試驗(yàn)指南》第三版(上、下冊)(美)J.薩姆布魯克，黃培堂，科學(xué)出版社，2002)。經(jīng)SDS-PAGE檢測(參考文獻(xiàn)《分子克隆試驗(yàn)指南》，出處同上)和flfestern blot 鑒定(參考文獻(xiàn)《分子克隆試驗(yàn)指南》，出處同上)證明，上述大腸桿菌BL21的表達(dá)產(chǎn)物為 LTB，且可與LTB的單克隆抗體(購自HyTest公司)特異性結(jié)合，與預(yù)期結(jié)果相符。(二)、rLTB 的純化將上述誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌BL21離心(5000rpm，10分鐘)，棄上清，將菌體用 20mM、pH7. 0的磷酸緩沖液(磷酸二氫鈉_磷酸氫二鈉)清洗一次，再用上述20mM、pH7. 0 的磷酸緩沖液重懸，用超聲破碎儀破碎。破碎完全后離心(11000rpm，40分鐘)，收集上清， 用CM-FF陽離子交換柱(購自GE HEALTHY)純化，收集在洗脫液為0. 17mol/L NaCl時(shí)的洗脫峰，得到純化后的本發(fā)明目的蛋白rLTB。(三)、rLTB與GCMP的化學(xué)偶聯(lián)將上述純化所得蛋白rLTB在4°C下透析48小時(shí)后，過濾除菌，于4°C保存?zhèn)溆?。?2. 5ml GCMP (天壇生物制品股份有限公司饋贈)(約IOmg)，加入等質(zhì)量的CNBr，攪拌進(jìn)行反應(yīng)，并用0. IM NaOH維持pH10. 8，在高pH條件下，CNBr與多糖糖鏈上的羥基反應(yīng)生成氰酸酯。在上述反應(yīng)進(jìn)行10分鐘后，加入己二酰胼(ADH) 70mg,用0. IM NaOH維持pH8. 5，于4°C 反應(yīng)過夜，使ADH與氰酸酯反應(yīng)形成異脲鍵，生成GCMP-ADH酰胼類衍生物。然后將反應(yīng)混合物裝入透析袋，于0. 2M NaCl中透析48小時(shí)，除去未反應(yīng)的CNBr、ADH或反應(yīng)中間物。然后用鹽酸調(diào)節(jié)透析物的PH值至5. 7，加入上述制得的載體蛋白rLTB，使透析物(多糖)與rLTB 的質(zhì)量相等，再加入終濃度0. IM EDAC (碳二亞胺)，用鹽酸維持pH5.7，于2-8°C攪拌透析2 天，使載體蛋白的羧基與GCMP-ADH酰胼類衍生物的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，生成GCMP-ADH-載體蛋白，然后收取透析物。
在上述氰酸酯與ADH反應(yīng)透析4 后，用TNBS比色法檢測衍生物中ADH的含量， 可以反映多糖平均修飾度，檢測結(jié)果為0. 8-1. 5% (重量比)。(四)、rLTB與GCMP的結(jié)合物的純化將步驟(三)得到的反應(yīng)產(chǎn)物于IOkD超濾管(Millipore)中超濾濃縮，再用 0. 45 μ m濾膜過濾，用kphorose 4FF凝膠柱純化，使用0. 2MNaCl為洗脫劑，收集外水體積處的洗脫峰，得到本發(fā)明GCMP-rLTB結(jié)合物溶液。對GCMP-rLTB結(jié)合物進(jìn)行定性檢測和定量檢測，其中根據(jù)在分子篩外水體積處^Onm波長處有、無吸收峰來對GCMP-rLTB結(jié)合物進(jìn)行定性檢測，如有吸收峰則表明載體蛋白與多糖生成了結(jié)合物，反之則說明沒有多糖蛋白結(jié)合物生成。對結(jié)合物中多糖和蛋白質(zhì)含量的檢測采用《中華人民共和國藥典》第三部OOlO 年版，國家藥典委員會編，中國醫(yī)藥科技出版社)所記載的方法。所述定性檢測和定量檢測的結(jié)果為在分子篩外水體積處280nm波長處有吸收峰，蛋白含量J46. 5 μ g/ml，總多糖含量640. lyg/ml，游離多糖含量15. lyg/ml，多糖/蛋白(重量比):2. 5。(五)、GCMP-rLTB結(jié)合物的免疫效果1.試驗(yàn)藥品通過上述方法制備的GCMP-rLTB結(jié)合物，以及GCMP-TT (北京生物制品研究所細(xì)菌研究室饋贈)、GAMP-TT+GCMP-TT(北京生物制品研究所細(xì)菌研究室饋贈)、 GCMP (天壇生物制品股份有限公司饋贈)，并配制成具有試驗(yàn)所需總多糖含量的液體制劑。2.試驗(yàn)動物BALB/c小鼠，24只，雌性，6周齡，體重18_20g，購自天壇生物公司， 在天壇生物公司動物房飼養(yǎng)。3.動物分組將BALB/c小鼠隨機(jī)每6只分為一組。4.免疫方式滴鼻組34 μ 1/只，含總多糖為10 μ g或20ug，從小鼠鼻孔緩慢滴入，注意勿流入口腔及肺；腹腔注射組100 μ 1/只，含總多糖10 μ g或20ug ；一共免疫4次，第0、14、21天免疫，第三次免疫后1周即第21天用含2%皂苷 PBS (pH7. 4)沖洗小鼠陰道/ 口腔/肺/小腸并收集沖洗液后，在小鼠眼球處取血約500μ 1 作檢測。末次免疫后1周即第觀天以同樣的方法收集沖洗液后，摘眼球取血拉頸處死小鼠。5.檢測方法小鼠陰道/ 口腔/肺/小腸沖洗物中抗多糖IgA的ELISA測定以每孔100 μ 1稀釋液(含總多糖 ο μ g)包被96孔酶標(biāo)板4°C過夜后，37°C封閉3h，以1 32起始稀釋小鼠陰道/ 口腔/肺/小腸沖洗液后，再進(jìn)行倍比稀釋，以每孔100 μ 1加入孔中，置于37°C培養(yǎng)箱Ih;加入以1 2000稀釋的羊抗鼠IgA 100 μ 1/孔，置于37°C培養(yǎng)箱Ih后顯色并用酶標(biāo)儀讀數(shù)。小鼠血液中抗多糖IgG的ELISA測定以每孔100 μ 1稀釋液(含總多糖IOyg) 包被酶標(biāo)板4°C過夜后，37°C封閉池，以1 100起始稀釋離心后的血清，再進(jìn)行倍比稀釋， 以每孔100 μ 1加入孔中，置于37°C Ih;加入以1 5000稀釋的羊抗鼠IgG 100 μ 1/孔，置于37°C培養(yǎng)箱Ih后顯色并用酶標(biāo)儀讀數(shù)。小鼠小腸/肺沖洗物中抗LTB IgA的ELISA測定將LTB蛋白(購自Sigma公司) 以10ug/ml的濃度包被酶標(biāo)板(每孔100μ 1)4°C過夜后，37°C封閉3h，以1 10起倍比稀釋小腸/肺沖洗物，以每孔100μ1加入孔中，37°C孵育Ih;加入以1 2000稀釋的羊抗鼠IgA，置于37°C培養(yǎng)箱Ih后顯色并用酶標(biāo)儀讀數(shù)。小鼠血液中抗LTB IgG的ELISA測定將LTB蛋白(購自Sigma公司)以IOug/ ml的濃度包被酶標(biāo)板(每孔100μ 1)4°C過夜后，37°C封閉3h，以1 40起倍比稀釋血清， 以每孔100μ 1加入孔中，置于37°C Ih ；加入以1 5000稀釋的羊抗鼠IgG，置于37°C培養(yǎng)箱Ih后顯色并用酶標(biāo)儀讀數(shù)。6.試驗(yàn)結(jié)果A. GCMP特異丨牛血清和粘臘免,瘡應(yīng)答水平試驗(yàn)1.滴鼻免疫時(shí)GCMP-rLTB特異性血清和粘膜免疫應(yīng)答水平以及與GCMP-TT 免疫應(yīng)答水平的比較試驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1中可以看出，通過使用含總多糖為IOyg或20ug的 GCMP-rLTB滴鼻免疫小鼠，在第四次免疫后1周即觀天，小鼠陰道沖洗物中多糖抗體滴度都明顯高于第三次免疫后1周即第21天沖洗物中多糖抗體滴度(P < 0. 01)；血液中多糖抗體滴度也都明顯高于第三次免疫后1周血液中抗體滴度(P < 0. 01)；并且在第四次免疫后 1周即觀天，小鼠口腔沖洗物和肺沖洗物中也都表現(xiàn)出一定量的多糖抗體滴度。此外，GCMP-rLTB滴鼻組和GCMP-TT滴鼻組相比，小鼠陰道/ 口腔/肺沖洗物中的抗多糖IgA和血液中的抗多糖IgG的抗體滴度都有顯著性差異(P <0.05)。此結(jié)果說明 LTB和TT兩種載體蛋白在和GCMP的偶聯(lián)效果上，前者優(yōu)于后者。表lGCMP-rLTB結(jié)合物、GCMP-TT的免疫效果評價(jià)數(shù)據(jù)(GMT為幾何均數(shù))
權(quán)利要求
1.一種多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，包含細(xì)菌多糖與載體蛋白的化學(xué)偶聯(lián)物，其中所述載體蛋白為細(xì)菌粘膜侵襲相關(guān)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，所述載體蛋白選自大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白Al、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2、肺炎球菌表面蛋白和肺炎球菌表面黏附素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，所述細(xì)菌多糖選自腦膜炎球菌多糖、嗜血流感桿菌多糖和肺炎球菌多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，所述細(xì)菌多糖為腦膜炎球菌多糖，并且所述載體蛋白為大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，所述多糖結(jié)合疫苗為液體制劑，該液體制劑中還包含有未與所述載體蛋白結(jié)合的游離細(xì)菌多糖，并且在所述液體制劑中，總細(xì)菌多糖的含量為30-800 μ g/ml，載體蛋白的含量為30-900 μ g/ml，以及總細(xì)菌多糖和載體蛋白之間的重量比為0. 3-3。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，在所述疫苗中，所述的未與所述載體蛋白結(jié)合的游離細(xì)菌多糖的含量低于30%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖結(jié)合疫苗，其特征在于，所述多糖結(jié)合疫苗是通過注射或粘膜投遞的方式來施用的。
8.一種多糖結(jié)合疫苗的制備方法，該方法包括1)提供細(xì)菌多糖；2)提供載體蛋白；和3)使所述細(xì)菌多糖和所述載體蛋白化學(xué)偶聯(lián)；其中，所述載體蛋白為細(xì)菌粘膜侵襲相關(guān)蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述載體蛋白選自大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白Al、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2、肺炎球菌表面蛋白和肺炎球菌表面黏附素；所述細(xì)菌多糖選白腦膜炎球菌多糖、嗜血流感桿菌多糖和肺炎鏈球菌多糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多糖結(jié)合疫苗，包含細(xì)菌多糖與載體蛋白的化學(xué)偶聯(lián)物，所述載體蛋白為細(xì)菌粘膜侵襲相關(guān)蛋白，如大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A1、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2、肺炎球菌表面蛋白、肺炎球菌表面黏附素。本發(fā)明還涉及該多糖結(jié)合疫苗的制備方法。本發(fā)明所述的多糖結(jié)合疫苗可以在不添加其它任何外源性蛋白的前提下，實(shí)現(xiàn)多糖結(jié)合疫苗的粘膜投遞，這種免疫途徑將使疫苗的使用更加高效、便捷和安全。
文檔編號A61K47/48GK102462839SQ20101054839
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者衛(wèi)江波, 唐玉龍, 張學(xué)峰, 張靖, 李啟明, 陳實(shí), 靳玉琴, 馬智靜 申請人:北京生物制品研究所