專利名稱：純化蛋白復合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及純化蛋白復合物的新穎方法。尤其是，提供了用于純化包括復合于肽片段的熱休克蛋白的蛋白復合物的方法。本發(fā)明還延伸到所純化的蛋白復合物在制備疫苗組合物和使用所述疫苗組合物來預防和治療傳染病和癌癥中的用途。
背景技術(shù)：
接種疫苗被廣泛地接受為應對傳染病和癌癥的全球醫(yī)療負擔的有利方法。然而， 雖然我們對與傳染病和癌癥有關(guān)的分子生物學的認識有顯著的進展，但這些領(lǐng)域中的有效疫苗的開發(fā)還是有限的。所開發(fā)的最有效的疫苗使用活的、減毒的生物，然而，與這種減毒的病原體回復毒力有關(guān)的安全風險限制了它們的廣泛應用。阻止更有效的疫苗的大規(guī)模開發(fā)和使用的其它主要阻礙是鑒定將以特定方式引起針對微生物病原體的突變菌株的寬泛的保護性免疫的候選病原體來源的蛋白的有限能力。一種顯示賦予寬泛的、保護性免疫的前景的特定方法是將應激蛋白復合物用作針對傳染病和癌癥的疫苗(Colaco等人，(2004) Biochem Soc Trans32 :6^-6 等人， (2006)Cancer Immunol Immunother 55 =329-338) 已廣泛記載了熱休克蛋白 / 抗原肽復合物有效作為針對特定的癌癥的疫苗(美國專利第5，997，873號；美國專利第5，935，576 號，美國專利第5，750，119號，美國專利第5，961，979號和美國專利第5，837，251號)。 已顯示分離自熱休克的BCG細胞的病原體來源的應激蛋白復合物在接種疫苗的宿主中誘導了輔助性T淋巴細胞I(Thl)介導的免疫應答，其在肺結(jié)核的小鼠氣霧攻擊模型中賦予了針對活體攻擊(live challenge)的保護性免疫(國際PCT專利申請第WO 01/13944 號)。并且，在WO 02/20045、WO 00/10597和WO 01/13943中已顯示分離自病原體或病原體感染的細胞的應激蛋白復合物有效作為針對傳染病的疫苗中的免疫原性決定物 (immunogenicdeterminant)0熱休克蛋白(hsp，HSP)形成廣泛遍布植物界和動物界的高度保守的蛋白家族。根據(jù)它們的分子量，將主要的熱休克蛋白分為6種不同的家族小型(hsp20-30kDa) ；hsp40 ； hsp60 ;hsp70 ;hsp90和hsplOO。雖然熱休克蛋白最初鑒定于經(jīng)受熱應激(heat stress) 的細胞中，已發(fā)現(xiàn)它們與許多其它類型的應激有關(guān)，比如感染、滲透壓應激、細胞因子應激和類似的應激。因此，根據(jù)其表達不僅由熱應激所導致，也常將熱休克蛋白稱作應激蛋白 (SP)。hsp60家族的成員包括主要伴侶分子GroEL。這些主要伴侶分子與諸如GroES的輔伴侶分子形成多聚體復合物。許多微生物病原體具有形成不同于GroEL的復合物的另外的 hsp60家族，且一些hsp60家族成員可能更具免疫原性，比如分枝桿菌的hsp65。hsp70家族的成員包括DnaK，DnaK可與諸如DnaJ的輔伴侶分子形成多聚體復合物。其它主要hsp包括 AAAATP 酶、Clp 蛋白、觸發(fā)因子、Hip、HtpG, NAC、Clp、GrpE, SecB 和前折疊素(prefoldin)。應激蛋白普遍表達于原核細胞和真核細胞兩者中，其中它們在多肽的折疊和解折疊中作為伴侶分子起作用。應激蛋白的另一個作用是陪伴肽從一個細胞區(qū)室到另一個細胞區(qū)室，以及，在患病細胞的情況下，已知應激蛋白還陪伴病毒肽或腫瘤相關(guān)肽至細胞表面。應激蛋白的陪伴功能通過在應激蛋白和所陪伴的多肽之間形成復合物來實現(xiàn)。
6所陪伴的多肽可包括肽片段，且所述復合物的形成受到ATP依賴的核苷酸交換系統(tǒng)的控制，對于細菌Hsp70同系物DnaK已十分清楚地證明了這點(&abo等人PNAS(1994)卷 91.10345-10349)。簡言之，在其靜息細胞狀態(tài)中，DnaK與ATP(三磷酸腺苷)結(jié)合且對底物具有低親和力(Palleros等人PNAS(1991)卷88. 5719-5723)。ATP水解導致DnaK 轉(zhuǎn)化為高親和力ADP(二磷酸腺苷)狀態(tài)，導致了 DnaK-ADP-底物復合物的形成，其中所述底物通常是多肽或蛋白。ADP解離之后，ATP重新結(jié)合DnaK，導致構(gòu)象改變，觸發(fā)了正確折疊的底物蛋白從復合物的釋放(Palleros等人J Biol Chem(19^)卷沈7，第8冊， 5279-5285 ；Palleros 等人 Nature(1993)365(6447) :664-6 ；Szabo 等人 PNAS(1994)卷 91.10345-10349)。已顯示導致底物釋放的該最終步驟除結(jié)合ATP之外還需要鉀(K+)和鎂 (Mg2+) (Palleros 等人Nature (1993) 365 (6447) :664-6 ；Palleros 等人FEBS Letters (1993) 卷336，第1冊，1對-1沘)。異源多肽或多肽片段與應激蛋白復合形成應激蛋白-肽復合物，可將其稱作熱休克蛋白復合物(HspC)。HspC被抗原呈遞細胞(APC)捕獲以提供抗原肽的來源，所述抗原肽可被裝載到主要組織相容復合物(MHC)分子上以細胞表面呈遞給免疫系統(tǒng)的T淋巴細胞。熱休克蛋白/抗原肽片段復合物(HspC)作為癌癥疫苗已被廣泛研究(參見，例如，美國專利第5，997，873號和美國專利第5，935，576號)且因此已開發(fā)了用于從腫瘤細胞中分離用作針對所述腫瘤的有效疫苗的HspC的方法。例如，WO 02/28407公開了基于熱休克蛋白對于肝素的結(jié)合親和力用于純化蛋白復合物的方法。兩步方法包括肝素親和色譜和可選的后續(xù)離子交換色譜步驟，以獲得應激蛋白復合物制備物。WO 02/34205涉及利用 ConA瓊脂糖凝膠純化HSP70應激蛋白復合物。然而這些方法導致了單個熱休克蛋白家族的分離，且因此忽略了多伴侶分子蛋白作為疫苗的使用。HspC作為癌癥疫苗的用途可通過使用多伴侶分子蛋白尤其是熱休克蛋白 (Bleifuss等人2008)來顯著地改良，且因此已開發(fā)了用于純化用于疫苗的多伴侶分子蛋白和伴侶分子蛋白復合物的方法。例如，美國專利第6，875，849號公開了使用非液相等電聚焦(FS-IEF)從腫瘤中純化用作癌癥疫苗的HspC。可使用自由流等電聚焦(FF-IEF)從病原體和感染的細胞中分離用作用于預防和治療傳染病的疫苗組合物中的免疫原性決定物的熱休克蛋白/肽復合物。然而，該技術(shù)的關(guān)鍵限制是與開發(fā)大規(guī)模FF-IEF設(shè)備以產(chǎn)生大量熱休克蛋白/肽復合物(HspC)有關(guān)的困難，大量熱休克蛋白/肽復合物(HspC)是商業(yè)大規(guī)模的GMP疫苗生產(chǎn)所需要的。并且，使用兩性電解質(zhì)(安福靈(ampholines))來產(chǎn)生FF-IEF過程中需要的pH梯度導致了所得的純化的含HspC的制備物中除離液劑之外另外污染物的引入。這樣的污染物是管理機構(gòu)不可接受的，為在含HspC的疫苗組合物的生產(chǎn)中使用FF-IEF方法設(shè)置了重要的阻礙。有趣地是，這些發(fā)明人甚至在使用離液劑時報道了 HspC的穩(wěn)定性，諸如在FF-IEF過程中甚至在處理緩沖液中不存在二價陽離子和ADP時使用尿素和去垢劑(Bleifuss等人2008)。此外，自由流等電聚焦的過程緩慢，典型的運行時間為4小時，在該過程中產(chǎn)生了高水平的蛋白降解，嚴重限制了純化的蛋白復合物的大規(guī)模生產(chǎn)中FF-IEF的使用。發(fā)明概述大量實驗后，本發(fā)明人已鑒定了用于純化諸如熱休克蛋白/肽復合物(HspC)的應激蛋白-肽復合物的改良的方法，所述方法可用來純化可安全用于疫苗生產(chǎn)的多應激蛋
7白-肽復合物。該方法以表面電荷而非等電點為基礎(chǔ)分離蛋白復合物。尤其是，已鑒定了允許包括復合于肽片段的應激蛋白的蛋白復合物的快速純化的純化方法，所述應激蛋白比如熱休克蛋白，其中純化的產(chǎn)物的產(chǎn)量足以允許制備用于制備疫苗組合物的商業(yè)上可接受的量的蛋白復合物。有利地，由于純化過程中沒有引入藥學上不可接受的或不想要的添加劑或組分，純化的蛋白復合物可用于制備疫苗制備物。特別地，本發(fā)明人已鑒定了對防止應激蛋白復合物的裂解或部分解離的特定緩沖條件的要求。因此，純化方法有利地降低或改善了當純化蛋白復合物用于疫苗組合物中以引起針對其的免疫應答時所述純化蛋白復合物的解離和功能喪失，并同時消除了使用離液劑或其它化學物諸如表面活性劑以提高經(jīng)歷純化的蛋白復合物的溶解度的需要。最令人驚訝的是，當與針對利用不使用本發(fā)明的緩沖條件的標準方法分離的相似復合物引起的免疫相比較時，利用本發(fā)明的方法純化的熱休克蛋白/抗原肽復合物(HspC)富集的制備物(HEP)在接種疫苗的受治療者中引起了顯著增強的免疫。本發(fā)明人已進一步鑒定了，當細胞裂解物在含有二磷酸腺苷(ADP)和至少一種二價陽離子的緩沖液中被緩沖時，或在一些實施方案中僅使用至少一種二價陽離子時，可進一步增強本發(fā)明的純化的蛋白復合物用于制備疫苗制備物的效用。并且，利用本發(fā)明的改良的方法純化的熱休克蛋白/抗原肽復合物(HspC)富集的制備物(HEP)與包括至少一種二價陽離子和任選地二磷酸腺苷(ADP)的緩沖液相結(jié)合在施用所述復合物的受治療者中引起了甚至更強的保護性免疫應答。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于從源混合物中純化在應激蛋白和多肽之間形成的應激蛋白復合物的方法，所述方法包括以下的步驟(i)提供包括至少一種靶應激蛋白復合物的源混合物，所述靶應激蛋白復合物包括復合于多肽的應激蛋白，(ii)確定待從所述源混合物中純化的至少一種靶應激蛋白復合物的等電點 (Pi)；(iii)從包括所鑒定的靶應激蛋白復合物的所述源混合物中制備澄清的細胞裂解物；(iv)使所述細胞裂解物經(jīng)受利用離子交換的純化，其中所述細胞裂解物被包括至少一種二價陽離子的第一緩沖液緩沖至靶應激蛋白復合物的pi的2個單位內(nèi)的pH，并且其中第二緩沖液提供了用來洗脫包括靶應激蛋白復合物的混合物的鹽梯度。在某些實施方案中，第一緩沖液還包括二磷酸腺苷(ADP)和/或二磷酸腺苷模擬物。在某些另外的實施方案中，至少一種二價陽離子是鎂鹽，通常是氯化鎂(MgCl2)，或錳鹽。在又一些另外的實施方案中，二價陽離子以從約0. ImM至約IOOmM的濃度被提供。在一個實施方案中，緩沖液僅包括作為二價陽離子的鎂鹽，通常為氯化鎂(MgCl2)。在某些實施方案中，二磷酸腺苷以從約0. ImM至約IOOmM的濃度被提供。在某些實施方案中，第一緩沖液包括濃度為至少ImM的氯化鎂(MgCl2)和濃度為至少ImM的二磷酸腺苷(ADP)。在某些實施方案中，緩沖液還包括HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，其可以約50mM的濃度而存在。所述緩沖液可具有約pH6. 8的pH。在某些另外的實施方案中，第一緩沖液包括至少一種二價陽離子，但缺少二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶和/或、鉀或鉀鹽中的至少一種。在一個實施方案中， 緩沖液僅包括作為二價陽離子的鎂鹽，通常為氯化鎂(MgCl2)。
在某些另外的實施方案中，第一緩沖液缺少以下中的至少一種離液劑、表面活性劑和/或兩性電解質(zhì)。離液劑(chaotrope)(也稱作離液劑(chaotropic agent)或離液試齊U)包括尿素、鹽酸胍和高氯酸鋰。已知離液劑用作蛋白變性劑，導致蛋白展開和最終的三維結(jié)構(gòu)的改變。兩性電解質(zhì)是含有酸性基團和堿性基團兩者的分子。它們在某些PH范圍中主要作為兩性離子(具有零靜電荷的化合物)存在。表面活性劑可包括陰離子表面活性齊[J，比如SDS，陽離子表面活性劑，比如CTAC、HTAB和DTAB，非離子表面活性劑，比如Tween 20，和兩性離子表面活性劑，比如DAPS。在某些實施方案中，第一緩沖液還缺少以下中的至少一種三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、鉀，或鉀鹽。在某些實施方案中，被洗脫的靶應激蛋白復合物的混合物在制備物中提供，所述制備物包括不同熱休克蛋白種類的多個應激蛋白。因此，本發(fā)明的方法有利地提供了純化的應激蛋白復合物的混合物，其中該應激蛋白的混合物包括不同的應激蛋白復合物。即，應激蛋白復合物的應激蛋白組分是來源于多個(即，一個以上)熱休克蛋白種類或家族的混合物，例如，可以是來源于HSP60種類、 HSP70種類和/或HSP90種類、或來自存在于真核細胞或病原細胞中的任何其他熱休克蛋白種類的熱休克蛋白的混合物。特別地，存在于病原細胞或感染病原體的細胞的細胞裂解物中的任何應激蛋白復合物可通過本發(fā)明的方法來純化，并因此存在于最終的純化產(chǎn)物中。 該不同的熱休克蛋白的混合物是重要的，因為隨后作為疫苗組合物中的免疫原性決定物的純化的復合物的施用導致由被免疫的宿主針對所述疫苗組合物而引起的增強的免疫應答。 該增強的免疫應答賦予針對受治療者被免疫接種的病原體的提高的長期保護性免疫。因此，在某些方面，本發(fā)明延伸到從獲自病原細胞、感染病原體的細胞或腫瘤細胞的細胞裂解物中純化和/或分離多應激蛋白復合物的方法。通常，應激蛋白復合物包括不同應激蛋白種類的應激蛋白。所述純化的和/或分離的應激蛋白復合物，或包括其的制備物或混合物則可常被用作疫苗組合物中的免疫原性決定物以引起針對所述裂解物來源的病原體或腫瘤細胞、或針對感染所述裂解物來源的細胞的病原體的免疫應答和相關(guān)保護性免疫。因此，所述方法將包括以下的步驟(i)從包括所鑒定的靶應激蛋白復合物的源混合物中提供澄清的細胞裂解物；(ii)使所述細胞裂解物經(jīng)受利用離子交換的純化，其中所述細胞裂解物用包括至少一種二價陽離子的緩沖液緩沖至所述靶應激蛋白復合物的pi的2個單位內(nèi)的pH，并且其中使用鹽梯度來洗脫靶應激蛋白復合物，知(iii)獲得包括多應激蛋白復合物的富集的制備物。在某些實施方案中，純化和/或分離多應激蛋白復合物或包括其的制備物或混合物包括來源于不同應激蛋白家族的應激蛋白，因此純化的產(chǎn)物含有應激蛋白復合物的混合物，其中所述應激蛋白可來源于不同的應激蛋白家族，例如，純化的混合物可包括與肽形成復合物的多個不同的熱休克蛋白類型。在某些另外的方面，本發(fā)明延伸到純化的級分或混合物作為疫苗組合物中的免疫原性決定物來制備疫苗組合物的用途，所述純化的級分或混合物從純化方法中獲得，所述純化方法通常為離子交換純化，尤其是根據(jù)本發(fā)明的方法進行的離子交換色譜，或所述純化方法使用根據(jù)本發(fā)明的緩沖液。緩沖液
在某些另外的方面，本發(fā)明延伸到用于進行蛋白純化方法的緩沖液，所述蛋白純化方法尤其是離子交換，比如離子交換色譜，其中所述純化方法基于對來源于細胞或細胞培養(yǎng)物的蛋白混合物的純化、分離(isolation)和/或分離(s印aration)以分離和/或純化來自其的多應激蛋白復合物，其中所述緩沖液包括至少一種二價陽離子。在某些實施方案中，至少一種二價陽離子是鎂鹽，通常是氯化鎂。本文公開了另外適宜的二價陽離子。在某些實施方案中，緩沖液還包括二磷酸腺苷(ADP)。在某些實施方案中，緩沖液缺少以下中的至少一種或全部三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、鉀、或鉀鹽、離液劑、兩性電解質(zhì)和表面活性劑。疫苗組合物在不同的另外的方面，本發(fā)明延伸到疫苗組合物，或延伸到介導或引起免疫應答的組合物，其包括通過本發(fā)明的方法獲得的純化的HspC富集的裂解物或純化的和/或分離的多應激蛋白復合物或包括其的制備物或混合物。通常將所述疫苗組合物施用給哺乳動物，尤其是人類，以賦予針對病原體的保護性免疫。然而，由于公知的來自不同物種的應激蛋白之間的高水平的同源性，疫苗組合物可用來接種多種動物。因此，本發(fā)明的另一方面提供了疫苗組合物，所述疫苗組合物包括作為免疫原性決定物的通過本發(fā)明獲得的純化的HspC富集的洗脫級分或裂解物。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了疫苗組合物，其包括通過本發(fā)明的純化方法獲得的純化的應激蛋白-多肽復合物(HspC)富集的洗脫級分或裂解物，其中所述裂解物在包括至少一種二價陽離子的緩沖液中被緩沖。該緩沖液還可包括二磷酸腺苷。在某些實施方案中，緩沖液缺少 ATP和/或鉀。又一個另外的方面提供了用于在受治療者中引起免疫應答的疫苗組合物，其中所述免疫原性決定物是利用本發(fā)明的純化方法獲得的純化的和/或分離的多應激蛋白復合物或包括其的制備物或混合物。特別地，本發(fā)明的純化方法包括等電色譜，其使用了本文所描述的緩沖液以提高從源蛋白混合物中純化的應激蛋白復合物的穩(wěn)定性并因此提高其免疫原性。在某些實施方案中，純化的多應激蛋白復合物可以是分離的，從而疫苗復合物包括作為免疫原性決定物的純化的和分離的復合物作為疫苗組合物的免疫原性決定物。在某些另外的方面本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物或利用本發(fā)明的方法獲得的應激蛋白/肽復合物的純化的和/或分離的混合物用于藥物的用途。在某些另外的方面，本發(fā)明提供了純化的應激蛋白-肽復合物的混合物、或包括其的制備物在制備用于治療傳染病或癌性病癥或惡性病癥的藥物中的用途。在某些另外的方面，本發(fā)明提供了用于用來治療或預防傳染病或癌性病癥或惡性病癥的疫苗組合物的通過本發(fā)明的第一方面的方法純化的多應激蛋白-肽復合物或包括其的制備物或混合物。在某些實施方案中，純化的和分離的應激蛋白復合物或含有其的疫苗組合物作為預防性疫苗來施用。在某些另外的實施方案中，純化的應激蛋白復合物、包括其的制備物， 或含有其的疫苗組合物作為治療性疫苗來施用。在不同的另外的方面，本發(fā)明延伸到純化的和分離的應激蛋白復合物或包括其的制備物或混合物、或含有其的疫苗組合物作為加強疫苗以在宿主中增強針對病原體或癌性
10抗原產(chǎn)生的免疫應答的用途，先前已通過感染或由于初始疫苗的先前施用而使受治療者暴露于所述病原體或癌性抗原。本發(fā)明的組合物可以是凍干的形式或水性的形式，即，溶液或懸浮液。該類型的液體制劑允許直接從其包裝形式中施用所述組合物，而不需要在水性介質(zhì)中重新構(gòu)成，且因此對于注射是理想的。組合物可存在于藥瓶中，或它們可提供于即用的已填充的注射器中。 注射器可以與針頭一起提供或不與針頭一起提供。注射器將包括單次劑量的組合物，而藥瓶可包括單次劑量或多次劑量(例如，2劑量)。在某些實施方案中，配制根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物以用于在體內(nèi)施用給受治療者，從而其對于可接受的百分比的人類受治療者賦予了優(yōu)于每種抗原組分的血清保護標準的抗體滴度。這是評估疫苗在群體中的效力的重要檢驗。抗原以及高于其時認為宿主針對抗原進行血清轉(zhuǎn)變的相關(guān)抗體滴度是熟知的，且所述滴度由諸如WHO的機構(gòu)所公布。在一個實施方案中，具有統(tǒng)計學意義的受治療者的樣品的80%以上是血清轉(zhuǎn)變的，在另一個實施方案中，具有統(tǒng)計學意義的受治療者的樣品的90%以上是血清轉(zhuǎn)變的，在又一個實施方案中，具有統(tǒng)計學意義的受治療者的樣品的93%以上是血清轉(zhuǎn)變的，在又一個另外的實施方案中，具有統(tǒng)計學意義的受治療者的樣品的96%-100%是血清轉(zhuǎn)變的。選擇每個疫苗劑量中的抗原的量為誘導免疫保護應答而在典型的疫苗中無顯著的、嚴重的副作用的量。所述量將根據(jù)所用的特定的免疫原而不同。在某些實施方案中，疫苗組合物還可引起Thl淋巴細胞介導的免疫應答。當針對胞內(nèi)病原體保護受治療者時所述免疫應答是需要的。在某些實施方案中，包括本發(fā)明的純化的應激蛋白復合物的疫苗組合物在宿主中引起免疫應答，所述免疫應答包括細胞介導的免疫應答和體液(抗體介導的)免疫應答。在不同的另外的方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生疫苗組合物的方法，所述方法包括將本發(fā)明的純化的應激蛋白復合物或包括其的制備物或混合物與至少一種藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑相混合的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了用于用來治療或預防病原性疾病的藥物的疫苗組合物，所述病原性疾病比如通過病原細菌的感染導致的，所述病原細菌選自包括但不限于以下的組百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破傷風梭狀芽孢桿菌(Clostridium tetani)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、流感嗜血桿菌 b (Haemophilus influenzae b)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、 傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、霍舌L弧菌 (Vibrio Cholerae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了用于用來治療或預防病原性疾病的藥物的疫苗組合物，所述病原性疾病比如通過致病病毒或致癌病毒的感染所導致的，所述致病病毒或致癌病毒選自包括但不限于以下的組流感病毒、肝炎病毒、皰疹病毒、HIV、HPV、RSV、多瘤病毒、CMV、EBV、輪狀病毒、諾如病毒(Norovirus)和SARS病毒。在本發(fā)明的又一個實施方案中，提供了用于用來治療或預防癌癥和腫瘤性疾病的藥物的疫苗組合物。此外，還提供了針對由百日咳博德特氏菌、破傷風梭狀芽孢桿菌、艱難梭菌、白喉棒狀桿菌、流感嗜血桿菌b型、結(jié)核分枝桿菌和麻風分枝桿菌、傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、 肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌和病原性病毒和致癌性病毒導致的疾病免疫接種受治療者 (通常是人類)的方法，所述方法包括向宿主施用免疫保護劑量的本發(fā)明的疫苗。
每個疫苗劑量中抗原(即，免疫原性決定物)的量被選擇為在接種疫苗的受治療者中引起免疫保護應答而無顯著有害副作用的量。抗原的量根據(jù)所用的特異性抗原和其如何呈現(xiàn)而不同，然而，應理解針對本發(fā)明的純化的復合物介導的增強的免疫應答將意味著， 當與包括利用本領(lǐng)域中已知的純化方法獲得的相似的量的蛋白復合物的疫苗組合物相比時，將針對利用本發(fā)明方法純化的某一量的復合物介導增強的免疫應答。本發(fā)明還提供了純化的HspC富集的裂解物，或來自其的分離的應激蛋白在接種受治療者以引起針對病原體來源的傳染病或癌癥癥狀或惡性病癥免疫的方法中的用途。因此本發(fā)明的另一方面提供了針對病原體來源的傳染病或癌性病癥接種受治療者的方法，所述方法包括以下步驟-提供疫苗組合物，所述疫苗組合物包括作為免疫原性決定物的根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的純化的應激蛋白復合物富集的制備物，所述純化的應激蛋白富集的制備物來源于癌細胞、病原體、或感染針對其需要進行保護性免疫的病原體的細胞，并且包括作為純化的制備物中的混合物的不同的應激蛋白類型，和-以足以在受治療者中引起針對所述應激蛋白復合物富集的制備物的免疫應答的治療有效量或預防有效量向受治療者施用包括應激蛋白復合物富集的制備物的疫苗組合物。如本文所用的，術(shù)語“疫苗組合物”意為含有免疫原性決定物的任何組合物，所述免疫原性決定物以能夠更好地響應于隨后的攻擊、病原性感染或腫瘤生成的方式刺激免疫系統(tǒng)。將理解地是，疫苗通常含有免疫原性決定物和任選地含有佐劑，佐劑非特異性地起作用來增強對于免疫原性決定物的免疫應答。在一些實施方案中，受治療者是動物，通常是人。本發(fā)明的方法還可用來純化用于用來治療其他動物諸如馬、牛、山羊、綿羊、豬和鳥的疫苗組合物的應激蛋白復合物。在某些實施方案中，本發(fā)明的純化的應激蛋白復合物(HspC富集的制備物)來源的微生物病原體可根據(jù)其導致疾病或感染而選擇。本發(fā)明提供的疫苗組合物可預防性地或治療性地來使用。然而，本發(fā)明人認識到因為其生產(chǎn)的經(jīng)濟性和其引起針對肽、或肽和應激蛋白來源的病原體的保護性免疫應答的能力，組合物可特別用作預防性疫苗。本發(fā)明人已進一步地令人驚訝地鑒定了利用本發(fā)明的方法獲得的應激蛋白-肽復合物可作為“加強”接種疫苗，所述加強接種疫苗在受治療者中增強針對病原體或癌性病癥提供的免疫，其中，通過利用活疫苗或減毒疫苗進行接種或通過其中免疫原性決定物為應激蛋白-肽復合物的疫苗組合物進行接種來賦予初始免疫。因此，本發(fā)明的又一方面提供了加強在受治療者中針對病原體來源的傳染病或癌性病癥的保護性免疫應答的方法，其中所述保護性免疫應答已通過先前施用活疫苗或減毒疫苗、或先前施用包括來源于針對其需要進行免疫的病原體的肽的應激蛋白-肽復合物來引起，所述方法包括以下步驟-提供包括根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的應激蛋白/肽復合物富集的制備物的組合物，所述純化的應激蛋白/肽復合物富集的制備物來源于癌細胞、病原體感染的細胞或針對其需要進行保護性免疫的病原體，且包括作為純化的制備物中的混合物的不同的應激蛋白類型，和以足以在受治療者引起針對應激蛋白/肽復合物富集的制備物的免疫應答的量向受治療者施用包括應激蛋白/肽復合物富集的制備物的組合物。在某些另外的實施方案中，含有應激蛋白/肽復合物的本發(fā)明的疫苗可用來在先前利用其他亞單位疫苗、多重亞單位(multi-subunit)疫苗、碳水化合物疫苗或軛合物疫苗被免疫的動物中加強免疫應答。在另一個實施方案中，本發(fā)明的應激蛋白/肽復合物疫苗可用來在先前已經(jīng)利用核酸或活疫苗免疫的動物中加強針對靶抗原的免疫應答。在又一個實施方案中，含有應激蛋白/肽復合物的本發(fā)明的疫苗組合物提供在先前針對病原特異性抗原或癌癥特異性抗原被免疫的受治療者中介導的免疫應答的加強。在某些另外的方面中，本發(fā)明延伸到用于在動物中加強免疫應答的包括通過本發(fā)明純化的應激蛋白/肽復合物的疫苗組合物，其中所述動物先前已利用包括至少一種病原體來源的抗原、病原體，尤其是減毒病原體，或癌癥特異性抗原的疫苗組合物來接種。通常， 肽組分來源于相同的病原體或癌細胞，因此其提供了用于起始接種的免疫原性決定物。在某些另外的方面中，本發(fā)明延伸到用于在動物中加強免疫應答的包括通過本發(fā)明純化的應激蛋白/肽復合物的疫苗組合物，其中所述動物先前已暴露于存在于應激蛋白復合物中的病原體或癌癥表達抗原。在某些另外的實施方案中，本發(fā)明提供了用于制備諸如樹突狀細胞(DC)的細胞疫苗的組合物，所述樹突狀細胞已利用本發(fā)明的純化的應激蛋白/肽復合物富集的制備物來脈沖。向受治療者施用經(jīng)脈沖的樹突狀細胞將導致針對應激蛋白/抗原細胞復合物的T 細胞介導的反應。當治療患有癌性病癥或惡性病癥的受治療者時，所述治療可以是特別有效的。在所述實施方案中，通常，所述應激蛋白/肽復合物來源于癌細胞。在某些實施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物可用用于誘導免疫應答的組合物來替代，或被引起免疫應答的組合物替代，所述組合物通常包括與本文所描述的疫苗組合物中提供的那些免疫原性決定物相同的免疫原性決定物。


圖1顯示了來自BCG細菌細胞裂解物的蛋白復合物的純化的SDS-PAGE分析(A) 和通過蛋白質(zhì)印跡對這些樣品的Hsp71蛋白和Hsp65蛋白的分析(B)。Vl是來自BCG的親代高速離心裂解物，其被進一步處理而產(chǎn)生V2——利用常規(guī)等電聚焦方法純化的HspC，* V3——利用本發(fā)明的第一方法純化的HEP。圖2顯示了與親代裂解物(LSS)和利用常規(guī)等電聚焦方法分離的HspC(IEF)相比較，利用本發(fā)明的第一方法分離自BCG的HEP(IEX)的免疫原性。圖3顯示了通過逐步鹽梯度來洗脫的來自腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白復合物的純化的SDS-PAGE分析(A)，和通過蛋白質(zhì)印跡對這些樣品的Hsp70蛋白、Hsp65蛋白和PorA 蛋白的分析(B)。圖4顯示了與利用常規(guī)等電聚焦方法從腦膜炎奈瑟氏球菌分離的HEP(IEF HspC) 相比較，利用本發(fā)明的基于等電色譜的純化方法分離自腦膜炎奈瑟氏球菌的HEP(IEC HspC)的免疫原性。雖然兩種HspC顯示了比目前的外膜運載體疫苗(H44/760MV)更好的針對異源菌株的調(diào)理活性，IEC HspC顯示了比IEF HspC更好的跨菌株免疫原性。圖5A顯示了在ADP+ 二價陽離子存在下從BCG細菌細胞裂解物純化的HEP的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1顯示了考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE，而泳道2至4分別顯示了通過蛋白質(zhì)印跡對Hsp65、Hsp71和Ag85的識別。圖5B顯示了在二價陽離子(BCG 001/09)，加 ADP (HspC Vac)或ATP (BCG 002/09)存在下從BCG細菌細胞裂解物純化的HEP的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。圖6顯示了分離自BCG的HEP的免疫原性。圖6A顯示了在不存在ADP+ 二價陽離子(IECO疫苗接種))或存在ADP+二價陽離子(記以2疫苗接種)+40 /1%2+)時，由分離自BCG細菌細胞裂解物的HEP疫苗誘導的細胞介導的免疫，與利用活BCG(BCG 8周)的接種與利用BCG初始免疫和HspC加強(BCG/IEC)的接種相比較。圖6B顯示了在ADP和二價陽離子(Vl)存在下或ATP和二價陽離子(V2)存在下或單獨的二價陽離子(V3)存在下，由分離自BCG細菌細胞裂解物的HEP疫苗誘導的Thl偏向的體液免疫，和對于通過利用HspC 疫苗加強的(BCG和VI)目前的活BCG疫苗(BCG)的抗體響應的顯著增強。圖7A顯示了在利用活TB攻擊的HEP免疫的動物中肺部菌落計數(shù)的減少。利用作為陰性對照的鹽水、活BCG細菌(BCG)、在不存在ADP+二價陽離子(IEC)或存在ADP+二價陽離子(IEC)時分離自BCG細菌細胞裂解物的HEP對動物進行免疫，或利用活BGC進行初始免疫并利用通過本發(fā)明的改良的方法分離的HEP進行加強免疫(BCG+IEC)。圖7B顯示了在利用HEP免疫或加強并利用活TB攻擊的動物中肺部菌落計數(shù)的減少。用作為陰性對照的鹽水、活BCG疫苗(BCG)、在存在ADP加二價陽離子(Vl)或單獨的二價陽離子(V3)或二價陽離子加ATP以破壞HspC復合物(V2)時分離自BCG細菌細胞裂解物的HEP來免疫動物，或用BCG進行起始免疫并用HEP疫苗進行加強免疫(BCG+V1)。圖8顯示了不存在ADP和二價陽離子(泳道1至3)時和存在ADP和二價陽離子 (泳道4至6)時，對從腦膜炎奈瑟氏球菌中純化的HEP中的Hsp60和Hsp70的考馬斯藍染色的SDS-PAGE(泳道1，4)和蛋白質(zhì)印跡分析。圖9顯示了通過逐步鹽梯度洗脫對來自CHO細胞的HEP的純化的考馬斯藍染色的SDS-PAGE分析(A)，和通過蛋白質(zhì)印跡對這些樣品的Hsp70的分析(B)和Hsp60的分析 (C)。泳道1 分子量標記物，泳道2 流經(jīng)，泳道3 洗滌，泳道4 150mM洗脫，泳道5 150mM 洗脫，泳道6 :250mM洗脫，泳道7 :250mM洗脫，泳道8 :350mM洗脫，泳道9 :350mM,泳道10 500mM洗脫，泳道11 :500mM洗脫，泳道12 IM洗脫。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于純化包括復合于來自通常為細胞裂解物的源混合物的肽或肽片段的應激蛋白的復合物的混合物的方法。本發(fā)明的改良的方法提供了利用基于離子交換的方法純化的蛋白復合物，而在純化方法中不需要利用諸如離液劑、表面活性劑和兩性電解質(zhì)(安福靈)的化學物質(zhì)。所述方法是有利的，因為藥物制備物中外來成分的存在一般是不希望的，因為其導致應激蛋白/肽復合物的不穩(wěn)定性和解離，這可導致應激蛋白復合物具有較低的免疫原性。因此，利用本發(fā)明的方法獲得的純化的復合物可用來產(chǎn)生改良的疫苗制備物，其在施用所述疫苗組合物的受治療者中引起增強的免疫應答。并且，已知ATP 導致應激蛋白/肽復合物的解離。然而，在不存在ATP時，一般認為HspC是非常穩(wěn)定的，即使在其純化時使用了諸如去垢劑和7M尿素的離液劑。本發(fā)明人已令人驚訝地鑒定了在純化過程中對于應激蛋白復合物的穩(wěn)定性的需要，以產(chǎn)生比利用諸如傳統(tǒng)等電聚焦(IEF)的純化方法獲得的相似的復合物更具免疫原性的HspC。本發(fā)明人已提供了改良的離子交換色譜方法，其不僅由于緩沖液中存在至少一種二價陽離子，比如鎂鹽而防止了應激蛋白復合物的解離，而且還任選地存在以使應激蛋白復合物的解離最小化的濃度存在于緩沖液中的腺苷二磷酸。穩(wěn)定的應激蛋白復合物的存在，以及不同類型的應激蛋白的混合物的提供，提供了可在疫苗組合物中用作免疫原性決定物且將引起增強的免疫應答的混合物，所述增強的免疫應答超過利用本領(lǐng)域中已知的方法純化的應激蛋白復合物引起的免疫應答。本發(fā)明的方法還有利地在于，其提供了比先前所用的諸如等電聚焦的蛋白純化技術(shù)具有更高容量的純化方法，以用于純化應激蛋白復合物，從而可實現(xiàn)大規(guī)模的、商業(yè)上可行的、成本有效的含有所述復合物的疫苗的產(chǎn)生。并且，本發(fā)明人已令人驚訝地鑒定了利用本發(fā)明的方法純化的應激蛋白復合物比利用諸如傳統(tǒng)等電聚焦(IEF)的純化技術(shù)獲得的相似復合物更具免疫原性。本發(fā)明的改良的方法提供了待利用產(chǎn)生顯示增強的免疫的HEP的特定緩沖液組成和條件純化的蛋白復合物。因此，通過本發(fā)明的方法獲得的HspC復合物比利用本領(lǐng)域中已知的標準純化方法純化的那些更具免疫原性，并可用來產(chǎn)生改良的疫苗制備物。源混合物本發(fā)明的應激蛋白通常從源混合物中純化或分離。在某些實施方案中，源混合物是包括至少一種應激蛋白/肽片段復合物(需要對其進行純化)和一種或多種污染物的混合物。存在于源混合物中的污染物的非限制性例子可包括除應激蛋白或應激蛋白復合物之外的宿主細胞蛋白、宿主細胞代謝物、宿主細胞組成型蛋白、核酸、內(nèi)毒素、化學產(chǎn)物相關(guān)的污染物、脂質(zhì)、培養(yǎng)基添加劑和培養(yǎng)基衍生物。在某些實施方案中，源混合物是蛋白混合物，或來源于細胞裂解物或細胞勻漿物。 在某些實施方案中，細胞裂解物或勻漿物來源于原核細胞、通常為病原性原核細胞，其中所述原核細胞可能是胞內(nèi)病原性細菌或胞外病原性細菌。在某些另外的實施方案中，細胞裂解物可來源于感染原核細胞的細胞。在另外的實施方案中，細胞裂解物或勻漿物來源于真核細胞，比如感染病原體的真核細胞，所述病原體比如原核病原體。在某些實施方案中，細胞裂解物或勻漿物來源于腫瘤細胞、癌細胞團或組織，或來源于活檢的細胞。在某些實施方案中，細胞為來源于細胞培養(yǎng)的細胞，其中細胞被轉(zhuǎn)化或被轉(zhuǎn)染。在某些另外的實施方案中，細胞裂解物或勻漿物可從宿主細胞或病原性生物中直接獲得，或從感染病原性生物的細胞中直接獲得。病原性生物可選自由以下組成的但不限于以下的組(i)病毒，例如，流感病毒、乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、肝炎病毒(甲型、乙型或丙型)、HIV、麻疹病毒和類似的病毒，(ii)胞內(nèi)原生動物，比如錐蟲；或(iii)感染原核生物的細胞，所述原核生物尤其是胞內(nèi)細菌，比如分枝桿菌屬物種或奈瑟氏球菌屬物種的細菌?？衫帽景l(fā)明的方法純化的源混合物的另外的例子包括，收獲的細胞培養(yǎng)液體、細胞培養(yǎng)上清液和條件細胞培養(yǎng)上清液。并且，細胞裂解物可來源于腫瘤細胞。在其中源混合物來源于細胞裂解物或包括細胞裂解物的實施方案中，裂解物可通過本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的任何適宜的方式來獲得，包括但不限于(i)機械方式，比如超聲處理、空化作用(cavitation)、凍融循環(huán)，和使用細胞勻漿器諸如弗氏細胞壓碎器 (French press)、Dounce勻漿器或馬達驅(qū)動的玻璃/TEFLON勻漿器；(ii)利用去垢劑進行細胞裂解；或(iii)通過按需要將細胞與低滲緩沖液或高滲緩沖液相接觸而進行滲透性裂解。在中使用細胞裂解來產(chǎn)生源混合物的某些實施方案中，還可將蛋白酶抑制物添加到源混合物中。
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在某些實施方案中，其中源混合物來源于勻漿的細胞制備物，比如細胞裂解物或組織樣品，可將勻漿物離心至少一次，例如，在10，OOOg下離心30分鐘。然后可收集上清液并對其進行進一步離心，或準備利用本文所描述的基于離子交換的方法對其進行純化。在某些另外的實施方案中，離心步驟可用過濾步驟來替換或完成。在某些實施方案中，源混合物是蛋白的蛋白混合物，通常為包括多種蛋白的溶液。 在某些另外的實施方案中，源混合物是來源于癌細胞、病原性生物、感染病原性生物的細胞、或包括病原性生物的細胞培養(yǎng)物或感染其的細胞的細胞裂解物。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法可用來從天然來源或生物合成來源提取、純化和/或獲得蛋白復合物。在某些另外的實施方案中，可使用該方法來從細胞培養(yǎng)或其它蛋白混合物中純化合成的應激蛋白復合物或重組的應激蛋白復合物。在某些實施方案中，純化的復合物存在于至少一種級分中，比如洗脫級分。通常， 所述至少一種級分包括一種或多種應激蛋白/肽復合物。所述級分可稱作純化的產(chǎn)物或純化產(chǎn)物，且還可稱作熱休克蛋白/抗原肽復合物(HspC)富集的制備物(HEP)。不希望受理論束縛地，本發(fā)明人已鑒定，在施用疫苗組合物的受治療者中可引起增強的免疫應答，所述疫苗組合物包括作為免疫原性決定物的應激蛋白/抗原肽片段復合物，所述應激蛋白/抗原肽片段復合物來源于癌細胞、病原性細胞、感染病原性生物的細胞、或經(jīng)遺傳修飾而表達來源于癌細胞或在宿主中導致傳染病的病原體的異源蛋白的原核細胞或真核細胞，其中所述異源蛋白導致當向受治療者施用時導致待針對其的免疫應答。 因此，在某些實施方案中，純化的產(chǎn)物通常包括抗原肽/熱休克蛋白復合物的混合物。應激蛋白在某些實施方案中，應激蛋白復合物可以是包括復合于肽片段的熱休克蛋白的熱休克蛋白復合物(HspC)。在某些實施方案中，熱休克蛋白可以是來源于待純化的細胞裂解物的任何適宜的熱休克蛋白。在某些實施方案中，熱休克蛋白可選自包括但不限于以下的組的種類中的任何一種hsp20-30kD ；hsp40 ；hsp60 ；hsp70 ；hsp90和hsplOO。在某些另外的實施方案中，應激蛋白可以是分類為伴侶蛋白的蛋白。所述蛋白可包括但不限于選自由以下組成的組的蛋白DnaK、DnaJ, GroEL, GroES, hspX、acr2、AAA+、clpA/B、HtpG、TRIC、CCT, IbpA、IbpB、鈣網(wǎng)織蛋白、hsp40、hsp70、hsp72、hsp90、grp94、grp75、BiP/grp78、grp75/mt、gp96 禾口小型 hsp。在某些實施方案中，靶應激蛋白復合物包括來源于宿主細胞的熱休克蛋白/抗原肽片段復合物，所述宿主細胞經(jīng)遺傳修飾以組成型地表達應激蛋白基因，和/或表達異源蛋白，比如抗原肽或肽片段。在某些另外的實施方案中，細胞可以是表達異源基因的宿主細胞，例如感染包括感興趣的抗原基因的桿狀病毒載體構(gòu)建物的昆蟲細胞。在另一些實施方案中，細胞可以是來源于人類或動物受治療者的癌細胞。在某些實施方案中，其中提供了復合物的混合物，這可包括一個特定家族的熱休克蛋白，例如，hsp70家族或hsp60家族，盡管優(yōu)選地是，混合物包括來源于不同家族的不同熱休克蛋白復合物。本發(fā)明的方法將提供用于純化包括復合于(抗原)肽片段的熱休克蛋白的所有復合物的方法，而與抗原肽或肽片段的身份、分子量或大小無關(guān)。在某些另外的實施方案中，熱休克蛋白/抗原肽復合物(HspC)富集的制備物(HEP)包括來自不同應激蛋白家族或種類的熱休克蛋白，比如hsp60、hsp65、hsp70和 hsp90，所述家族利用本發(fā)明的方法作為混合物被共純化。在某些另外的實施方案中，熱休克蛋白/抗原肽復合物(HspC)富集的制備物 (HEP)可以是特定分子量的熱休克蛋白/肽片段復合物。在某些實施方案中，應激蛋白復合物具有在50KDa至900KDa范圍內(nèi)的分子量?？乖钠卧谀承嵤┓桨钢?，與應激蛋白結(jié)合以形成應激蛋白復合物(HspC)的多肽是肽片段，即，肽片段是較大的多肽或蛋白的片段。通常，肽是抗原性肽，即，在施用所述肽的宿主細胞中介導針對多肽的促炎反應。肽或抗原肽將適宜于在施用應激蛋白復合物的宿主中產(chǎn)生針對其的T細胞介導的(細胞介導的)免疫應答或抗體介導(體液)的免疫應答。通常，多肽來源于病原體，或感染需要針對其進行免疫應答的病原性細胞的細胞。在某些另外的實施方案中，多肽來源于惡性細胞或癌細胞，或含有其的細胞裂解物，其中多肽或肽片段是腫瘤特異性抗原。在某些實施方案中，肽以非共價的方式復合于應激蛋白。在某些另外的實施方案中，通過共價鍵的方式將肽復合于應激蛋白。在某些實施方案中，肽片段是來源于病原性生物的抗原性肽片段，其中所述病原性生物通常在宿主中導致傳染病。在某些實施方案中，病原性細胞可以是原核細胞，比如革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌或胞內(nèi)細菌病原體或胞外細菌病原體。在某些另外的實施方案中，病原體是病毒病原體，或來源于其的肽片段。在某些另外的實施方案中，病原體可以是原生動物，寄生蟲或真菌，比如酵母。在某些實施方案中，抗原性肽來源的病原性細胞可來源于原核生物，所述原核生物選自由以下組成但不限于以下的組埃希氏菌屬(Escherichia)、鏈球菌屬 (Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、博德特氏菌屬(Bordetella)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria) > Bfil 菌屬(Haemophilus)、放線菌屬(Actinomycetes)、鏈霉菌屬(Streptomycetes)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、弗朗西斯氏菌屬(Fancisella)、巴斯德桿菌屬(Pasturella)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、不動桿菌屬 (Acinetobacter)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、鏈桿菌屬Gtr印tobacillus)、利斯特氏菌屬(Listeria)、鞘桿菌屬(Calymmatobacterium)、布魯氏菌屬(Brucella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、密螺旋體屬(Tr印onema)、沙門氏菌屬(Salmonella)、克雷伯氏菌(Kleibsiella)、弧菌屬(Vibrio)、變形桿菌屬(Proteus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、 包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(L印tospira)、螺菌屬(Spirillum)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、志賀氏菌屬(Shigella)、軍團菌屬(Legionella)、假單胞菌屬O^seudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、立克次氏體屬(Rickettsia)、衣原體屬 (Chlamydia)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)和枝原體屬(Mycoplasma)的成員。在某些實施方案中，抗原肽片段可以是病毒肽。肽可能來源的病毒可以選自由以下組成但不限于的組人類免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、任何其他肝炎相關(guān)病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、尤其是高風
17險的原癌人類乳頭瘤病毒類型、Kaposi氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)(還稱作人類皰疹病毒-8(HHV-8))，單純皰疹病毒(HSV)(任何亞型)、呼吸道合胞病毒(RSV)和相關(guān)的呼吸道病毒，流感病毒包括禽流感病毒和豬流感病毒，尤其是如果當這些可傳染至人類時，冠狀病毒包括SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)、鼻病毒、腺病毒、SIV、輪狀病毒、人乳頭瘤病毒、 蟲媒病毒、麻疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、風疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、巨細胞病毒、 水痘帶狀皰疹病毒、水痘病毒、漢坦病毒和任何新興病毒(emergent virus)，尤其是依波拉病毒、馬爾堡病毒、西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)，圣路易斯腦炎病毒(St Louis Encephalitis virus，SLEV)、裂谷熱病毒(Rift Valley Fever virus，RVFV)和布尼亞病毒科的其他成員。在某些實施方案中，其中抗原肽片段來源于原生動物病原體，原生動物通?？梢詾榘麅?nèi)原生動物，比如利什曼蟲或錐蟲。在其中抗原肽片段來源于酵母或真菌的實施方案中，所述真菌可來源于選自包括以下的組的屬枝頂孢屬(Acremonium)、鏈格孢屬(Alternaria)、淀粉霉屬 (Amylomyces)、Arthoderma、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、芽生裂殖菌屬(Blastochizomyces)、葡萄孢屬(Botrytis)、假絲酵母屬(Candida)、枝孢屬(Cladosporium)、隱球菌屬(Crytococcus)、網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)、金孢子菌屬(Emmonsia)、鐮孢菌屬(Fusarium)、地絲菌屬(Geomyces)、地霉屬(Geotrichum)、微 ？包子屬(Microsporum)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉菌屬 (Penicillium)、倚囊霉屬(Pilaira)、馬拉色菌屬(Pityrosporum)、根霉屬(Rhizopus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、酵母屬(Saccharomyces)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、毛蘚菌屬 (Trichophyton)、絲孢酵母屬(Trichoporon)或耶羅威亞酵母屬(Yarrowia)。在某些實施方案中，抗原肽片段可來源于腫瘤細胞。在這樣的實施方案中，通?？乖钠问悄[瘤特異性抗原或腫瘤特異性抗原的片段。在某些實施方案中，腫瘤細胞可來源于癌性病癥或惡性病癥，所述癌性病癥或惡性病癥選自包括但不限于以下的組急性和慢性骨髓性白血病(AML，CML)、濾泡性非霍奇金淋巴瘤、惡性黑素瘤、毛細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、伴有類癌瘤綜合征的類癌瘤和肝轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AIDS相關(guān)Kaposi氏肉瘤、腎細胞癌、大腸腺癌、頭頸鱗狀細胞癌。并且，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知的是，一些傳染病可在其感染的受治療者中導致癌癥。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法純化的復合物的施用可用來治療或預防癌癥，所述復合物中的多肽來源于傳染病。例如，包括來源于人類乳頭瘤病毒的多肽的復合物可用來在適宜的受治療者中治療或預防子宮頸癌。在某些另外的實施方案中，復合于應激蛋白的抗原肽片段是通過重組方法在宿主細胞中表達的異源蛋白或肽片段，所述重組方法例如通過導入到載體或相似構(gòu)建體的宿主細胞。在某些實施方案中，異源抗原可來源于細菌病原體、病毒病原體，或是腫瘤特異性抗原。在某些另外的實施方案中，宿主細胞可以是被胞內(nèi)病原體感染的真核細胞。在這樣的實施方案中，應激蛋白復合物可包括來源于宿主細胞的熱休克蛋白，其復合于來源于胞內(nèi)病原體的抗原肽片段，或包括二者均來源于胞內(nèi)病原體的應激蛋白和肽片段。在本發(fā)明的某些實施方案中，源混合物是細胞裂解物，其產(chǎn)生自暴露于誘導適宜于導致應激蛋白(通常是熱休克蛋白)的誘導型表達(與組成型表達相對)的刺激的應激下的細胞群體。在某些實施方案中，誘導刺激的應激選自包括但不限于以下的組熱休克、 滲透壓休克、壓力和營養(yǎng)匱乏。在某些另外的實施方案中，應激誘導通過對細胞進行遺傳修飾以導致熱休克蛋白基因的組成型表達來實現(xiàn)。在一個這樣的實施方案中，遺傳修飾是在微生物病原體中阻抑應激蛋白表達的抑制基因的失活，所述抑制基因例如hspR和HrcA抑制基因。其它這樣的遺傳修飾描述于W02002/020045和其中的參考文獻中。對于應激蛋白的非遺傳誘導，誘導應激蛋白的最佳條件可易于通過簡單試驗來確定，且關(guān)于利用常規(guī)技術(shù)的應激蛋白生成水平來評價應激刺激改變的作用的誤差， 所述常規(guī)技術(shù)比如Current Protocols in Immunology (最新免疫學實驗方案)，Wiley Interscience，1997中描述的那些。其他這樣的條件描述于WO 2001/013944和其中的參考文獻中。在一個實施方案中，利用本發(fā)明的方法純化的至少一種熱休克蛋白/抗原肽復合物(HspC)富集的制備物(HEP)包括熱休克蛋白/抗原肽片段復合物(HspC)，其包括但不限于 hspC65、hspC70、hspC90 和 hspClOO。離子交換條件本發(fā)明的方法基于利用基于離子交換色譜的方法分離蛋白。然而，本文描述的方法已通過去除通常存在于緩沖液中的可能對蛋白結(jié)構(gòu)和完整性具有不利影響、可導致蛋白復合物的解離或部分解離，或可導致純化的級分中存在污染物的化學物而改良，超越了本領(lǐng)域中目前所用的標準離子交換色譜方案和方法。因此該方法使用了修改的離子交換方法以產(chǎn)生包括應激蛋白復合物的富集的制備物或純化的制備物，其還可被稱作HEP(HspC富集的制備物)。離子交換色譜(IEC)基于存在于樣品混合物(細胞裂解物)中的蛋白和固定于所用的樹脂或基質(zhì)上的電荷之間的電荷-電荷相互作用。離子交換色譜可采取陽離子交換色譜的形式，其中帶正電荷的離子與帶負電荷的樹脂結(jié)合，或采取陰離子交換色譜的形式，其中蛋白與具有負電荷的離子結(jié)合，并且固定的官能基質(zhì)或樹脂具有正電荷。將存在于樣品混合物中的蛋白與樹脂結(jié)合后，利用起始緩沖液洗滌柱子以使其平衡。通常該緩沖液是低離子強度的。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明人采用了使用包括至少一種二價陽離子的緩沖液， 所述二價陽離子諸如鎂或錳，其通常以鹽形式來提供，比如氯化鎂。緩沖液還可包括二磷酸腺苷，其以將顯著抑制應激蛋白/肽復合物的解離的水平存在于緩沖液中。所述緩沖液已由本發(fā)明人鑒定為保護應激蛋白復合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，因為所述緩沖液防止純化過程中應激蛋白-肽復合物的解離。本發(fā)明的方法提供了，通過改變柱中存在的鹽梯度將結(jié)合的應激蛋白復合物洗脫在級分中，所述改變通常通過使用第二緩沖液來進行，所述第二緩沖液比如氯化鈉或基于氯化鈉的溶液。收集洗脫的級分，且在不同的Pl (等電點)下洗脫的級分含有不同應激蛋白復合物。因為已經(jīng)鑒定了所期望的蛋白復合物的pi，含有感興趣的復合物的洗脫級分將是可易于鑒定的。通常本發(fā)明的方法將導致應激蛋白復合物的純化的(或分離的)混合物。與導致一個家族(比如HSP70)的應激蛋白復合物的回收的基于傳統(tǒng)離子交換色譜的純化方法不同，本發(fā)明的方法提供了純化的產(chǎn)物(其也可稱作分離的產(chǎn)物)， 其中存在不同應激蛋白的混合物。例如，如果細胞裂解物來源于感染病原體的真核細胞，則所得的純化的產(chǎn)物可包括應激蛋白復合物，其中應激蛋白為HSP60或HSP70中的至少2種。 發(fā)現(xiàn)存在于細胞裂解物中的任何其他熱休克蛋白也可存在于純化的產(chǎn)物中。并且，如果在制備細胞裂解物的過程中還裂解了感染真核細胞的病原體，則本發(fā)明的方法還允許病原體來源的應激蛋白/肽復合物存在于純化的產(chǎn)物中。例如，純化的產(chǎn)物可包括應激蛋白復合物的混合物，其中應激蛋白可選自包括以下的組HSP40、HSP60、HSP70、HSP84、HSP90、Dna-K 禾口 Dna-J0等電點(pi)是特定分子諸如本發(fā)明的蛋白復合物沒有凈電荷時的pH。蛋白或蛋白復合物的Pi值可從其一級序列來確定，或利用常規(guī)的等電聚焦技術(shù)和商業(yè)上可獲得的設(shè)備經(jīng)驗獲得。蛋白復合物的Pl值可用來影響特定PH處的蛋白的溶解度。蛋白分子含有酸性官能團和堿性官能團二者。并且，氨基酸可以是帶正電荷的、帶負電荷的或中性的。這些因素賦予蛋白其整體電荷。在低于其Pl的PH處，蛋白攜帶凈正電荷。在高于其pi的pH 處，蛋白攜帶凈負電荷。蛋白在等于其Pl的PH下在鹽溶液中具有最小的溶解度。這可導致蛋白復合物從溶液中沉淀出來。因此可期望地是，當根據(jù)本發(fā)明的方法改變鹽梯度時，PH 不會從其起始PH下降，因為這可導致蛋白復合物從溶液中沉淀出來。因此，通常設(shè)定pH之后，將不再使其升高。在某些實施方案中，鹽梯度的升高導致PH的升高。這樣，在一些實施方案中，方法包括改變柱基質(zhì)中所用的緩沖液的鹽濃度，例如通過使用包括氯化鈉的緩沖液來進行改變。通常緩沖液中的鹽梯度的此改變導致應激蛋白復合物被洗脫，通常被洗脫在與鹽濃度的改變相對應的級分中。因此，在某些實施方案中，漸進式添加洗脫緩沖液提供了鹽梯度。通常，洗脫緩沖液含有氯化鈉(NaCl)，且可通過改變基質(zhì)所暴露的洗脫緩沖液中的氯化鈉的存在來改變鹽梯度。在某些實施方案中，氯化鈉可以150mM、250mM、350mM或500mM的濃度存在于緩沖液中。在某些實施方案中，洗脫緩沖液提供了 PH梯度，其可隨緩沖液的成分的改變而改變。在某些實施方案中，洗脫緩沖液包括至少一種二價陽離子，和任選地二磷酸腺苷。在某些實施方案中，應激蛋白復合物存在于被洗脫的收集的級分中，且具有從Pl 4到pi 8的范圍內(nèi)的pi。在某些實施方案中，可首先通過等電聚焦來確定待純化的應激蛋白的pi。在某些實施方案中，不在尿素或相似的化合物或溶液存在下進行純化方法(即， 在不存在尿素或相似的混合物或溶液時進行純化方法)。在某些另外的實施方案中，在純化方法中不使用兩性電解質(zhì)、離液劑和/或表面活性劑。在某些優(yōu)選的實施方案中，緩沖液含有至少一種二價陽離子且還可含有二磷酸腺苷。通常該方法包括以下步驟(i)將源混合物應用于離子交換基質(zhì)，( )調(diào)節(jié)pH，改變跨越離子交換基質(zhì)的鹽梯度，和(iii)收集洗脫的級分，其中所述級分包括純化的或富集的應激蛋白復合物，所述純化的或富集的應激蛋白復合物的洗脫通過在特定的條件下改變鹽梯度而發(fā)生。在某些實施方案中，基質(zhì)是樹脂。在另外的實施方案中，基質(zhì)是膜。通?；|(zhì)包括帶電粒子。在某些實施方案中，離子交換利用離子交換膜吸附器(absorber)來進行，所述離子交換膜吸附器用來將復合蛋白混合物分離成堿性級分和酸性級分。本發(fā)明人已鑒定該離子交換的形式導致方便、快捷和可重復的方法，且因此所述方法可產(chǎn)生持續(xù)高產(chǎn)量的保持其完整性的穩(wěn)定的應激蛋白復合物，這將是產(chǎn)生商業(yè)品質(zhì)的疫苗制備物所需，所述疫苗制備物包括作為免疫原性決定物的蛋白組分，比如應激蛋白-肽復合物。并且，在某些實施方案中，其中應激蛋白復合物用作疫苗組合物的制備物中的免疫原性決定物，并且其中在包括至少一種二價陽離子、和在某些實施方案中包括二磷酸腺苷的緩沖液的存在下純化應激蛋白復合物，本發(fā)明人已鑒定，所述應激蛋白復合物具有介導或增強通過使用上述疫苗引起的免疫應答的較強能力，因為復合物保持了更穩(wěn)定的狀態(tài)，即，復合物不會解離以變?yōu)榉蛛x的應激蛋白和肽片段。在某些實施方案中，緩沖液缺少三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、鉀、或鉀鹽、離液劑、兩性電解質(zhì)和表面活性劑中的至少一種。在一個實施方案中，利用技術(shù)人員已知的任何適宜的洗脫緩沖液可將熱休克蛋白 /抗原肽復合物(HspC)富集的制備物(HEP)從離子交換色譜介質(zhì)中洗脫以維持蛋白完整性。通常洗脫緩沖液包括鹽，比如如前文所描述的氯化鈉。洗脫緩沖液還可包括磷酸緩沖液或基于TRIS的緩沖液，醋酸鹽、檸檬酸鹽或氫離子緩沖液。如本文所用的，術(shù)語“離子交換”和“離子交換色譜”指色譜過程，其中在pH和電導率的適當條件下，將感興趣的可離子化的溶質(zhì)(例如，在細胞裂解物中提供的感興趣的蛋白復合物)與連接于固相離子交換物質(zhì)的帶相反電荷的配體相互作用，從而感興趣的溶質(zhì)比混合物中的溶質(zhì)雜質(zhì)或污染物更多地或更少地與帶電荷的化合物非特異性地相互作用。 可將混合物中的污染溶質(zhì)比感興趣的溶質(zhì)更快地或更慢地從離子交換物質(zhì)的柱中洗滌，或結(jié)合至樹脂或從樹脂中排出?！半x子交換色譜”特異性地包括陽離子交換色譜、陰離子交換色譜和混合型色譜。在某些實施方案中，離子交換色譜介質(zhì)包括離子交換柱。通常，離子交換柱包括高流動基質(zhì)，比如瓊脂糖或瓊脂糖凝膠高流動基質(zhì)。任選地，高流動基質(zhì)包括表面延伸齊U，比如無動物葡聚糖。適宜的離子交換介質(zhì)包括陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂二者，以及包括用季銨鹽和磺酸基團衍生的那些的柱，例如CAPT0Q 柱和CAPT0S 樹脂(GE Healthcare Limited)。在另外的實施方案中，離子交換色譜介質(zhì)包括混合的多重離子交換樹脂，例如，Capto MMC 柱和 CAPT0 粘附柱(Adhere column) (GE Healthcare)。在某些實施方案中，細胞裂解物被緩沖交換到50mM的磷酸緩沖液pH6. 8中。在某些實施方案中，離子交換柱包括高流動基質(zhì)，優(yōu)選地為瓊脂糖高流動基質(zhì)。在某些實施方案中，高流動基質(zhì)包括表面延伸劑，例如，無動物葡聚糖，和Q配體，例如，季銨鹽。短語“離子交換物質(zhì)”指帶負電荷的固相(即，陽離子交換樹脂)或帶正電荷的固相(即，陰離子交換樹脂)。在一個實施方案中，可通過將一個或多個帶電荷的配體(或吸附劑)結(jié)合到固相上來提供電荷，例如，通過共價連接來結(jié)合?？蛇x地，或另外地，電荷可以是固相的內(nèi)在屬性(例如，在二氧化硅的情況下，其具有總負電荷)。在某些實施方案中，其中離子交換色譜是陽離子交換色譜，陽離子交換色譜步驟使用的配體選自包括但不限于以下的組磺酸鹽、羧酸鹽、羧甲基磺酸、磺酸異丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、sulphoxyethyl和正磷酸鹽?！瓣栯x子交換樹脂”指帶負電荷的固相，且其具有游離的陽離子以用于與流過或經(jīng)過固相的水溶液中的陽離子進行交換。可使用任何與固相連接的適宜于形成陽離子交換樹脂的帶負電荷的配體，例如，羧化物、磺酸鹽和本文以下所描述的其他配體。商業(yè)上可獲得的陽離子交換樹脂包括，但不限于，例如，具有基于磺酸的基團的那些(例如，來自 GE Healthcare 的 MonoS、MiniS、Source 15S 和 30S，SP Sepharose FAST FLOW , SP 瓊月旨糖高效液相(SP Sepharose High Performance)，來自 iTosoh 的 iToyopearl SP-650S 和 SP-650M, ^ g BioRad ^ Macro-Prep High S^g Pall Technologies ^ Ceramic HyperD
21S、Trisacryl M和LS SP和Spherodex LSSP)；基于磺基乙基的基團(例如，來自EMD的 Fractogel SE，或來自 Applied Biosystems 的 Poros S—10 禾口 S—20)；基于磺丙基的基團 (例如，來自 iTosoh 的 TSK Gel SP 5PW 和 SP-5PW-HR,來自 Applied Biosystems 的 Poros HS-20和HS 50)；基于磺異丁基的基團(例如，來自EMD的Fractogel EMD S03)；基于磺乙基的基團(例如，來自Whatman的SE52、SE53和Express-Ion S)，基于羧甲基的基團(例如，來自 GE Healthcare 的 CM Sepharose Fast Flow,來自 Biochrom Labs Inc. 白勺 Hydrocell CM, ^ g BioRad ^ Macro-Prep CM， 自 Pall Technologies ^ Ceramic HyperD CM, Trisacryl M CM, Trisacryl LS CM，自 Millipore 白勺Matrex Cellufine C500 和 C200，來自 Whatman 的 CM52，CM32, CM23 和 Express-Ion C，來自 iTosoh 的 iToyopearl CM-650S, CM-650M和CM-650C)；基于磺酸和羧酸的基團(例如，來自J. T. Baker的 BAKERBOND Carboxy-Sulfon)；基于羧酸的基團(例如，來自 J. TBaker 的 WP CBX，來自 Dow Liquid S印arations的DOWEX MAC-3，來自Sigma-Aldrich的兩性電解質(zhì)弱陽離子交換劑 (Amberlite Weak Cation Exchangers), DOWEXTM 弱陽離子交換劑(DOWEXTM Weak Cation Exchanger)和 Diaion 弱陽離子交換劑(Diaion Weak Cation Exchangers)和來自 EMD 的 Fractogel EMD C00-)；基于磺酸的基團(例如,來自 Biochrom Labs Inc.的 Hydrocell SP,來自Dow Liquid Separations的DOWEXTM細篩目強酸陽離子樹脂，來自J. T. Baker 的 UNOsphere S, WPSulfonic，來自 Sartorius 的 Sartobind S 膜，來自 Sigma-Aldrich 的 Amberlite強陽離子交換劑，DOWEXTM強陽離子和Diaion強陽離子交換劑)；和基于正磷酸的基團(例如，來自Whatman的pi 1)。如果需要的話，可用陽離子交換膜代替陽離子交換樹脂，例如，Sartobind S (Sartorius ；Edgewood, NY)。在其中離子交換色譜是陰離子交換色譜的某些實施方案中，陰離子交換色譜步驟可使用選自由以下組成的組的配體季銨或胺，二乙胺、二乙胺丙基、氨基、三甲基銨乙基、 三甲芐基銨、二甲基乙醇芐基銨、多胺?！瓣庪x子交換樹脂”指帶正電荷的固相，從而具有與其連接的一個或多個帶正電荷的配體?？墒褂门c固相結(jié)合的適宜于形成陰離子交換樹脂的任何帶正電荷的配體，比如季銨基團。例如，AEC中所用的配體可以是季銨，比如季烷基胺和季烷醇胺，或胺、二乙胺、二乙胺丙基、氨基、三甲基銨乙基、三甲芐基銨、二甲基乙醇芐基銨、和多胺。可選地，對于AEC， 可使用具有帶正電荷配體的膜，比如以上所描述的配體來替代陰離子交換樹脂。商業(yè)上可獲得的陰離子交換樹脂包括但不限于，來自Applied Biosystems的 DEAE 纖維素、Poros PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50，來自 GE Healthcare 的 MonoQ、MiniQ、Source 15Q 禾口 30Q、Q、DEAE 禾口 ANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose high Performance、QAE SEPHADEXTM 和 FAST Q SEPHAROSETM，來自 J. T. Baker 的 WP PEI、 WP DEAM、WP QUAT，來自 Biochrom Labs Inc.的 Hydrocell DEAE 和 Hydrocell QA，來自 Biorad 的 UNOsphere Q、Macro_Pr 印 DEAE 禾口 Macro—Pr 印 High Q,來自 Pall Technologies 的Ceramic HyperD Q、ceramicHyperD DEAE>Q HyperZ>Trisacryl M禾口LS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil LS, QMA Spherosil M，來自 Dow Liquid S 印 arations 的 DOWEX 細篩目強堿I型陰離子樹脂和II型陰離子樹脂和DOWEXMONOSPHER E 77、弱堿陰離子(weak base anion)，來自 Millipore 的 Matrex Cellufine A200、A500、Q500 和 Q800，來自 EMD 的Fractogel EMDTMAE3Fractogel EMD DEAE 禾口 Fractogel EMD DMAE，來自 Sigma-Aldrich 的 EMD, Amberlite弱陰離子交換劑I型和II型、Amberlite強陰離子交換劑I型和II型、 DOffEX弱陰離子交換劑I型和II型與Diaion強陰離子交換劑I型和II型、Diaion弱陰離子交換劑I型和Π型與Diaion強陰離子交換劑I型和II型、Duolite，來自Tosoh的TSK 凝膠 Q 和 DEAE5PW 和 5PW-HR，Toyopearl SuperQ 650S.650M 和 650C3QAE-550C 和 650S， DEAE-650M 和 650C，和來自 Whatman 的 QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D 禾口 Q0如果需要的話，可使用陰離子交換膜來替代陰離子交換樹脂。商業(yè)上可獲得的陰離子交換膜包括但不限于,來自Sartorius的SARTOBIND Q ，來自Pall ^Technologies的 MUSTANG Q 和來自 Millipore 的 INTERCEPTQ 膜。在某些實施方案中，陰離子交換色譜在從約pH 5. O至約pH 9. O的pH下和從約 0. 5mS/cm至約5mS/cm的電導率下進行。在某些實施方案中，陽離子交換色譜在從約pH 4. O 至約PH 9. O的pH下和在從約0. 5mS/cm至約15mS/cm的電導率下進行。在某些實施方案中，混合型模式色譜在從約PH 4. O至約pH 9. O的pH下和從約0. 5mS/cm至約15mS/cm的電導率下進行。多肽的“pi”或“等電點”指多肽的正電荷抵消其負電荷時的pH。pi可根據(jù)不同的常規(guī)方法來計算，例如，由氨基酸和/或多肽上的唾液酸殘基的凈電荷，或利用等電聚焦技術(shù)經(jīng)驗確定。選擇色譜緩沖液的pH和電導率而使感興趣的HspC與所用的IEC樹脂結(jié)合。適用作洗脫緩沖液的緩沖液的例子可包括磷酸緩沖液或基于TRIS的緩沖液、醋酸鹽、檸檬酸鹽和氫離子緩沖液(Good 等人，1966Biochemistry5 :467-477)。如本文所用的，術(shù)語“洗脫緩沖液”指用來從樹脂洗脫感興趣的蛋白復合物的緩沖液。選擇洗脫緩沖液的PH和電導率而使感興趣的蛋白復合物從過程中所用的CEC樹脂中洗脫。適宜用作洗脫緩沖液的緩沖液的例子可包括磷酸緩沖液或基于TRIS的緩沖液、醋酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸和Good緩沖液。在某些實施方案中，洗脫緩沖液是氯化鈉(NaCl)，其可以從約50mM至約1500mM的濃度來使用。在某些另外的實施方案中，洗脫緩沖液包括至少一種二價陽離子，和在某些實施方案中，洗脫緩沖液包括二磷酸腺苷。在某些實施方案中，緩沖液缺少三磷酸腺苷(ATP)、 ATP酶、鉀或鉀鹽、離液劑、兩性電解質(zhì)和表面活性劑中的至少一種。洗脫緩沖液的pH可從約pH 3至約pH 10，更優(yōu)選地為從約pH 4至約pH 9的pH。 在某些實施方案中，緩沖液的PH為約pH 6.8。本發(fā)明還延伸到HspC富集的裂解物(HEL)，其根據(jù)本發(fā)明的方法來純化。所述 HspC富集的裂解物還可稱作HspC富集的級分(HEF)或稱作HspC富集的組合物(HEC)。因此，本發(fā)明的另一方面提供了通過本發(fā)明的方法純化的至少一種HspC富集的裂解物以用于準備疫苗組合物。通常HspC富集的裂解物來源于從本發(fā)明的離子交換方法獲得的至少一種洗脫的級分。在某些實施方案中，HspC富集的裂解物包括在應激蛋白(熱休克蛋白)和多肽或肽片段尤其是抗原肽片段之間形成的復合物。在某些實施方案中，純化的HspC富集的裂解物來源于微生物宿主、原核病原體、病毒病原體或原生動物病原體、感染病原體的真核宿主細胞，或來自惡性細胞或癌細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，純化的復合物是包括應激蛋白的混合物的應激蛋白/肽復合物，其中應激蛋白可選自由小型hSp、hSp65、hSp70、hSp90和 hsplOO組成的組。離子交換色譜(IEC)基于樣品中的蛋白和固定于所選擇的樹脂上的電荷之間的電荷-電荷相互作用。一般，IEC可再細分為陽離子交換色譜或陰離子交換色譜。例如，當預測靶蛋白復合物在PH6. 8處帶負電荷時可使用CaptoQ (帶正電荷的陰離子交換劑)(參見表1)，和當預測靶蛋白復合物在PH6. 8處帶正電荷時可使用CaptoS (帶負電荷的陰離子交換劑)。表IHsp與CaptoQ柱的預測的結(jié)合
權(quán)利要求
1.一種用于純化應激蛋白和多肽之間形成的復合物的方法，所述方法包括以下步驟 (i)提供源混合物，所述源混合物包括由與多肽復合的應激蛋白形成的至少一種靶應激蛋白復合物，( )確定待從所述源混合物純化的至少一種靶應激蛋白復合物的等電點(Pl)；(iii)從包括所鑒定的應激蛋白復合物的所述源混合物制備澄清的細胞裂解物；(iv)使所述細胞裂解物經(jīng)受利用離子交換的純化，其中所述細胞裂解物被包括至少一種二價陽離子的第一緩沖液緩沖至所述靶應激蛋白復合物的pi的2個單位內(nèi)的pH，并且其中使用提供鹽梯度的第二緩沖液來洗脫靶應激蛋白復合物的混合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中被洗脫的靶應激蛋復合物以制備物提供，所述制備物包括不同熱休克蛋白種類的多個應激蛋白。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(iv)的緩沖液還包括二磷酸腺苷。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述二磷酸腺苷以從約0.ImM至IOOmM的濃度來提供，并且其中所述二價陽離子以約0. ImM至IOOmM的濃度來提供。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述至少一種二價陽離子是鎂鹽和/ 或猛鹽。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述第一緩沖液缺少三磷酸腺苷 (ATP)、ATP酶、和/或鉀或鉀鹽中的至少一種。
7.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一緩沖液不包括離液劑、表面活性劑、尿素或兩性電解質(zhì)。
8.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二緩沖液是提供鹽梯度的洗脫緩沖液。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中洗脫緩沖液包括氯化鈉。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述氯化鈉以約50mM至500mM的濃度在所述洗脫緩沖液中被提供。
11.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH從約pH3至約pHIO。
12.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH從約pH4至約pH9。
13.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH為約pH6.8。
14.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述離子交換是離子交換色譜。
15.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述離子交換是陽離子交換色譜。
16.如權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述離子交換是陰離子交換色譜。
17.如權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述離子交換是混合型色譜。
18.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述離子交換利用離子交換膜吸附器來進行，所述離子交換膜吸附器用來將復合蛋白混合物分成堿性級分和酸性級分。
19.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述離子交換的固相是樹脂或膜。
20.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述應激蛋白復合物被洗脫在包括具有4. 5至6. 5的pi的復合物的級分中。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述陰離子交換色譜在從約5.0至約9. 0的pH下和從約0. 5mS/cm至約5mS/cm的電導率下進行。
22.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述陽離子交換色譜在從約4.0至約9. 0的pH下和從約0. 5mS/cm至約15mS/cm的電導率下進行。
23.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述應激蛋白是熱休克蛋白。
24.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述復合蛋白混合物包括選自由以下組成的組的一個或多個熱休克蛋白hsp20-30kD、hsp40、hsp60、hsp70、hsp90、hsplOO、鈣網(wǎng)織蛋白、 hsp72、grp94、grp75BiP/grp78、grp75/mt 禾口 gp96。
25.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述應激蛋白-肽片段復合物來源于由以下組成的組癌細胞、病原細胞、被病原性生物感染的細胞、經(jīng)遺傳修飾從而其表達來源于癌細胞的異源蛋白的細胞、經(jīng)遺傳修飾從而其表達來源于在宿主中導致傳染病的病原體的異源蛋白的細胞。
26.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述應激蛋白復合物具有50KDa至 900KDa的范圍內(nèi)的分子量。
27.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述應激蛋白肽片段的肽來源于通常導致傳染病的病原性生物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述病原性生物選自由原核細胞、原生動物、病毒、寄生蟲或真菌組成的組。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述原核生物是革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述細菌選自選自由以下組成的組的種埃希氏菌屬(Escherichia)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、博德特氏菌屬(Bordetella) lifM (Corynebacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria) > Bfil IifM (Haemophilus)、方文線菌屬(Actinomycetes)、鏈霉菌屬(Streptomycetes)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、耳口爾森氏菌屬Yersinia)、弗朗西斯氏菌屬(Fancisella)、巴斯德桿菌屬(I^asturella)、莫拉氏菌屬 (Moraxella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、方文線桿菌屬(Actinobacillus)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)特氏菌屬(Listeria)、鞘桿菌屬(Calymmatobacterium)、布魯氏菌屬(Brucella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、密螺旋體屬(Tr印onema)、沙門氏菌屬 (Salmonella)、克雷伯氏菌屬(Kleibsiella)、弧菌屬(Vibrio)、變形桿菌屬(Proteus)、 歐文氏菌屬(Erwinia)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、 螺菌屬(Spirillum)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、志賀氏菌屬(Shigella)、軍團菌屬(Legionella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、立克次氏體屬(Rickettsia)、衣原體屬(Chlamydia)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)和枝原體屬 (Mycoplasma)。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述肽片段來源于病毒肽。
32.
33.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述病毒可選自包括以下的組人類免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤病毒 (HPV)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)、單純皰疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、依波拉病毒、馬爾堡病毒、西尼羅病毒(WNV)、圣路易斯腦炎病毒(SLEV)、裂谷熱病毒(RVFV)、流感病毒、冠狀病毒、鼻病毒、腺病毒、SIV、輪狀病毒、人乳頭瘤病毒、蟲媒病毒、麻疹病毒、 脊髓灰質(zhì)炎病毒、風疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、水痘帶狀皰疹病毒、水痘病毒、漢坦病毒和巨細胞病毒?！?3.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述肽片段來源于原生動物病原體。
34.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述肽片段是腫瘤特異性抗原。
35.一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括通過權(quán)利要求1至34中任一項所述的方法獲得的純化的應激蛋白-肽復合物洗脫級分或裂解物。
36.通過權(quán)利要求1至34中任一項所述的方法獲得的純化的應激蛋白-肽復合物用于制備用來治療傳染病的藥物的用途。
37.通過權(quán)利要求1至34中任一項所述的方法獲得的純化的應激蛋白-肽復合物用于制備用來治療癌性病癥或惡性病癥的藥物的用途。
38.一種復合的應激蛋白-肽，所述復合的應激蛋白-肽通過權(quán)利要求1至34中任一項的方法純化，用于用來治療傳染病的疫苗組合物。
39.一種復合的應激蛋白-肽，所述復合的應激蛋白-肽通過權(quán)利要求1至34中任一項的方法純化，用于用來治療癌性病癥或惡性病癥的疫苗組合物。
40.一種針對病原體來源的傳染病或癌性病癥接種受治療者的方法，所述方法包括以下步驟-提供疫苗組合物，所述疫苗組合物包括作為免疫原性決定物的根據(jù)權(quán)利要求1至34 中任一項所述的方法獲得的純化的應激蛋白/肽復合物富集的制備物，和-以足以在受治療者中引起針對所述應激蛋白/肽復合物富集的制備物的免疫應答的量向受治療者施用治療有效量的或預防有效量的所述疫苗。
41.一種加強在受治療者中通過第一免疫接種計劃介導的針對病原體來源的傳染病或癌性病癥的保護性免疫應答的方法，其中所述保護性免疫應答已通過先前施用活的或減毒的疫苗或如權(quán)利要求35所述的疫苗組合物引起，所述方法包括以下步驟-提供一種組合物，所述組合物包括作為免疫原性決定物的根據(jù)權(quán)利要求1至34中任一項所述的方法獲得的純化的應激蛋白復合物富集的制備物，和-以足以增強在受治療者中針對所述應激蛋白復合物的所述免疫應答的量向受治療者施用治療有效量的或預防有效量的所述組合物。
42.一種加強在受治療者中通過第一免疫接種計劃介導的針對病原體來源的傳染病或癌性病癥的保護性免疫應答的方法，其中所述保護性免疫應答已通過先前施用核酸或蛋白疫苗引起，所述方法包括以下步驟-提供一種組合物，所述組合物包括作為所述免疫原性決定物的根據(jù)權(quán)利要求1至34 中任一項所述的方法獲得的純化的應激蛋白復合物，和-以足以在受治療者中引起針對所述應激蛋白復合物的免疫應答的量向受治療者施用治療有效量的或預防有效量的包括所述應激蛋白復合物的組合物。
43.一種加強在受治療者中通過第一免疫接種計劃介導的針對病原體來源的傳染病或癌性病癥的保護性免疫應答的方法，其中所述保護性免疫應答已通過先前暴露于病原體或癌癥引起，所述方法包括以下步驟-提供一種組合物，所述組合物包括作為所述免疫原性決定物的根據(jù)權(quán)利要求1至34中任一項所述的方法獲得的純化的應激蛋白復合物，和-以足以在所述受治療者中引起針對所述應激蛋白復合物的免疫應答的量向受治療者施用治療有效量的或預防有效量的包括所述應激蛋白復合物的組合物。
44.一種用于利用離子交換純化蛋白復合物的緩沖液，其中所述緩沖液包括至少一種二價陽離子，并且其中所述緩沖液缺少三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、鉀或鉀鹽、離液劑、兩性電解質(zhì)和表面活性劑中的至少一種。
45.如權(quán)利要求44所述的緩沖液，其中所述緩沖液還包括二磷酸腺苷。
46.如權(quán)利要求44或45所述的緩沖液，其中所述至少一種二價陽離子是鎂鹽。
47.如權(quán)利要求46所述的緩沖液，其中所述鎂鹽是氯化鎂(MgCl2)。
48.如權(quán)利要求44至47中任一項所述的緩沖液，其中所述二價陽離子是錳鹽。
49.如權(quán)利要求44至48中任一項所述的緩沖液，其中所述二價陽離子以從約0.ImM至約IOOmM的濃度來提供。
50.如權(quán)利要求44至49中任一項所述的緩沖液，其中所述緩沖液還包括 HEPES (4- (2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。
51.如權(quán)利要求45至50中任一項所述的緩沖液，其中所述二磷酸腺苷以從約0.ImM至約IOOmM的濃度來提供。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于從源混合物純化包括復合于肽或肽片段的應激蛋白的復合物的混合物的改良的方法，所述源混合物通常為細胞裂解物。本發(fā)明的方法提供了待利用基于離子交換色譜的方法純化的蛋白復合物，其中使用了改良的緩沖液，產(chǎn)生比利用常規(guī)方法獲得的蛋白復合物更具免疫原性的純化的應激蛋白復合物。純化的復合物可用來產(chǎn)生在被施用疫苗組合物的受治療者中引起增強的免疫應答的改良的疫苗制備物。
文檔編號A61K39/00GK102458460SQ201080031703
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者卡米洛·科拉科, 科林·理查德·比格內(nèi)爾 申請人:免疫生物學有限公司