專利名稱：牽涉心肌梗死后重塑和心力衰竭的微小rna的鑒定的制作方法
技術領域：
一般而言，本發(fā)明涉及發(fā)育生物學、心臟病學、病理學和分子生物學領域。更具體而言，它關注心肌梗死后(MI后)的組織和人心力衰竭樣品中改變的miRNA表達。操作受調(diào)節(jié)的miRNA的表達提供了一種治療心肌梗死和心力衰竭的新治療方法。
背景技術：
心臟病及其表現(xiàn)，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心臟肥大，清楚地呈現(xiàn)了美國當今的一項重大健康風險。診斷、治療和支持罹患這些疾病的患者的花費完全達到數(shù)十億美元。心臟病的一種特別嚴重的表現(xiàn)是心肌梗死。心肌梗死(MI)(更通常稱為心臟病發(fā)作)是一種在對心臟的一部分的血液供應被中斷(最通常是由于易損斑塊的破裂所致)時發(fā)生的醫(yī)學狀況。所致的缺血或氧缺乏引起心臟組織的損傷和潛在的死亡。它在全世界對于男性和女性都是主要死亡原因。僅在美國，冠狀動脈性心臟病占死亡的五分之一， 而且大約7，200，000名男性和6，000，000名女性正在承受某種形式的冠狀動脈性心臟病。 這些之中，1，200，000人每年遭受新的或復發(fā)的冠狀動脈發(fā)作(coronary attack)，并且他們之中的約40%由于發(fā)作而死亡。這意味著大約每65秒，就有一名美國人死于冠狀動脈事件。若受損的對心臟的血流量持續(xù)得足夠久，則它觸發(fā)缺血性級聯(lián)，其中心臟細胞死于壞死，并且在其位置上形成膠原瘢痕。最近的研究指示來自凋亡的細胞死亡也在心肌梗死后的組織損傷過程中發(fā)揮作用。因此，患者的心臟會受到永久地損傷。此瘢痕組織還使患者面臨潛在危及生命的心律失常的風險，而且可以導致心室壁瘤的形成，所述心室壁瘤可以破裂，伴有災難性后果。受損傷的心臟組織比正常的心臟組織更緩慢地傳導電脈沖。受損傷的與未受損傷的組織間的傳導速度差異可以觸發(fā)被認為是許多致命性心律失常的原因的再進入或反饋環(huán)。心輸出量和血壓可能下降到危險的水平，其可以導致進一步的冠狀動脈缺血和梗死的擴散。在對梗死組織的直接影響外，梗死周圍的邊界區(qū)中的相鄰組織也經(jīng)歷由改變的基因調(diào)節(jié)觸發(fā)的病理性重塑。此重塑導致此區(qū)域中的進一步的肌細胞喪失、增生和進一步的膠原沉積。梗死后，遠處的心肌(myocardium)通過心肌細胞肥大和間質(zhì)性纖維化的發(fā)作來響應梗死。如此，雖然對梗死組織的損傷可能到臨床上診斷并解決MI時已在很大程度上不可挽回，但是由于MI后重塑所致的進一步變化呈現(xiàn)治療性干預的一個很有可能的點。然而，目前，沒有解決心臟病的此方面的已知治療。
以鑒定可容許對受損傷的心臟恢復功能的治療性靶物為目的，已經(jīng)廣泛研究了與 MI后重塑有關的基因表達和信號傳導途徑的變化。目前，已經(jīng)描述了微小RNA在心臟肥大和心力衰竭中的關鍵作用，指向調(diào)節(jié)心臟病的一種新模式。微小RNA(miRNA)是長度為約18 至約25個核苷酸的小的、非蛋白質(zhì)編碼RNA，其源自單獨的miRNA基因、蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子、或經(jīng)常編碼多種緊密相關的miRNA的多順反子轉(zhuǎn)錄物。參見Carrington等的綜述 Science，第301卷(5631) =336-338,2003) miRNA通過促進靶mRNA的降解(在它們的序列完全互補時)，或者通過抑制翻譯(在它們的序列含有錯配時)來充當其阻抑物。miRNA 通過 RNA 聚合酶 II (pol II)或 RNA 聚合酶 III (pol III ；參見 Qi 等 Q006) Cellular&Molecular Immunology，第3卷411-419)轉(zhuǎn)錄，并且產(chǎn)生自一般長幾千個堿基的初始轉(zhuǎn)錄物，其稱作初級miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)。pri_miRNA在細胞核中被RNA酶 Drosha加工成約70至約100個核苷酸的發(fā)夾形前體(pre-miRNA)。轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)后，發(fā)夾 pre-miRNA被Dicer進一步加工以生成雙鏈miRNA。然后，成熟的miRNA鏈摻入RNA誘導的沉默復合物(RISC)中，在那里它通過堿基對互補性與其靶mRNA結(jié)合。在miRNA堿基與 mRNA靶物完全配對的相對罕見的情況中，它促進mRNA降解。更通常地，miRNA與靶mRNA形成不完美的異雙鏈體，影響mRNA穩(wěn)定性或者抑制mRNA翻譯?；谛∈蠛腿酥械囊淮笈z傳研究，變得越來越清楚的是，miRNA實際上積極參與心臟重塑、生長、傳導、和收縮性(綜述見van Rooij和Olson(2007) Journal of Clinical hvestigation，第117卷(9) :2369-2376)。牽涉心血管疾病的miRNA的鑒定和表征對于開發(fā)用于治療心血管疾病，諸如心肌梗死和心力衰竭的新治療方法是重要的。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于數(shù)種miRNA的發(fā)現(xiàn)，所述miRNA在人的心肌梗死和心力衰竭后在心臟組織中受到調(diào)節(jié)。調(diào)控這些鑒定出的miRNA呈現(xiàn)一種用于治療或預防心肌梗死、心臟重塑、和心力衰竭的新治療方法。因而，本發(fā)明提供了一種在有此需要的受試者中治療或預防心肌梗死、心臟重塑、或心力衰竭的方法，包括調(diào)控一種或多種鑒定的miRNA在受試者的心臟細胞中的表達或活性。在一個實施方案中，所述一種或多種miRNA選自下組let-7 家族成員、miR-15b、miR-21、miR_199a、miR_199b、miR-214、miR-10a、miR-10b、miR-16、 miR-146a> miR—146b、miR-22U miR-222> miR-497> miR-20a> miR—20b、miR-93> miR-10U miR-126> miR-30 方 員、miR—143、miR-145> miR—150、miR-29a-c> miR-34a> miR-34c> miR-574、miR-451、miR-499、miR-100、miR-378、miR-24, miR-379、miR-762、miR-335、 miR-711、miR-149、miR-218、miR-181a-d、miR-22、和 miR-185。在一個實施方案中，所述方法包括對受試者施用一種或多種鑒定的miRNA的抑制劑。例如，抑制劑可以是選自下組的miRNA的表達或活性的抑制劑let-7家族成員、 miR-15b> miR-2U miR-199a> miR-199b> miR—214、miR-10a> miR—10b、miR—16、miR-146a> miR-146b、miR-221、miR-222、miR-30 家族成員、和 miR-497。一種或多種 miRNA 的抑制劑可以包括微小RNA拮抗劑(antagomir)、反義寡核苷酸、或抑制性RNA分子。在另一個實施方案中，所述方法包括對受試者施用一種或多種鑒定的miRNA的激動劑。在一些實施方案中，激動劑提高選自下組的miRNA的表達或活性miR-20a、miR-20b、 miR-93、miR-101、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150、miR-29a、miR-29b、和 miR_29c。在某些實施方案中，一種或多種miRNA的激動劑是包含一種或多種miRNA的成熟序列的多核苷酸。激動劑可以在體內(nèi)自表達構建體表達。在一些實施方案中，所述方法可以進一步包括對所述受試者施用第二心臟肥大療法，諸如β阻斷劑、肌力藥(i0n0tr0pe)、利尿藥、ACE-I、AII拮抗劑、BNP、-Ca++阻斷劑、內(nèi)皮縮血管肽受體拮抗劑、或HDAC抑制劑?？梢耘c所述miRNA調(diào)控劑(例如，抑制劑或激動劑)同時或者在所述miRNA調(diào)控劑之前或之后施用第二療法。附圖簡述附圖形成本說明書的一部分，并且包括在內(nèi)以進一步表明本發(fā)明的某些方面?？梢酝ㄟ^與本文中所呈現(xiàn)的具體實施方案的詳細描述結(jié)合參考這些附圖中的一幅或多幅來更好地理解本發(fā)明。

圖1 響應MI的miRNA概況分析。A 對心臟切片的Masson三色染色(Masson Trichrome staining)指示MI后3天的瘢痕形成，伴有肌細胞肥大、進行中的肌細胞損失和膠原沉積。梗死后14天，存在著變薄的伸展開的梗死，其導致非梗死區(qū)域中的間質(zhì)性纖維化和心臟肥大。(I，梗死；BZ，邊界區(qū)；R，遠處的心肌)。B:微陣列分析指示miRNA響應 MI而非常受到動力學調(diào)節(jié)。即使在初始梗死愈合后，即MI后14天，11種miR在邊界區(qū)中受到重疊地上調(diào)，而15種miR受到下調(diào)。C:在MI后3天和14天，邊界區(qū)區(qū)域中的上調(diào)的 miR(左側(cè)小圖)和下調(diào)的miR(右側(cè)小圖)的柱狀圖。D 實時PCR分析確認與假操作的動物(n = 3-4)相比響應MI的miRNA的調(diào)節(jié)。E 與未衰竭的心臟(n = 5-6)相比響應MI的人心臟樣品中的指定miRNA的實時PCR分析。F 3個未衰竭的人心臟和5個MI后的人心臟中的miR-21的Northern印跡分析。圖2 :miR-29在MI后的梗死區(qū)域中受到下調(diào)。A :miR-29家族成員的序列比對指示保守的種子區(qū)(5’端的bp 2-8)和miRNA3’端中的高水平序列保守。B 對多種組織的 Northern印跡分析指示所有三種miR-四成員在表達方面的較大重疊，其中在肺和腎中的表達水平較高。在miR-四成員中，miR-29b表現(xiàn)為在心臟中最高度表達。C:對miR-四的實時PCR分析指示與無血清培養(yǎng)基(SF)中保持的或用去氧腎上腺素(PE)刺激的心肌細胞相比要在成纖維細胞中高度表達的此miR。D 對MI后3天的心臟組織的Northern印跡分析顯示與假操作的動物相比響應MI的miR-四的一致下調(diào)。miR-29的下調(diào)在邊界區(qū)中比在遠處的心肌中更明顯。E 實時PCR分析指示要響應MI而受調(diào)節(jié)的所有miR-四成員。雖然下調(diào)在MI后3天的梗死邊界區(qū)(BZ)中最明顯，但是此下調(diào)在梗死后14天在已經(jīng)發(fā)生初始梗死愈合時仍存在。圖3 :miR-29調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)蛋白的表達。A 關鍵的纖維化基因的3’UTR區(qū)中潛在的miR-四結(jié)合位點。B 對MI后3天的邊界區(qū)和遠處的心肌兩者中的預測的靶基因的實時 PCR分析。miR-四表達降低與膠原(C0L1A1、C0L1A2和C0L3A1)和肌原纖蛋白(FBNl)的表達升高相關聯(lián)。沒有觀察到彈性蛋白(ELNl)的顯著變化。C:對用增加量的miRj9b-l/ miR-29a簇轉(zhuǎn)染的COS細胞的Northern印跡分析顯示miR-四的有效的過表達。D 使用預測的靶基因的內(nèi)源UTR序列的螢光素酶實驗。miRj9b-l/miRj9a的表達阻抑螢光素酶的表達，而阻抑在表達無關的miR，即miR-206時是缺乏的。圖4 :miR-29表達響應TGF β。A 實時PCR分析指示所有三種miR-四家族成員在成纖維細胞中響應TGF0而下調(diào)。B :Northern分析，其顯示了 miR-四表達在miR-208突變體動物中受到上調(diào)，這與BNP表達升高剛好一致，如通過實時PCR所測定的。
圖5 :miR-29抑制在體內(nèi)誘導纖維化。A :anti-miR-29和錯配(mm)miRj9寡核苷酸的化學結(jié)構。B:Northern印跡分析，其顯示了響應靜脈內(nèi)注射80mg/kg anti-miR-四或 mm miR-29中任一或相當體積的鹽水的3天后的組織特異性敲低。C 對肝提取物的實時PCR 分析指示響應miR-四敲低的膠原表達的明顯升高。此效應在鹽水或mm miR-四注射后是缺乏的。D 對在連續(xù)兩天靜脈內(nèi)注射80mg/kg anti-miR-四或mm miR-四寡核苷酸中任一或相當體積的鹽水后3周收集的組織的Northern印跡分析。anti-miR-四的注射在心臟、肝和腎中產(chǎn)生對miR-四的嚴格敲低(severe knockdown)，而肺中的miR-四水平表現(xiàn)得不受影響。E 對心臟提取物的實時PCR分析指示響應miR-四敲低的心臟膠原表達的升高。F: 實時PCR分析，其指示在miR-29b模擬物處理后2天在成纖維細胞中的miR_29b表達升高， 而miR-29a水平未改變，并且miR_29c水平僅略微升高。G 成纖維細胞中的miR_29b過表達阻抑膠原基因的表達，如通過實時PCR分析所測定的。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于在心肌梗死后受到調(diào)節(jié)的miRNA子集的鑒定。具體地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在梗死區(qū)的邊界區(qū)中顯著受到調(diào)節(jié)的40種miRNA和在心肌梗死(MI)誘導后3天在遠處的心肌中受到調(diào)節(jié)的22種miRNA。此外，69種miRNA的表達在MI誘導后2周在梗死區(qū)的邊界區(qū)中是改變的，而40種miRNA在遠處的心肌中受到調(diào)節(jié)。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在來自衰竭的人心臟的心臟組織中受到調(diào)節(jié)的不同的、但是重疊的miRNA子集。發(fā)現(xiàn)在來自人心力衰竭患者的心臟組織中31種miRNA受到顯著上調(diào)，而45種miRNA受到顯著下調(diào)。 受調(diào)節(jié)的miRNA的重疊提示這些miRNA可能牽涉不同心臟病過程，而且積極地影響疾病狀態(tài)。因而，本發(fā)明提供了一種在有此需要的受試者中治療或預防心肌梗死、心臟重塑、或心力衰竭的方法，包括調(diào)控表3-6中所列的一種或多種miRNA在該受試者的心臟細胞中的表達或活性。在某些實施方案中，所述一種或多種miRNA選自下組let-7家族成員(例如 let-7a、let-7b、let_7c、let_7d、let_7e、let_7f、let_7g、禾口 let_7i) (SEQ ID NO :1-8) > miR-15b(SEQ ID NO :9)、miR_21(SEQ ID NO :10)、miR_199a(SEQ ID NO :11)、miR_199b(SEQ ID NO :12-13)、miR-214 (SEQ ID NO :14)、miR_10a(SEQ ID NO : 15)、miR-10b (SEQ ID NO: 16)、miR-16(SEQ ID NO : 17)、miR_146a (SEQ ID NO :18)、miR_146b (SEQ ID NOs :19-20)、 miR-221(SEQ ID NO :21)、miR_222(SEQ ID NO :22)、miR_497(SEQ ID NO :23)、miR_20a(SEQ ID NO :24)、miR-20b(SEQ ID NO :2 、miR-93 (SEQ ID NO :26)、miR-101 (SEQ ID NO :27)、 miR-126(SEQ ID NO :28)、miR-30 家族成員(例如 miR_30a、miR_30b、miR_30c、miR_30d、 和 miR-30e) (SEQ ID NO :29-33)、miR-143 (SEQ ID NO :34)、miR-145 (SEQ ID NO :35)、 miR-150(SEQ ID NO :36)、miR-29a_c (SEQ ID NOs :37-39)、miR_34a (SEQ ID NO :40)、 miR-34c(SEQ ID NOs :41-42)、miR-574 (SEQ ID NO :43-44)、miR-451 (SEQ ID NO :45)、 miR-499 (SEQ ID NO :46)、miR-100 (SEQ ID NO :47)、miR-378 (SEQ ID NO :48)、miR-24 (SEQ ID NO :49)、miR-379(SEQ ID NO :50)、miR-762 (SEQ ID NO :51)、miR-335 (SEQ ID NO: 52)、miR-711 (SEQ ID NO :53)、miR-149 (SEQ ID NO :54)、miR-218 (SEQ ID NO :55)、 miR-181a-d(SEQ ID NO :56-59)、miR-22 (SEQ ID NO :60)、和 miR-185 (SEQ ID NO :61)。如本文中所使用的，術語“受試者”或“患者”指任何脊椎動物，包括但不限于人和其它靈長類(例如，黑猩猩和其它猿和猴物種)、家畜(例如，牛、綿羊、豬、山羊和馬)、家養(yǎng)哺乳動物(例如，犬類和貓類)、實驗室動物(例如，嚙齒類諸如小鼠、大鼠和豚鼠)、和禽類(例如，家養(yǎng)的、野生的和獵禽諸如雞、火雞及其它家禽、鴨、鵝等)。在一些實施方案中，受試者是哺乳動物。在其它實施方案中，受試者是人。在要治療的受試者是人的此類實施方案中，要調(diào)控的一種或多種miRNA是人miRNA序列。如本文中所使用的，術語“調(diào)控”指miRNA的生物學活性的變化或變更。調(diào)控可以是miRNA表達水平的變化、miRNA的結(jié)合特征(例如對靶mRNA或?qū)ISC復合物的組分)的變化、或與miRNA有關的生物學或功能性特征的任何其它變化。調(diào)控可以是miRNA的表達或功能的升高或降低。術語“調(diào)控”指能夠改變或變更如上文所描述的miRNA的表達或生物學活性的任何分子或化合物。在一個實施方案中，所述方法包括對受試者施用表3-6中所列的一種或多種 miRNA(或?qū)娜薽iRNA)的抑制劑。在一些實施方案中，所述抑制劑靶向pre_miRNA或 pri-miRNA序列。在其它實施方案中，所述抑制劑靶向成熟的miRNA序列。在另一個實施方案中，所述抑制劑是一種或多種選自下組的成熟miRNA序列的表達或活性的抑制劑let-7 家族成員(例如 let-7a、let-7b、let_7c、let_7d、let_7e、let_7f、let_7g、禾口 let_7i) (SEQ ID NO :1-8)、miR-15b(SEQ ID NO :9)、miR_21 (SEQ ID NO : 10)、miR_199a(SEQ ID NO: 11)、miR-199b(SEQ ID NO :12-13)、miR-214 (SEQ ID NO : 14)、miR-10a (SEQ ID NO :15)、 miR-lOb(SEQ ID NO : 16)、miR_16(SEQ ID NO : 17)、miR_146a(SEQ ID NO : 18)、miR_146b(SEQ ID NOs :19-20)、miR-221 (SEQ ID NO :21)、miR-222 (SEQ ID NO :22)、miR-497 (SEQ ID NO: 23)、和 miR-30 家族成員 H^i^nmiR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30cUnmiR-30e) (SEQ ID NO :29-33)。在某些實施方案中，一種或多種miRNA的抑制劑是反義寡核苷酸。反義寡核苷酸可以包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或其組合。優(yōu)選地，反義寡核苷酸具有至少一處化學修飾(例如，糖或主鏈修飾)。例如，合適的反義寡核苷酸可以由一個或多個“構象約束性”或二環(huán)糖核苷修飾(BSN)，，構成，所述修飾對含有BSN的寡核苷酸與其互補微小RNA靶標鏈間形成的復合物賦予增強的熱穩(wěn)定性。例如，在一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個“鎖定核酸(locked nucleic acid)”。鎖定核酸(LNA)含有2，_0，4，-C-亞甲基核糖核苷(結(jié)構A)，其中核糖糖模塊為“鎖定”構象。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個2’，4’-C-橋接的2’脫氧核糖核苷(⑶NA，結(jié)構B)。參見例如美國專利 No. 6，403，566 禾口 Wang 等(1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，第 9 卷 1147-1150，通過提及而將這兩篇都完整收入本文。在又一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個經(jīng)修飾的核苷，其具有結(jié)構C中所顯示的結(jié)構。靶向一種或多種miRNA的反義寡核苷酸可以含有BSN(LNA、CDNA等)或其它經(jīng)修飾的核苷酸和核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的組合。
權利要求
1.一種在有此需要的受試者中治療或預防心肌梗死、心臟重塑、或心力衰竭的方法，包括調(diào)控表3-6中所列的一種或多種miRNA在所述受試者的心臟細胞中的表達或活性。
2.權利要求1的方法，其中所述一種或多種miRNA選自下組let_7家族成員、 miR-15b> miR-2U miR-199a> miR-199b> miR—214、miR-10a> miR—10b、miR—16、miR-146a> miR-146b> miR-221> miR-222> miR-497> miR-20a> miR—20b、miR-93> miR-10U miR—126、 miR-30 家族成員、miR-143、miR-145、miR-150 和 miR-29a_c。
3.權利要求2的方法，其中調(diào)控包括對所述受試者施用選自下組的一種或多種miRNA 的抑制劑let-7 家族成員、miR-15b、miR-21、miR_199a、miR_199b、miR-214、miR-10a、 miR-10b、miR-16、miR-146a、miR_146b、miR-221、miR-222、miR-30 家族成員、和 miR-497。
4.權利要求3的方法，其中所述一種或多種miRNA的抑制劑是反義寡核苷酸或微小 RNA 拮抗劑(antagomir)。
5.權利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸包含與所述一種或多種miRNA的成熟序列至少部分互補的序列。
6.權利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸包含至少一處糖和/或主鏈修飾。
7.權利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸的長度為約8至約18個核苷酸。
8.權利要求2的方法，其中調(diào)控包括對所述受試者施用選自下組的一種或多種miRNA 的激動劑miR-20a、miR_20b、miR-93、miR-101、miR-126、miR-143、miR-145、miR-150、 miR-29a、miR_29b、禾口 miR_29c。
9.權利要求8的方法，其中所述一種或多種miRNA的激動劑是包含所述一種或多種 miRNA的成熟序列的多核苷酸。
10.權利要求9的方法，其中所述激動劑是自表達構建體表達的。
11.權利要求3或8的方法，其中通過靜脈內(nèi)施用或者直接注射入心臟組織來對所述受試者施用所述抑制劑或激動劑。
12.權利要求3或8的方法，其中通過口服、經(jīng)皮、持續(xù)釋放、受控釋放、延遲釋放、栓劑、 導管或舌下施用來對所述受試者施用所述抑制劑或激動劑。
13.權利要求1的方法，其進一步包括對所述受試者施用第二心臟療法。
14.權利要求13的方法，其中所述第二療法選自下組β阻斷劑、肌力藥 (ionotrope)、利尿藥、ACE-I, AII拮抗劑、BNP, Ca++阻斷劑、內(nèi)皮縮血管肽受體拮抗劑、或 HDAC抑制劑。
15.權利要求1的方法，其中梗死區(qū)中的纖維化在調(diào)控一種或多種miRNA后降低。
16.權利要求1的方法，其中梗死區(qū)中的凋亡在調(diào)控一種或多種miRNA后降低。
17.權利要求1的方法，其中所述受試者是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定牽涉心臟組織中的心力衰竭和心肌梗死后重塑過程的miRNA。描述了調(diào)控這些鑒定的miRNA作為對于心肌梗死、心臟重塑、和心力衰竭的治療。
文檔編號A61K31/7105GK102481310SQ201080033059
公開日2012年5月30日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權日2009年5月20日
發(fā)明者E.N.奧爾森, E.范魯伊杰 申請人:得克薩斯系統(tǒng)大學董事會