專利名稱：巢狀細(xì)胞包囊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在多個巢狀(nested)微囊中包囊細(xì)胞的方法。標(biāo)記可并入各微囊，使得根據(jù)包囊或細(xì)胞培養(yǎng)操作來鑒定不同的細(xì)胞群。并且，本發(fā)明提供包括多個微包囊層的微包囊的細(xì)胞，以及基于檢測微包囊的標(biāo)記的追蹤或鑒定細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)60年代本領(lǐng)域就已提出了細(xì)胞的微包囊。在“Cell encapsulation Promise and progress”, Nature Medicine 9,104-107 (2003)中提供了綜述?？茖W(xué)文獻(xiàn)涵蓋各種包囊技術(shù)和各種包囊材料。例如，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中微包囊的細(xì)胞的用途在1964年首次提出。提出了通過由海藻酸鹽(酯)/I丐復(fù)合物形成的微球包囊內(nèi)分泌細(xì)胞、島(islets)、和肝細(xì)胞；見Chang,、T. M. S. , Artificial Cells, 1972, Springfield, 111. Charles C. Thomas。在 20 世紀(jì) 80年代，胰島(islets of Langerhans)包囊在藻酸鹽(酯)_聚_1_賴氨酸_藻酸鹽(酯)囊中(Lim, F.和 A. M. Sun, Microencapsulated islets as bioartificial endocrinepancreas. Science, 1980. 210 p. 908) 0通過使用更純的藻酸鹽(酯)和更粘的藻酸鹽(酯)溶液，研究人員獲得對正常血清免疫球蛋白不滲透的微包囊(Goosen，M. F. A.等人，Optimization of microencapsulation parameters SemipermeabIe microcapsules as abioartificial pancreas. Biotech. Bioeng.，1985. 27 p. 146)，從而使細(xì)胞隔絕于身體的免疫反應(yīng)。還見，例如US 4，353，888。Walsh等人US 6，649，384描述了轉(zhuǎn)盤噴霧器包囊細(xì)胞(比如島細(xì)胞)用于移植的用途。此專利，以及其它發(fā)表的文獻(xiàn)和專利文件，似乎主要涵蓋用于在操作期間保護(hù)細(xì)胞免于物理破壞或免于免疫系統(tǒng)攻擊的包囊。用于培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)和用于發(fā)現(xiàn)和實施用于調(diào)節(jié)細(xì)胞過程(比如生長、分化、代謝活性和表型表達(dá))的技術(shù)的方法體現(xiàn)在我們的國際申請WO 2004/031369中。根據(jù)此處所述程序，例如在有孔的珠上包括一個或更多個培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞的“單元”，在組合分開-匯聚(split-pool)程序中經(jīng)受不同生長條件，所述程序涉及反復(fù)的分開和再-匯聚細(xì)胞培養(yǎng)物，使其中的不同細(xì)胞單元暴露于不同的培養(yǎng)條件。當(dāng)操作大量細(xì)胞單位時，其同一性(identity)和/或細(xì)胞培養(yǎng)史(例如，任何一組或單元可以已暴露的一系列培養(yǎng)條件的時間順序和確切性質(zhì))可變得混淆。W02004/031369描述了用于確定細(xì)胞單元的同一性和/或細(xì)胞培養(yǎng)史的改進(jìn)方法。在W02007/063316中我們描述了使用分開-匯聚程序用來確定試劑活性的方法，所述試劑在細(xì)胞上發(fā)揮作用。在W02007/023297中我們描述了在分開-匯聚細(xì)胞培養(yǎng)實驗中用于標(biāo)簽細(xì)胞的進(jìn)一步改進(jìn)的方法，以更好在達(dá)到特定狀態(tài)中確定細(xì)胞暴露于哪種試劑和營養(yǎng)物?；罴?xì)胞的包囊是本領(lǐng)域已知的，并率先用于移植細(xì)胞的免疫-保護(hù)。通常，出于免疫-保護(hù)目的用于包囊細(xì)胞的聚合物，如本領(lǐng)域公知的，可用于本發(fā)明。例如，見Orive等人，(2203)Nature Medicine 9 :104-107以及此處引用作為參考。已描述了使用噴射包囊技術(shù)的活材料的包囊。很多這種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如生物-電噴射、空氣動力-輔助的生物-噴射以及壓力-輔助的細(xì)胞噴射。這些技術(shù)每個已被描述可用于包囊活細(xì)胞。對于噴射技術(shù)的概述，見Jayasinghe, S., (2008)Regen.Med. 3 49-61 以及 US 6，649，384、US 2006/0051329 和 US 4，353，888。并且已描述使用層-層(LbL)技術(shù)的細(xì)胞包囊。這種技術(shù)涉及多個聚電解質(zhì)層至待包覆的表面上的吸附以及至彼此上的吸附。陽離子和陰離子聚電解質(zhì)的連續(xù)層用于形成多層結(jié)構(gòu)。例如，見 Peyratout 和 Daehne, (2004)Angew. Chem. Int. ed. 43 :3762_3783。已描述了 LbL來包囊細(xì)胞的應(yīng)用，例如，由Leung等人，(2009)J Biomed Mater Res A 88 226-37。Leung等人采用藻酸鹽(酯)/聚-L-鳥氨酸膜來包圍細(xì)胞，并用聚苯乙烯磺酸鹽(酯)和聚丙烯胺鹽酸鹽的連續(xù)層包覆此膜。表明包囊的細(xì)胞可用于長期的嫁接移植。并且，已經(jīng)描述了涉及使用微流體裝置包囊單一細(xì)胞或細(xì)胞簇的包囊技術(shù)。例如，見 US2006/0051329。 標(biāo)記細(xì)胞(所述細(xì)胞暴露于分開-匯聚培養(yǎng)技術(shù)或暴露于涉及在不同培養(yǎng)基中反復(fù)循環(huán)培養(yǎng)的其它技術(shù))，取決于能夠在細(xì)胞的附上不同的標(biāo)記，有賴于其所暴露的各種不同培養(yǎng)基。這可是極其繁重的，尤其是在分開-匯聚技術(shù)中，其中細(xì)胞群反復(fù)匯聚和再-分開至不同的群并取樣大量不同的試劑組合。并且，跟隨任何一個細(xì)胞經(jīng)歷反應(yīng)條件的多重可能組合的過程可是非常困難的。已經(jīng)發(fā)表了涵蓋多重微囊“層”的一些專利和專利申請，通過檢驗，所述“層”成為包覆而不是真正的層?；瘜W(xué)上產(chǎn)生這些包覆的包囊，而不是通過真正的再-包囊產(chǎn)生新的層。例如，見US 5，620，883。這些方法均沒有被提出用于細(xì)胞標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供通過微包囊細(xì)胞標(biāo)記細(xì)胞或細(xì)胞群的方法，從而獲得的微囊包括一個或更多個標(biāo)記。因此，提供包含活細(xì)胞和標(biāo)記的微囊。所述微囊可以是可用于包囊活細(xì)胞，優(yōu)選不喪失細(xì)胞功能，的任何微囊。例如，微囊可以是，比如通過微流體包囊或電噴形成的藻酸鹽(酯)珠、或包含聚電解質(zhì)層的多層微囊。標(biāo)記可以是適于標(biāo)記活細(xì)胞的任何標(biāo)記。標(biāo)記的實例如下述。優(yōu)選，細(xì)胞包囊期間加入標(biāo)記。有利地，標(biāo)記并入微囊層中。細(xì)胞可以是單一細(xì)胞或一群細(xì)胞。優(yōu)選，其是細(xì)胞單元。在一個優(yōu)選實施方式中，提供包含活細(xì)胞和多個標(biāo)記的微囊，其中用兩個或更多個囊層來包囊所述細(xì)胞，以及至少一個標(biāo)記與兩個或更多個所述微囊層結(jié)合。在這個實施方式中，例如，加入各微囊層時可加入一個或更多個標(biāo)記，從而標(biāo)記所述微囊。標(biāo)記可并入至微囊材料本身、或和細(xì)胞共同封裝至微囊中。優(yōu)選，各標(biāo)記可被檢測。優(yōu)選，可以同時檢測每個標(biāo)記，從而允許標(biāo)記待記錄的標(biāo)記細(xì)胞的多個標(biāo)記。另一方面，本發(fā)明提供用于細(xì)胞單元的方法，包括步驟(a)提供一個或更多個細(xì)胞單元，其中各單元包括一個或更多個細(xì)胞；以及(b)和一個或更多個第一標(biāo)記共同微包囊所述細(xì)胞單元。
在一個實施方式中，所述方法還包括(C)和第二標(biāo)記共同重復(fù)步驟(b)的微包囊。在步驟(C)中，步驟(b)中獲得的微囊是自身包囊的?？稍诖穗A段加入一個或更多個第二標(biāo)記；標(biāo)記可以是相同或不同的。第二標(biāo)記和第一標(biāo)記，此外，可相同或不同。各微囊可因此含有，除此之外，一個標(biāo)記。以這種方式，細(xì)胞可以被連續(xù)包囊數(shù)次，每次并入不同的標(biāo)記，并因此保留其所暴露的包囊事件的歷史。本發(fā)明的方法當(dāng)用于細(xì)胞培養(yǎng)操作時是尤其有利的，所述細(xì)胞培養(yǎng)操作涉及將細(xì)胞暴露于多個培養(yǎng)條件。如果包囊事件和暴露于鑒定試劑有關(guān)，那么可以確定細(xì)胞暴露的試劑的順序。一方面，因此，提供用多個標(biāo)記來標(biāo)記一群細(xì)胞的方法，包括步驟a)提供一個或更多個細(xì)胞單元，其中各單元包括一個或更多個細(xì)胞；(b)和第一鑒定標(biāo)記共同微包囊所述細(xì)胞單元；(C)任選，將細(xì)胞單元與一個或更多個經(jīng)第二鑒定標(biāo)記微包囊的細(xì)胞單元混合；(d)任選使用第三鑒定標(biāo)記重復(fù)步驟(b)。第一、第二和第三鑒定標(biāo)記可相同或不同。優(yōu)選它們是不同的，從而不同包囊事件和特異的標(biāo)記相關(guān)聯(lián)?？蓡为殹⒒蚍纸M地，微包囊細(xì)胞單元。換言之，微囊可含有單一細(xì)胞單元、或多個細(xì)胞單元。例如，微囊可含有2、3、4、5、6或更多個細(xì)胞單元。各細(xì)胞單元其自身可被微包囊。因此，各微囊可含有多個微囊，多個微囊中的每個可含有多個細(xì)胞單元?；蛘?，各微囊可含有多個微囊，多個微囊中的每個包含單一細(xì)胞單
J Li o微囊中若干細(xì)胞單元(或微囊)的分布有利地是同質(zhì)的，但是期望可產(chǎn)生一些變化。有利地，本發(fā)明的方法用于分開-匯聚程序的情況下。在這種程序中，細(xì)胞可暴露于不同培養(yǎng)條件、匯聚、分開以及任選再-匯聚，來取樣最大數(shù)目的可能條件。在這種實施方式中，本發(fā)明提供用于標(biāo)記已暴露于多個培養(yǎng)條件的一群細(xì)胞的方法，包括步驟a)提供第一組細(xì)胞單元的群，各單元包含一個或更多個細(xì)胞，以及將所述群暴露于所需的培養(yǎng)條件；(b)和鑒定標(biāo)記共同微包囊所述細(xì)胞單元；(c)匯聚兩個或更多個所述群來形成至少一個庫(pool)；(d)再重分所述庫來產(chǎn)生另一組細(xì)胞單元的群；(d)將所述另一組的群暴露于所需的培養(yǎng)條件；(e)重復(fù)步驟(b) - (d)。
細(xì)胞單元可以是例如附著至微球或微孔微載體的單一細(xì)胞、或細(xì)胞群?？梢酝ㄟ^噴射程序進(jìn)行微包囊。優(yōu)選技術(shù)包括生物-電噴射、空氣動力-輔助的生物-噴射和壓力-輔助的細(xì)胞噴射。尤其優(yōu)選電噴射。作為替代的程序包括聚電解質(zhì)的LbL吸附和微流體包囊。本發(fā)明采用細(xì)胞單元。這種單元可以是單一細(xì)胞，但是優(yōu)選是兩個或更多個細(xì)胞的集落，所述集落以這樣一種形式排列，即它們甚至在分開匯聚程序期間對破壞有耐受性。例如，可以在固體基質(zhì)比如珠上培養(yǎng)細(xì)胞，如下詳細(xì)描述。典型地，所用細(xì)胞單元是小到足以通過此處所述的噴射方法被包囊的微載體。這種微載體還允許細(xì)胞用于高-通量篩選(HTS)而沒有任何細(xì)胞單元的事先破壞。標(biāo)記允許對細(xì)胞所暴露的培養(yǎng)條件進(jìn)行追蹤；因此,任何給定細(xì)胞單元可以具有其標(biāo)記閱讀以便確定其如何源自起始細(xì)胞庫或培養(yǎng)物。標(biāo)記可采取任何各種形式，包括核酸標(biāo)記、射頻編碼的標(biāo)簽、微球標(biāo)簽、條形碼標(biāo)簽和微球標(biāo)簽。尤其優(yōu)選微球標(biāo)簽。標(biāo)記可選自如下組病毒、寡核苷酸、肽、熒光化合物、仲胺、鹵烴、穩(wěn)定同位素的混合物、條形碼、光學(xué)標(biāo)簽、珠、量子點和射頻編碼的標(biāo)簽。兩個或更多個標(biāo)記可以甚至選自這樣的組，并組合使用來標(biāo)記細(xì)胞單元，例如，包含熒光化合物和/或量子點的珠。在我們共同-待決(co-pending)的申請W02007/023297中進(jìn)一步討論待用于細(xì)胞單元的標(biāo)記和特異性標(biāo)記；并入此處作為參考。 細(xì)胞可以培養(yǎng)于細(xì)胞單元中，各細(xì)胞單元包括一個或更多個細(xì)胞。另一個實施方式中，所述細(xì)胞單元是單一細(xì)胞。細(xì)胞單元可包括一個或更多個粘附至或結(jié)合固體基質(zhì)的細(xì)胞。另一個實施方式中，所述固體基質(zhì)是微載體或珠。在一個實施方式中，培養(yǎng)條件包括任何物理或化學(xué)培養(yǎng)基，在其中分離和操作細(xì)胞，但是適合的是，反應(yīng)條件是細(xì)胞所暴露的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)條件包括生長培養(yǎng)基、溫度狀況、基質(zhì)、大氣條件、物理細(xì)胞操作等。生長培養(yǎng)基包括營養(yǎng)并影響細(xì)胞的天然和合成的物質(zhì)，包括但不限于基礎(chǔ)培養(yǎng)基、生長因子、營養(yǎng)物、緩沖液、化學(xué)品、藥物等。反應(yīng)條件可甚至包括細(xì)胞信號途徑的潛在調(diào)節(jié)因子的篩選。第二方面，本發(fā)明涉及微包囊的細(xì)胞單元，其包括和第一鑒定標(biāo)記共同包囊于第一微囊中的至少一個細(xì)胞單元，所述包囊的細(xì)胞單元其本身和第二鑒定標(biāo)記共同包囊于第
二微囊中。如上述，各微囊可包括單一細(xì)胞單元、或多個細(xì)胞單元。在一個實施方式中，因此，第二微囊包括多個微包囊的細(xì)胞單元，其中各單元可單獨和其它細(xì)胞單元進(jìn)行微包囊或包囊。


圖IA和IB是顯微照片，其顯示包囊于微囊中的兩個不同的微載體。圖2A和2B是顯微照片，其顯示和圖I中顯示的那些相似的微載體，但是各微囊包囊有兩個微載體。圖3A和3B是顯微照片，其顯示每微囊三個微載體。圖4是顯微照片，其顯示包囊于第一微囊中的微載體，第一微囊自身又包囊于第
二微囊中。圖5A和5B是顯微照片，其分別顯示包囊于第二微囊中的熒光微囊，以及包囊于另一個微囊中的兩個熒光微囊。圖6A和6B是通過兩種微流體方法形成微囊的示意圖。圖7是微囊中細(xì)胞單元和標(biāo)記的微包囊的總示意圖。圖8A-8D是顯微照片，其顯示包囊于兩層的球中的標(biāo)簽。圖8A顯示發(fā)藍(lán)色熒光的標(biāo)簽，而SB顯示發(fā)紅色熒光的標(biāo)簽。合并的圖像顯示于SC中。8D是明視野的顯微照片。用Cy5. 5光學(xué)濾鏡記錄紅色熒光圖像(激發(fā)=650/45nm,發(fā)射=710/50nm)。用DAPI光學(xué)濾鏡記錄藍(lán)色熒光圖像(激發(fā)=360/40nm，發(fā)射=460/50nm)。
具體實施例方式定義如此處所用，術(shù)語“培養(yǎng)條件”涉及細(xì)胞所處于的或暴露于的以便促進(jìn)所述細(xì)胞生長或分化的環(huán)境。因此，本術(shù)語涉及可影響細(xì)胞生長和/或分化的培養(yǎng)基、溫度、大氣條件、基質(zhì)、攪拌條件等。更具體地，本術(shù)語涉及可并入培養(yǎng)基且可影響細(xì)胞的生長和/或分化的特定試劑。
如此處所涉及的“細(xì)胞”，定義為能夠獨立運作的生物體最小結(jié)構(gòu)單元或單細(xì)胞生物體，所述細(xì)胞由一個或更多個核、細(xì)胞質(zhì)和各種細(xì)胞器組成，這些均被半透性細(xì)胞膜或細(xì)胞壁所包裹。所述細(xì)胞可以是原核、真核、動物或植物、或古細(xì)菌。例如，細(xì)胞可以是真核細(xì)胞。優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，尤其是人細(xì)胞。細(xì)胞可以是天然的或比如通過遺傳操作或在培養(yǎng)基中傳代而改造的來獲得所需的特性。如下將更詳細(xì)地定義干細(xì)胞，干細(xì)胞是能夠產(chǎn)生一種以上分化的細(xì)胞類型的全能、多能或?qū)Ｄ?multipotent)細(xì)胞。干細(xì)胞可體外分化而產(chǎn)生分化的細(xì)胞，所述分化的細(xì)胞本身是專能的或終末分化的。體外分化的細(xì)胞是通過使干細(xì)胞暴露于一種或更多種促進(jìn)細(xì)胞分化的試劑而人工創(chuàng)造的細(xì)胞?！凹?xì)胞單元”是一群細(xì)胞，其可以是一種(細(xì)胞)的一群。細(xì)胞單元的群或庫可以被分選、再重分和操作而沒有實質(zhì)上分解細(xì)胞單元本身，從而細(xì)胞單元表現(xiàn)為細(xì)胞的集落，且細(xì)胞單元中各細(xì)胞暴露于相同的培養(yǎng)條件。例如，細(xì)胞單元可包括附著有一群細(xì)胞的珠、或細(xì)胞團(tuán)比如島結(jié)構(gòu)或胚胎體、或非粘附的細(xì)胞的集合比如某些血細(xì)胞。細(xì)胞單元(或細(xì)胞)的“群”是不連接在一起的多個這種單元。例如，細(xì)胞單元不是一群細(xì)胞，但是一個或更多個細(xì)胞共同聚集在單一單元中。單一細(xì)胞和個體細(xì)胞單元，可以被匯聚而形成一群細(xì)胞或細(xì)胞單元。群可以通過將群劃分成兩個或更多個細(xì)胞或細(xì)胞單元的群而被分開?！叭堋奔?xì)胞是具有分化成生物體中發(fā)現(xiàn)的任何體細(xì)胞或生殖細(xì)胞類型的潛能的細(xì)胞。因此，可以，通過一些手段，從全能細(xì)胞中衍生出任何所需的細(xì)胞?！岸嗄堋奔?xì)胞是可以分化成一種以上，并非所有，細(xì)胞類型的細(xì)胞。如此處所用“標(biāo)記”或“標(biāo)簽”是指鑒定細(xì)胞單元和/或確定細(xì)胞單元所暴露的培養(yǎng)條件，或培養(yǎng)條件的順序。因此，標(biāo)記可以是在特定的培養(yǎng)步驟中各自加入的一組標(biāo)記；或在一開始加入的標(biāo)記、或在實驗(所述實驗是根據(jù)細(xì)胞單元所暴露的培養(yǎng)步驟改造的)時加入的標(biāo)記、或(細(xì)胞單元所暴露的)培養(yǎng)步驟期間追蹤的標(biāo)記；或僅僅是方位參考，其允許推導(dǎo)所用的培養(yǎng)步驟。標(biāo)記或標(biāo)簽還可以是在任何時間報告或記錄細(xì)胞單元的定位或同一性的裝置、或給細(xì)胞單元指定獨特的鑒定因子的裝置。標(biāo)記或標(biāo)簽的實例是獨特序列、結(jié)構(gòu)或質(zhì)量的分子；或熒光分子或物體比如珠；或射頻和其它變換器(transponder);或具有獨特標(biāo)志或形狀的物體?！拌b定標(biāo)記”是允許確定其附著的細(xì)胞單元的性質(zhì)的標(biāo)記。這允許通過在每次暴露時加入鑒定標(biāo)記來記錄細(xì)胞單元暴露的不同培養(yǎng)條件、以及隨后通過分析標(biāo)記來去卷積細(xì)胞單元暴露于的不同培養(yǎng)條件。當(dāng)使細(xì)胞暴露于培養(yǎng)基、或在影響一個或更多個細(xì)胞過程(比如細(xì)胞的生長、分化、或代謝狀態(tài))的條件下生長時，細(xì)胞“暴露于培養(yǎng)條件”。因此，如果培養(yǎng)條件包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，那么細(xì)胞在培養(yǎng)基中放置足夠一段時間使其有作用。同樣地，如果培養(yǎng)條件是溫度條件，那么在所需的溫度下培養(yǎng)細(xì)胞。一個或更多個細(xì)胞單元的群的“匯聚”涉及群的混合來產(chǎn)生單一的群或庫，其包括一種以上背景的細(xì)胞單元，即細(xì)胞單元已暴露于一種以上的不同系列的培養(yǎng)條件。庫可以隨機(jī)或非-隨機(jī)地再重分為群；出于本目的，這種群其本身不是“庫”，但是其本身可以是，例如暴露于不同系列的培養(yǎng)條件之后，通過組合而被匯聚的?！凹?xì)胞生長”和“細(xì)胞增殖”此處是互換使用的，來表示細(xì)胞數(shù)目的倍增，而不分化成不同的細(xì)胞類型或世系。換言之，該術(shù)語表示活細(xì)胞的數(shù)目的增加。優(yōu)選增殖不伴有表 型或基因型中的可感知變化。“細(xì)胞分化”是從一個細(xì)胞類型發(fā)展為不同的細(xì)胞類型。例如，雙能(bipotent)、多能或全能細(xì)胞可分化成神經(jīng)細(xì)胞。分化可伴隨有增殖，或可是單獨的。術(shù)語“分化”通常涉及從較低發(fā)展限定的細(xì)胞類型獲得成熟細(xì)胞類型的表型(如神經(jīng)元或淋巴細(xì)胞)，但不排除轉(zhuǎn)分化(transdifferentiation),據(jù)此一種成熟細(xì)胞類型可轉(zhuǎn)換為另一種成熟細(xì)胞類型，如從神經(jīng)元到淋巴細(xì)胞。細(xì)胞的“分化狀態(tài)”是細(xì)胞沿著特定的途徑或世系進(jìn)行分化所達(dá)到的水平。“微囊”是包封細(xì)胞單元的保護(hù)性屏障。本領(lǐng)域中術(shù)語通常用于涉及半透性或不透性結(jié)構(gòu)；在本發(fā)明上下文中，微囊是半透性的且允許生長基質(zhì)的成分和其它試劑通過，但截留標(biāo)記和標(biāo)簽以便允許細(xì)胞單元的鑒定。微包囊、或包囊是細(xì)胞單元在微囊中的包封。當(dāng)涉及微囊、或微囊中的微囊中的細(xì)胞單元數(shù)目的分布時，“基本上”用于表示賦予了規(guī)定參數(shù)的大多數(shù)所述分布；從而，如果基本上各微囊含有單一細(xì)胞單元，期望絕大多數(shù)獲得的微囊將包括單一細(xì)胞單元。有些可包括兩個、三個或更多個；然而，這些是相當(dāng)稀少的。沒有包封細(xì)胞單元的微囊不被考慮作為分布的一部分。術(shù)語“多個”表示一個以上。在涉及標(biāo)記的上下文中，其描述這樣的事實即各包囊允許再加入至少一個標(biāo)記，從而可以用每包囊至少一個標(biāo)記來標(biāo)記多重-包囊的細(xì)胞單元。在涉及微囊中的細(xì)胞單元的上下文中，兩個、三個、四個、五個、六個或更多個細(xì)胞單元可以包括在單一微囊中。包囊使用任何合適的技術(shù)進(jìn)行包囊。已描述了微囊技術(shù)，例如在US 6，808，882和US7，138，233中，其尤其描述了乳化微包囊技術(shù)，但是還提出了其它微包囊方法，至少其中一些適于包囊活細(xì)胞。已描述了用于移植細(xì)胞的免疫保護(hù)的包囊活細(xì)胞的具體方法。例如，見Orive等人，(2203)Nature Medicine 9 :104-107 和此處引用作為參考。適于包囊活細(xì)胞的一種方法是層-層(LbL)加入聚電解質(zhì)層。在這種方法中，細(xì)胞首先包囊于微囊中，比如藻酸鹽(酯)珠，隨后加入交替電荷的聚電解質(zhì)的層。標(biāo)記可以嵌入層中，或?qū)颖旧砜梢允潜粯?biāo)記的。聚電解質(zhì)包括，例如，聚苯乙烯磺酸鹽(酯)、聚丙烯胺、聚二烯丙基甲基氯化銨(polydial lylmethylammonium chloride)、聚乙烯亞胺、聚丙烯酸、聚乙烯磺酸鹽(酯)和全氟磺酸(Nafion)。通過將細(xì)胞或其它待包覆的表面混懸于聚電解質(zhì)溶液中來加入聚電解質(zhì)層，所述聚電解質(zhì)濃度足以在所述表面形成飽和的層。如果使用過量的聚電解質(zhì)，其必須在加入另一個聚電解質(zhì)之前除去，以避免溶液中形成復(fù)合物。如果隨后以形成完整的層所需的濃度加入聚電解質(zhì)，所需的微囊可以迅速形成，因為在幾分鐘內(nèi)吸附了聚電解質(zhì)且不需要洗滌循環(huán)。然而，在溶液中形成游離的聚電解質(zhì)的復(fù)合物和細(xì)胞團(tuán)的風(fēng)險增加了。通過使用高度稀釋的細(xì)胞混懸液、或精確地確定充分包覆細(xì)胞所需的聚電解質(zhì)的確切量可以降低這種風(fēng)險。因此，在一個實施方式中，過量的聚電解質(zhì)加入至細(xì)胞。吸附各聚電解質(zhì)層之后，在向細(xì)胞加入相反電荷的聚電解質(zhì)之前，從溶液中除去過量的聚電解質(zhì)。通過進(jìn)行至少三次洗滌循環(huán)，例如用PBS，除去過量。通過離心或，優(yōu)選過濾，可以進(jìn)行細(xì)胞從溶液中的分離，顆粒穿過粗濾器(設(shè)計用于截留細(xì)胞材料)從過量的聚電解質(zhì)中濾出。
在一個實施方式中，可使用聚電解質(zhì)藻酸鹽(酯)和聚-L-賴氨酸。藻酸鹽(酯)和PLL分別帶有負(fù)電荷和正電荷。用于包囊細(xì)胞的其它聚電解質(zhì)包括聚苯乙烯磺酸鹽(酯)和聚丙烯胺鹽酸鹽。例如，見 Peyratout 和 Daehne, (2004) Angew. Chem. Int. ed. 43 3762-3783 的表 2，以及 Leung 等人，(2009) J Biomed Mater Res A 88:226-37。標(biāo)記或標(biāo)簽還可以是帶電荷的；例如負(fù)電荷的標(biāo)記可使用正電荷的聚電解質(zhì)。在一個實施方式中，如此處所述或本領(lǐng)域中可以用藻酸鹽(酯)包覆細(xì)胞，并隨后洗滌并混懸于含有帶電荷的標(biāo)記的溶液中。藻酸鹽(酯)是負(fù)電荷的，所以正電荷的標(biāo)記將結(jié)合藻酸鹽(酯)?；蛘?，或此外，細(xì)胞可以混懸于包含正電荷的聚電解質(zhì)(比如聚-L-賴氨酸(PLL))的溶液中，聚電解質(zhì)其自身是標(biāo)記的，或者與正或負(fù)電荷的標(biāo)記共同混懸于聚電解質(zhì)(比如PLL)的溶液中，正或負(fù)電荷的標(biāo)記將分別結(jié)合藻酸鹽(酯)或PLL。改變混懸的時間影響層的厚度；從I分鐘直至I小時的時間是可能的，但是5至10分鐘的時間更常見，使用0. 05-0. Iwt % PLL0在例如PBS中，洗滌獲得的珠，然后混懸于藻酸鹽(酯)中，藻酸鹽(酯)任選是標(biāo)記的。再次，通常使用0. 05-0. lwt%溶液，持續(xù)5-10分鐘。包囊后，洗滌珠然后按照需要重懸以加入其它包覆。在一個實施方式中，聚電解質(zhì)層本身可以是可檢測的。例如，可使用熒光或顏色-編碼的聚電解質(zhì)。見 Strand 等人，Biotechnol Bioeng(2003)82 :386_94。在另一個實施方式中，可以在微流體控制下進(jìn)行包囊。在微流體系統(tǒng)中含有細(xì)胞的滴的形成已得到廣泛證實，并已用于高通量的基于滴的分析(J. Clausell-Tormos等人，Chemistry and Biology, 2008,15, 5,427)和細(xì)胞分選(J-C. Baret 等人，Lab Chip, 2009,9，1850)。在這些實例中，用由油相分開的水滴中包囊細(xì)胞。通過表面活性劑層穩(wěn)定水滴。而且使用若干種方法已經(jīng)證實水凝膠包囊的細(xì)胞的形成。這些包括在油相中藻酸鹽(酯)/細(xì)胞水滴和含有水滴的0&(12的形成。當(dāng)兩種類型的滴融合在一起時，形成含-細(xì)胞的交聯(lián)水凝膠珠，如H. Shintaku 等人,Microsystems Technology, 2007,13,951 的圖 I 中所示，此處如圖6A所重現(xiàn)。如下更充分描述這種方法。
方法中有兩個階段滴的形成，以及滴的凝聚形成水凝膠，如圖6A中所示。對于滴的形成，首先使用通過在微通道中將水相引入至油中，從位于微通道上游的噴嘴，形成含有細(xì)胞的藻酸鈉溶液的滴。跟隨連續(xù)液相的流，藻酸鹽(酯)滴在主通道中流向下游。然后，藻酸鹽(酯)滴與從位于下游的第二噴嘴形成的氯化鈣溶液滴融合。為了產(chǎn)生其直徑在300 U m以下的水凝膠珠，通道深度優(yōu)選約50 U m,分別為，對于噴嘴具有50 ii m的優(yōu)選直徑，以及對于主通道為200 u m。優(yōu)選采用濃度在I. 5% (按重量)的藻酸鈉溶液，以及細(xì)胞在藻酸鹽(酯)中以IO5細(xì)胞/ml的濃度分散。優(yōu)選以0. IM的濃度提供氯化鈣。植物油比如向日葵油可用作油相。Workman 等人，Macromolecular Rapid Communications, 2008, 29,165 已描述了第二操作。在這種方法中，采用屏蔽接合(shielded junction)來產(chǎn)生藻酸鹽(酯)微球(見Workman等人中的圖I，此處如圖6B所重現(xiàn))。混有CaCO3的含水藻酸鈉和細(xì)胞弓I入至中央通道。混有乙酸的向日葵油提供到最外面的通道(A)。向日葵油提供到中間通道(B) 作為防止藻酸鹽(酯)溶液去接觸酸化油流的屏蔽。通道B和A之間，兩種油以層流方式流動，具有最低程度的H+向保護(hù)的向日葵油中的擴(kuò)散。在接合處形成滴之后，H+擴(kuò)散至藻酸鹽(酯)滴，從而從CaC03中釋放Ca2+，其引起藻酸鹽(酯)的膠凝。接合前的通道優(yōu)選具有約500 u m2的橫截面積，接合后通道優(yōu)選約1000 u m2。此外可以使用噴射包囊技術(shù)進(jìn)行包囊。很多這種技術(shù)是本領(lǐng)域公知的；優(yōu)選生物-電噴噴射、空氣動力-輔助的生物-噴射和壓力-輔助的細(xì)胞噴射。電噴也作生物-電噴或電液動力噴射(electrohydrodynamic jetting),并依賴噴嘴或針與接地電極之間的勢差來產(chǎn)生確定尺寸的滴。培養(yǎng)基穿過保持在比電極更高的勢的導(dǎo)針，設(shè)定外電場，從針中出來的培養(yǎng)基穿入所述電場。針是中空的，具有0. 2至2mm之間的內(nèi)徑,是平的或倒棱幾何形的(chamferededge geometries)。針還可以是共軸的,從而不同的流可以從相同的針中同時噴出。通過針和電極之間的勢差(電壓的差)、培養(yǎng)基的流速及其相關(guān)性質(zhì)比如粘度、表面張力、電導(dǎo)和相對介電常數(shù)確定滴的形成。電壓和間距是相關(guān)的，因為電場取決于這兩個變量。通常，在I或2cm間距以及電壓5-10kV附近完成包囊。當(dāng)噴射穩(wěn)定時，可以獲得幾乎單分布的滴的尺寸。使用這種技術(shù)可以包囊活細(xì)胞(Jayasinghe等人，(2006) Small 2,216-219;和(2006)Biotechnol. J. I :86-94)。盡管早期實驗產(chǎn)生不穩(wěn)定的噴射(其具有滴的尺寸的寬分布)，這通過使用共軸噴射針在外噴射中噴微包囊材料而在內(nèi)噴射中噴生物材料來產(chǎn)生穩(wěn)定的噴射而得到改善(Jayasinghe 等人，(2006)Lab Chip 6:1086-1090)。空氣動力輔助的噴射依賴于壓力梯度。在室中產(chǎn)生相對于周圍大氣的壓力，其提供牽引作用來產(chǎn)生噴射。可以這種途徑包囊活細(xì)胞(Arumuganathar等人，(2007)Biomed.Mat 2 :158-168)。壓力-輔助的噴射采用共軸針，其中一個口用于噴射培養(yǎng)基，第二個作為待施加的壓力的導(dǎo)管。不像空氣動力-輔助的噴射，壓力-輔助的噴射沒有加壓室(pressurisedchamber)。對于噴射技術(shù)的概述，見Jayasinghe, S.， (2008) Regen. Med. 3 :49_61 以及US6, 649，384、US 2006/0051329 和 US 4,353,888。
待包囊的細(xì)胞可以是裸露的單個細(xì)胞，或可以是并入如上述的微載體的，比如球或有孔微載體。為了制備用于包囊的細(xì)胞單元，在一個實施方式中，細(xì)胞單元，其可以是單個細(xì)胞，在合適的含水緩沖液(比如PBS)中洗滌，沉淀并重懸于含有包囊聚合物的緩沖液中。包囊材料可以是任何合適的聚合材料。原始的包囊技術(shù)使用聚二甲基硅氧烷作為包囊材料。優(yōu)選的是水凝膠，尤其是藻酸鹽(酯)。聚合物應(yīng)當(dāng)能夠易于固化來形成具有所需特性的膜，并不溶于生理PH的水或鹽水。所需的特性包括體內(nèi)營養(yǎng)滲透性，并通常需要聚合物具有一定程度的極性。聚合物膜可以通常含有處于平衡的20-90%水。聚合物應(yīng)當(dāng)在溶液中對細(xì)胞是無毒的。合適的聚合物的實例包括聚丙烯酸鹽(酯)以及與丙烯酸、甲基丙烯酸及其酯的共聚物、纖維素基的聚合物、含有丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、苯乙烯磺酸鹽(酯)、乙烯基吡啶、乙烯乙醇、烯丙醇的共聚物等。合適的聚合物是丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，帶有少量季銨基團(tuán)。還見US 6, 281,241 ;和Desai，2002Exp. Opin.Biol.Ther. 2 :633-646。通常，對用于免疫-保護(hù)目的的包囊細(xì)胞有用的聚合物，如本領(lǐng)域已知的，可用于本發(fā)明。例如，見Orive等人，(2003)Nature Medicine 9 :104-107和此處 引用作為參考。包囊聚合物優(yōu)選缺乏鈣離子和鎂離子的PBS緩沖液(這阻止包囊聚合物的過早固化)。通常，緩沖液包括1-5重量％的藻酸鹽(酯)。需要大約20ml的3%藻酸鹽(酯)在PBS中的溶液來包囊Ig的基于微載體的細(xì)胞單元。從PBS中沉淀之前或之后，標(biāo)記或標(biāo)簽可以加入至包囊聚合物溶液，或加入至細(xì)胞單元。聚合物的膠凝劑可以三種方式之一引入(I)產(chǎn)生二級的滴群并誘導(dǎo)使其與細(xì)胞囊融合；(2)同油相平行建立的、含有聚合劑的水相流中提取細(xì)胞滴；或(3)膠凝劑直接溶于油相。優(yōu)選，Ca2+、Sr2+或Ba2+離子用于固化藻酸鹽(酯)。CaCl2或相應(yīng)的Sr或Ba化合物，以IOmM至IM之間的濃度溶于水。Ca、Sr和Ba的組合可以同少至ImM的一種成分使用來獲得珠的最佳特性。這種溶液優(yōu)選盛放在收集容器中，所述容器置于電噴單元的電極處?；鞈矣谠逅猁}(酯)溶液中的細(xì)胞單元穿過噴射儀器，從而滴收集于盛放固化或膠凝劑的容器中。噴后可以從容器底部回收包囊的珠。為了再-包囊,細(xì)胞單元在程序一開始已被包囊。包囊的細(xì)胞單元有利地在PBS中洗滌并沉淀。對于如上每Iml體積的細(xì)胞單元(除去液體的)，使用如上制備的5ml藻酸鹽(酯)溶液(優(yōu)選約2重量％的濃度)。還可加入標(biāo)記或標(biāo)簽。所述單元噴射至含有膠凝劑的容器中，且再-包囊的單元收集于容器底部。有利地，使用稍微更大的針直徑，例如0. 9_來補(bǔ)償增加的生物材料的尺寸。在一些實施方案中，可使用比在一級包囊程序中更高的流速和更低的場強(qiáng)。在一種可替代的結(jié)構(gòu)中，可使用共軸噴針，細(xì)胞混懸液噴射于內(nèi)針中，而包囊聚合物溶液噴射于外針中。這種排列已顯示能夠獲得更穩(wěn)定的噴射來包囊活細(xì)胞(Jayasinghe&Townsend-Nicholson, (2006)Lab Chip 6:1086-1090)。標(biāo)簽或標(biāo)記如上述，標(biāo)簽可用作標(biāo)記。在現(xiàn)有技術(shù)的方法中，標(biāo)簽已偶聯(lián)至微載體或細(xì)胞單元上，且這種方法可用于本發(fā)明的第一個巢狀包囊，其中標(biāo)簽可以直接暴露于細(xì)胞單元。在隨后的包囊中，然而，標(biāo)簽在細(xì)胞單元中不暴露于微載體，因此與其不形成復(fù)合物?？墒褂酶鞣N分子或大分子標(biāo)簽。標(biāo)簽通常包括獨特形狀的物體，或用標(biāo)志和/或有色和/或熒光化合物改造的物體。在一個實施方案中，標(biāo)簽有一個或更多(優(yōu)選所有)如下品質(zhì)i.相對于它們所標(biāo)記的細(xì)胞單元而言，它們尺寸??；ii.在不擾亂標(biāo)簽獨特品質(zhì)的條件下，它們與細(xì)胞單元可分開；其中標(biāo)簽不直接暴露于細(xì)胞單元，例如當(dāng)它們在外面的微囊層時，通過更多種標(biāo)簽化學(xué)可更易于獲得這種特征；iii.它們由不實質(zhì)上影響細(xì)胞單元生物學(xué)的一種或更多種惰性物質(zhì)制得，其反過來不受細(xì)胞單元或其生物學(xué)影響；再次，在外面的微囊層中，這可以是用更多種標(biāo)簽更易于獲得的；iv.它們可大量的、并且以很多相關(guān)的但不同的變體的形式獲得，使用合適的技術(shù)易于區(qū)分所述變體；V.它們通過方便、高度可信的方法是可區(qū)分的，且該方法可以是自動化的，例如通過FACS。在一個實施方式中，標(biāo)簽是微球，比如熒光和/或有色微球?？梢垣@得2000種以上的不同微球，其是通過乳化或混懸、聚合、沉淀等制得的并且由聚苯乙烯、其它聚合物、共聚物、三元共聚物和/或二氧化硅等組成。以各種尺寸、密度、顏色等制造微球，例如通過Bangs Laboratories Inc. (Fishers IN, USA)。微球的常規(guī)類型是聚苯乙烯(PS)和苯乙烯/ 二乙烯苯共聚物(S/DVB)微球。其它聚合物包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯基甲苯(PVT)、苯乙烯/ 丁二烯(S/B)共聚物、和苯乙烯/乙烯基甲苯(S/VT)共聚物。合適地，微球是親水微球。更合適地，微球是聚苯乙烯微球。最合適地，微球是表面-改造的微球，比如羧酸鹽(酯)_改造的微球。很多這些微球可以是官能化的，例如通過如CML微球中的羧基基團(tuán)、或通過氨基官能化的或含硝基的化合物，像伯、仲、叔和季脂肪胺、芳香胺和吡啶，其提供與COOH珠的可替代的偶聯(lián)反應(yīng)。CML微球具有源自共聚作用過程的羧基基團(tuán)的高電荷表面層。表面或多或少是有孔的且相對親水的，但保留了整個疏水特性。這些顆粒的電荷密度范圍從約每羧基10至125 A2，且它們對高濃度電解質(zhì)(高達(dá)-IM單價鹽)是穩(wěn)定的。CML乳膠，將吸附蛋白質(zhì)和其它生物分子，但是遠(yuǎn)不及疏水微球強(qiáng)。在一些實施方式中，制備微球和蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物，如鏈霉親和素。例如，和CML微球的偶聯(lián)物可以如下制備?？墒褂盟芴级啺吩噭┘せ頒ML微球，碳二亞胺試劑使得羧基基團(tuán)和蛋白質(zhì)上待偶聯(lián)的伯胺反應(yīng)。制備50mMpH6. 0的反應(yīng)緩沖液。乙酸鈉或2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)是合適的緩沖液。蛋白質(zhì)以10mg/mL的濃度溶于反應(yīng)緩沖液。在反應(yīng)緩沖液中制備1% (w/v)微球混懸液。制備一體積的蛋白質(zhì)溶液對十體積的微球混懸液，將混合物在室溫孵育20分鐘。制備10mg/mL(52 ii Mol/mL) I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDAC)在去離子水中的溶液，并即刻使用。向微球 混懸液中加入計算量的EDAC溶液，且用0. IN NaOH將反應(yīng)混合物的pH調(diào)整至6. 5±0. 2。室溫下在搖床(rocker)或混合輪(mixing wheel)上孵育混合物2小時。除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)并保存于保存緩沖液中。優(yōu)選，可以各種形式獲得CML和其它微球，比如各種顏色(如藍(lán)、紅、綠、黃、黑)、各種熒光團(tuán)(如熒光素(綠)、熒光素(紅)或熒光素和羅丹明(紅和色))以及各種尺寸(如 5.4iim(l. 14X1010 珠/ 克)以及 7.6iim(4. 10XlO9珠 / 克))?？芍苽銫ML-和其它微球，從而它們加載有一種或更多種可視染料和/或熒光團(tuán)。
在一些實施方式中，標(biāo)簽，比如微球，未包覆有蛋白質(zhì)。通過改變建造過程中的各種參數(shù)，商業(yè)微球供應(yīng)商-比如Bangs Laboratories-可以制造珠的套裝,其可以基于不同尺寸而被區(qū)分(如4.4iim和5.5iim直徑的珠的套裝)。各尺寸組內(nèi)的珠可進(jìn)一步基于不同的熒光強(qiáng)度(由于單一熒光染料的載量(loading)不同)而彼此區(qū)分?？赡苁褂镁哂胁煌栈虬l(fā)射特征的很多不同染料，其可以附著至此處所述的微載體上。因此，不同的標(biāo)簽尺寸和/或熒光團(tuán)載量(熒光強(qiáng)度)、和/或熒光團(tuán)同一性/組合可導(dǎo)致標(biāo)簽多樣性。尤其是，它們攜帶的熒光團(tuán)類型(如珠可加載有UV25或Starfire Red);尺寸(如，對于各熒光團(tuán)有5種不同的珠尺寸1. 87,4. 41,5. 78,5. 37和9. 77微米)和/或它們攜帶的熒光團(tuán)的量(各染料的五種不同強(qiáng)度是可獲得的)可導(dǎo)致標(biāo)簽多樣性?？梢允褂闷渌鼰晒鈭F(tuán)-比如TRITC0然后可以使用濾鏡來檢測任何給定珠上的至少4種不同染料，比如針對來自Nikon 的 TRITC visualization 的 TRITC 濾鏡(ex 540/25 ；dm 565 ；ba 605/55);針對來自 Nikon 的 UV2visualization 的 DAPI 濾鏡(ex 340-380 ；dm 400 ；ba 435-485);針對來自 Nikon 的 FITC visualization 的 GFP-B 濾鏡(ex 460-500 ；dm 505 ；ba 510-560)以及針對 Strarfire Red visualization 的 Cy5 濾鏡套裝(來自 Chroma Technology 的 cat-no4t008)。微球可以用可視或熒光染料進(jìn)行內(nèi)部或外部染色。當(dāng)染料整合至微球體(mass)時發(fā)生內(nèi)部染色，通常通過將微球浸泡至含有染料或熒光團(tuán)的溶液中。當(dāng)染料偶聯(lián)至微球表面時，發(fā)生外部改造，例如用此處所述的異硫氰酸鹽(酯)衍生物對CML微球的改造。因此，在一些實施方式中，可以用可視或熒光染料對微球進(jìn)行內(nèi)部或外部染色。還可能使用“量子點”來獲得非常大量的可以方便讀取的不同熒光標(biāo)記。從而在本發(fā)明另一實施方式中，使用量子點而非熒光團(tuán)。在某些實施方式中，由于事實上，當(dāng)暴露于光時量子點不消退(光-漂白)，優(yōu)選量子點。例如已知熒光團(tuán)FITC是光-漂白的，并且用含有FITC的標(biāo)簽處理的細(xì)胞單元最好在黑暗中操作且難于穩(wěn)定分析?？稍诰酆暇郾揭蚁┑臅r候?qū)⒘孔狱c并入微球，導(dǎo)致甚至是標(biāo)簽的加載。可以很多顏色獲得量子點，它們可以在相同的波長激發(fā)，從而通過使用顏色CCD照相機(jī)無需濾鏡就允許多重顏色的可視化。量子點的進(jìn)一步背景信息從 US 6, 322, 90UUS 6, 576, 29UUS 2003/0017264,US 6.423,551、US 6，251，303、US 6，319，426、US 6，426，513、US 6，444，143、US 2002/0045045、US5，990，479、US 6，207，392、US 6，251，303、US 6，319，426、US 6，426，513 和 US 6，444，143可獲得。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的各種方法可以實現(xiàn)標(biāo)簽的檢測。方法包括質(zhì)譜、核磁共振、測序、雜交、抗原檢測、電泳、光譜、顯微術(shù)、圖像分析、熒光檢測等。在一些實施方式中，由于標(biāo)簽通常含有顏色或熒光團(tuán)，因而使用顯微術(shù)、光譜、圖像分析和/或熒光檢測?？梢栽贿M(jìn)行標(biāo)簽的檢測，就是說不擾亂包囊的細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，或可以在從囊中分離標(biāo)簽之后進(jìn)行。原位檢測標(biāo)簽的優(yōu)勢是可能利用組合的標(biāo)簽策略。例如當(dāng)使用標(biāo)簽A、B和C時，除了僅含有標(biāo)簽A、B和C的層以外，將可能產(chǎn)生含有獨特標(biāo)簽組合(AB、AC和BC)的不同包囊層。在一個實施方式中，層還含有第二個易于檢測的區(qū)分因子(differentiator),比如染料，其另外允許不同層得以區(qū)別。在一個實施方式中，標(biāo)簽的包囊可導(dǎo)致空間上編碼的聚合物基質(zhì)；例如，見美國專利申請 20060127369。標(biāo)簽策略的多個變化可以被設(shè)計用來確定混合物中給定細(xì)胞單元的同一性或推導(dǎo)混合物中包含的不同細(xì)胞單元的同一性。例如已經(jīng)描述了標(biāo)簽的光學(xué)或可視方法，其中不同形狀的物體、圖像編碼的物體或不同顏色指示樣本的同一性(例如見，Guiles等人，1998, Angew. Chem. Intl Ed Engl, vol. 37, p926 ；Luminex Corp, Austin TX, USA ； BCPbiosciences ；Memobead Technologies, Ghent, Belgium)。在另一個實施方式中，標(biāo)簽是桿狀顆粒。合適地，桿狀標(biāo)簽是納米線。所述納米線可包括、由或主要由各種金屬(比如鋁)組成?？捎酶鞣N金屬(比如銀和/或金)包覆納米線。合適地，納米線約I U M或更小的直徑和/或約10 ii M或更小的長度。納米線可以是Science, voI 294, p. 137-141 (2001)中描述的納米線。簡要而言，納米線是用亞微米條(submicrometer stripe)固有編碼的多金屬微桿。通過金屬離子在具有統(tǒng)一尺寸的孔的模板上連續(xù)電化學(xué)沉積可以產(chǎn)生復(fù)雜的圖案。優(yōu)選，納米線足夠小以便用作可在各次分開后加入的標(biāo)簽。桿狀顆粒(比如納米線)的參數(shù)包括但不限于尺寸、光學(xué)特性和/或金屬組合物。在一個實施方式中，光學(xué)特性選自光反射性，比如特定波長的光反射性、顏色、熒光發(fā)射-波長和熒光發(fā)射強(qiáng)度。在一些實施方式中，桿狀顆粒，比如納米線，是外部染色的。桿狀標(biāo)簽可優(yōu)選是球形標(biāo)簽，由于更高的表面面積對體積的比例，導(dǎo)致在微囊層中出色的保留。因此，納米線的結(jié)合可以優(yōu)于，例如，微球標(biāo)簽的結(jié)合，并產(chǎn)生更水平的標(biāo)簽。對于一些實施方式,標(biāo)簽不是DNA標(biāo)簽。在一些實施方式中，標(biāo)簽是外部染色的標(biāo)簽。在另一實施方式中，標(biāo)簽使用無線波來傳輸信息，如在RFID標(biāo)簽中。RFID通常采用變換器(RF標(biāo)簽)、天線和讀取器。RF標(biāo)簽是小的電子線路，通常包裝在玻璃或塑料中，RF標(biāo)簽以其最小的形式提供通過合適電子設(shè)備對可“讀”的獨特鑒定編碼的訪問(access)，而無需接觸或視線(line of sight)。標(biāo)簽還可以儲存用戶產(chǎn)生的信息，同樣地?zé)o需接觸或視線?！白x取器”是將信息轉(zhuǎn)化為標(biāo)簽以及轉(zhuǎn)化來自一個或更多個標(biāo)簽的信息的電子單元(應(yīng)當(dāng)注意，術(shù)語讀取器可互換使用，來表示只讀和讀/寫單元)。讀取器的尺寸和特征可顯著不同，其可以分開操作，或連接至遠(yuǎn)程計算機(jī)系統(tǒng)操作。天線用來將信息從讀取器傳輸至標(biāo)簽，并接收RF標(biāo)簽發(fā)送的信息。天線的尺寸和形式將反映專門的應(yīng)用，范圍可從小的環(huán)形線圈至大的平面結(jié)構(gòu)。RFID系統(tǒng)可以分開操作，或連接至遠(yuǎn)程計算機(jī)操作用于鑒定和源自標(biāo)簽的相關(guān)數(shù)據(jù)的更全面的解釋和操作。一個RFID策略描述于Nicolaou等人(1995,AngewChem Intl Ed Engl, vol. 34, p. 2289)并包括(i)含有合成基質(zhì)和半導(dǎo)體標(biāo)簽的有孔包封(enclosure) ；(ii)固相合成樹脂；(iii)能夠接收、儲存和發(fā)射射頻信號的玻璃-包裝的單個或多個可尋址的射頻標(biāo)簽半導(dǎo)體單元。僅通過用組織培養(yǎng)微載體或合適的細(xì)胞單元替換固相合成樹脂，可以調(diào)整相似的裝置來適于細(xì)胞單元生長和追蹤?？梢栽O(shè)想的這種的更多變化包括但不限于細(xì)胞直接生長于其上的(包覆的或未包覆的)RF標(biāo)簽，或植入細(xì)胞單元或生物體的RF標(biāo)簽。標(biāo)記的微囊壁在一個作為替代的、或互補(bǔ)的，標(biāo)記策略中，標(biāo)記可以并入材料中，從所述材料構(gòu)建微囊壁。例如，熒光-標(biāo)記的聚合物可用于包覆細(xì)胞。如果聚合物是藻酸鹽(酯)，例如，可以通過讓羧基暴露于藻酸鹽(酯)，用藻酸鹽(酯)處理標(biāo)記比如氨基熒光素(C2tlH13NO3)?？梢杂蒙虡I(yè)蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑(比如來自Molecular Probes (Leiden,荷蘭)的Alexa 546蛋白標(biāo)記試劑盒)來標(biāo)記聚-L-賴氨酸(PLL)。例如，見Strand等人，BiotechnolBioeng (2003)82 :386_94。
熒光染料可用于標(biāo)記聚電解質(zhì)，比如那些在LbL包囊中使用的。見，例如，US2006/0105335，其中異硫氰酸熒光素、四甲基羅丹明-異硫氰酸酯和CY5的衍生物用于標(biāo)記聚烯丙胺(PAH)。通常，根據(jù)標(biāo)記蛋白質(zhì)的常規(guī)操作標(biāo)記聚電解質(zhì)。微載體可獲得各種微載體，范圍從形狀和尺寸以及由不同材料制得。微載體可以是有孔的、大孔的、微孔的或固體的。通過實例的方式，微載體可以是選自如下的微載體Cultisphe 微載體、Cultispher-G 微載體、Cultispher-GL 微載體、Cultispher-S 微載體、Informatrix 微載體、Microsphere 微載體、Siran 微載體、FibraCel Disks 微載體、Cytoline微載體(如Cytoline I微載體或Cytoline 2微載體)、Cytodex微載體(如Cytodex I、Cytodex 2 或 Cytodex 3 微載體)、Cytopore 微載體(如 Cytoporel 微載體或Cytopore 2 微載體)、Biosilon 微載體、Bioglass 微載體、FACT III 微載體、Collagen C微載體、Hillex II微載體、ProNectin F微載體、Plastice微載體、Plastic Plus微載體、Nunc 2D MicroHex 微載體、Glass 微載體(Sigma Aldrich)、DE 52/53 微載體或其組合。細(xì)胞和細(xì)胞單元細(xì)胞并入至細(xì)胞單元中導(dǎo)致形成一個整體，當(dāng)與其它集落摻攪和混合時，有助于細(xì)胞的群(細(xì)胞集落)在細(xì)胞培養(yǎng)中在各種條件下生長以及在各種條件下維持群的整體性。這種群或集落此處涉及細(xì)胞單元。通過說明的方式，通過使細(xì)胞作為粘附培養(yǎng)物生長于固體基質(zhì)(比如載體)上，可以實現(xiàn)細(xì)胞單元的形成。如果接種在載體上之后發(fā)生細(xì)胞增殖，子代細(xì)胞將附著至相同的載體，并形成相同集落的一部分。通常，活的粘附的細(xì)胞不易于從其生長基質(zhì)中分離，所以，盡管載體的任何機(jī)械操作、培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪動、或轉(zhuǎn)移至另一組織培養(yǎng)系統(tǒng)，仍保持了細(xì)胞集落的整體性。相似地，如果在任何時間將多個載體置于相同的容器中(如匯聚珠)那么將沒有細(xì)胞從一個珠到另一個珠的實質(zhì)轉(zhuǎn)移。當(dāng)在固體基質(zhì)上形成細(xì)胞單元時，基質(zhì)以及因此由于結(jié)合的原因而附著的細(xì)胞，可以如此處所述被標(biāo)記。生長于更小的載體上的細(xì)胞可以作為混懸培養(yǎng)物處理。在更小的載體上生長細(xì)胞的常規(guī)方法涉及微載體細(xì)胞培養(yǎng)(見“Microcarrier cell culture”，Principles and Methods' , Edition AA,可獲自 Amersham Biosciences (18-1140-62);其全部并入此處作為參考)。微載體培養(yǎng)商業(yè)上用于高達(dá)4000升的發(fā)酵罐中抗體和干擾素的生產(chǎn)。包囊細(xì)胞單元的優(yōu)點是顯著降低了細(xì)胞(或標(biāo)簽)從一個單元向另一個單元的任何轉(zhuǎn)移。由于載體的物理特性是已知的，容易計算實驗中所用載體的數(shù)目。載體可作為干的產(chǎn)物獲得，其可以精確稱重，并隨后通過溶脹于液體培養(yǎng)基中而制備。此外，可以算出并改變用于接種微載體培養(yǎng)基的細(xì)胞的數(shù)目。收獲生長于此處所述微載體上的細(xì)胞，或當(dāng)需要時從微載體中釋放標(biāo)記，可以如此處所述適用時通過細(xì)胞的酶促解吸附，和/或通過消化載體來實現(xiàn)。在一些實施方式中，標(biāo)簽是球，比如微球，其包括聚苯乙烯、由或主要由聚苯乙烯組成。細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，包括分化的細(xì)胞、祖細(xì)胞或干細(xì)胞，多能的或全能的。 在一個實施方式中，排除人胚胎干細(xì)胞。例如，在W02004/031369、W02007/063316和W02007/023297中描述了可以包囊的細(xì)胞的類型，其中每個并入此處作為參考。試劑盒本發(fā)明還涉及用于細(xì)胞包囊的試劑盒。這樣的試劑盒包括至少藻酸鈉、一個或更多個微載體以及一個或更多個可檢測的標(biāo)簽。藻酸鹽(酯)可以是固體或溶液形式，并且溶液可以是即用型或預(yù)期用于稀釋的。微載體和標(biāo)簽可選自上述那些。試劑盒還可包括，例如，適合細(xì)胞的包囊的微流體噴嘴或噴針，例如此處所述的，包囊聚合物，比如上述的適于噴射的聚電解質(zhì)或聚合物，以及膠凝劑，其通常是鈣、鍶或鋇離子。用于包囊的細(xì)胞可還包括在試劑盒的一部分，如同培養(yǎng)基，比如DMEM或PBS?？梢栽O(shè)計專門的試劑盒用于通過LbL、電噴或微乳化技術(shù)的包囊。各試劑盒優(yōu)選包括藻酸鹽(酯)、標(biāo)志物和微載體；然而，聚合物和培養(yǎng)基可根據(jù)應(yīng)用的不同而不同。例如，設(shè)計用于電噴包囊的試劑盒可包括，除了藻酸鹽(酯)以外，標(biāo)簽和微載體、一種或更多種成分選自聚丙烯酸鹽(酯)以及與丙烯酸、甲基丙烯酸及其酯的共聚物、纖維素基的聚合物、含有丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、苯乙烯磺酸鹽(酯)、乙烯基吡啶、乙烯乙醇、烯丙醇的共聚物以及丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，帶有少量季銨基團(tuán)。試劑盒可包括膠凝齊U，其優(yōu)選包括Ca2+、Sr2+或Ba2+離子。還包括的可以是一個或更多個噴針，其優(yōu)選具有0. 2至2mm之間的內(nèi)徑，并且是平的或倒棱幾何形的。設(shè)計用于LbL的試劑盒可包括，例如，除了藻酸鹽(酯)以外的一種或更多種聚電解質(zhì)溶液、標(biāo)簽和微載體。細(xì)胞的組合的系列培養(yǎng)分開-匯聚細(xì)胞培養(yǎng)此外形成細(xì)胞單元(尤其是顯微細(xì)胞單元)對于取樣多組織培養(yǎng)條件是有用的，因為各細(xì)胞單元構(gòu)成可暴露于各種細(xì)胞培養(yǎng)條件的易于操作的單元。根據(jù)本發(fā)明，通常通過在微載體培養(yǎng)中生長細(xì)胞來產(chǎn)生細(xì)胞群，以及術(shù)語細(xì)胞單元、細(xì)胞群、集落和珠用于描述微載體細(xì)胞培養(yǎng)的成分。用于取樣大量細(xì)胞培養(yǎng)條件尤其高效的方法涉及組合的細(xì)胞培養(yǎng)或分開-匯聚細(xì)胞培養(yǎng)，并且在一個實施方式中涉及系列的再分和合并細(xì)胞單元的群以便取樣細(xì)胞培養(yǎng)條件的多重組合。在本發(fā)明的一方面中，通過將細(xì)胞單元的最初起始培養(yǎng)(或不同起始培養(yǎng))劃分至Xi數(shù)目的等份，各份含有在不同培養(yǎng)條件下分開生長的多個珠(群/集落/載體)，來實施方法。細(xì)胞培養(yǎng)一給定時間之后，可用特異的標(biāo)記包囊細(xì)胞單元，然后可以通過組合和混合來自不同等份的珠匯聚細(xì)胞單元。該庫可以再次分開至X2數(shù)目的等份，各等份在不同條件下培養(yǎng)一段時間，用另一特異的標(biāo)記(其可以是相同的或，優(yōu)選，不同的)包囊，然后再匯聚。這種細(xì)胞單元的分開、培養(yǎng)、包囊和匯聚(或匯聚、分開和培養(yǎng)；取決于從何處進(jìn)入循環(huán))的反復(fù)程序允許系統(tǒng)性取樣很多不同細(xì)胞培養(yǎng)條件的組合。實驗的復(fù)雜性，或換言之待測試的不同細(xì)胞培養(yǎng)條件組合的數(shù)目，等于各輪取樣的不同條件的數(shù)目的乘積(X1XX2X…Xn)。注意的是，在隨后分開之前匯聚所有細(xì)胞單元的步驟是可選的；其中匯聚有限數(shù)目的細(xì)胞單元的步驟可以具有相同的作用。因此本發(fā)明體現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)條件多重組合的系統(tǒng)性取樣的多種相關(guān)方法，其中批量操作細(xì)胞單元群。各輪細(xì)胞培養(yǎng)之后，或確定數(shù)目的輪之后，可以分析細(xì)胞單元來確定是否有成員展現(xiàn)出增加的細(xì)胞增殖或特定表型或基因型。這可以通過各種技術(shù)來實現(xiàn)，例如通過在顯微鏡下視覺檢查細(xì)胞單元，或通過對細(xì)胞特有的標(biāo)志物產(chǎn)物進(jìn)行定量。這可以是內(nèi)源性標(biāo)志物比如特定DNA序列、或可以通過配體或抗體檢測的細(xì)胞蛋白質(zhì)。作為替代，外源性標(biāo)志物，比如綠色熒光蛋白(GFP)，可引入至要分析的細(xì)胞單元來提供特定的實時(活)細(xì)胞讀出。相反地，死細(xì)胞可以使用各種方法標(biāo)記，例如使用碘化丙碇。此外，標(biāo)記的細(xì)胞單元可 以從未標(biāo)記的細(xì)胞單元中通過各種技術(shù)分離，人工的和自動的，包括熒光激活的分選，例如使用 COPAS 設(shè)備(Union Biometrica)。分開-匯聚(和分開-分開)培養(yǎng)操作的其它實例可以在W02004/031369、W02007/063316和W02007/023297中找到，各文獻(xiàn)并入此處作為參考。出于說明的目的，在如下實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實施例I藻酸鹽(酯)溶液的制備粉末形式的藻酸鹽(酯)混合至去離子水或磷酸鹽緩沖鹽水-CaCl2-MgCl2(PBS—)(沒有Ca或Mg離子的PBS溶液)中，給出按重量百分比為1-5%之間的藻酸鹽(酯)混合物。使用約20ml的每g微載體以3%溶于PBS。攪拌混合物直至完全溶解。然后溶液進(jìn)行高壓滅菌或無菌過濾來確保溶液無菌。固化溶液的制備Ca2+、Sr2+或Ba2+離子將和藻酸鹽(酯)溶液交聯(lián)成水凝膠。通過將CaCl2以200mM的濃度溶解于水中制備固化溶液。用磁力攪拌器攪拌溶液直至完全溶解。包囊器(Encapsulator)的準(zhǔn)備使用NISCO包囊器(NISC0 Engineering AG，瑞士)進(jìn)行包囊。如果之前沒有進(jìn)行，清潔并消毒儀器和其所有成分，使用新的硅酮管。選擇具有0. 8mm內(nèi)徑且平端幾何形(相對于倒棱的)的針，插入至噴射儀器的魯爾鎖頭(luer lock)并用手弄緊。地電極插入至組裝體(assembly)，弄緊螺絲并連接地電極纜?；蛘撸姌O接電，而針接地。針端到電極的間距設(shè)定為2cm，使用7kV的電壓。CaCl2溶液置于小燒杯中，燒杯在針的下面包括磁力攪拌-棒。內(nèi)-置的磁力攪拌器設(shè)為30 %并在這一點上開啟。來自組裝體的接地電極棒伸入至液體中，從而使其接地，來阻止液體帶電并排斥滴?；鞈乙旱闹苽浯业膯卧?，其是來自之前包囊步驟的微載體、細(xì)胞(簇或分散的)或珠，用PBS洗滌，棄去液體并重懸于藻酸鹽(酯)溶液中。Iml的這種混懸液帶入至注射器中，并直接注射至包囊器的管中。通過這樣做，避免了注射器中珠/微載體的沉淀(settling)。噴射的準(zhǔn)備第二注射器填裝有純的(plain)藻酸鹽(酯)來推待包囊的材料，注射器連接至注射器泵。注射器泵的流速設(shè)為5ml/h?？墒褂眉sl_20ml/h范圍中的流速。噴射為了噴射滴，按照儀器的說明書，施加跨針和電極的電壓?？梢灾貜?fù)程序，制備更多的珠并將它們注射至儀器，以便包囊更多的材料。珠的回收當(dāng)完成過程時，關(guān)閉注射器泵、電壓和磁力攪拌器，移開含有交聯(lián)溶液和包囊的收集燒杯。包囊沉淀在燒杯底部，并可以移至falcon管或其它容器。珠用PBS洗滌若干次，并重懸于所需的溶液(PBS、DMEM等)中。結(jié)果顯示于圖I至4中。
_9]儀器設(shè)定和變量包囊微載體
權(quán)利要求
1.一種微囊，其包括活細(xì)胞和標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微囊，其包括細(xì)胞單元。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的微囊，其中所述標(biāo)記是RFID標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的微囊，其包括兩個或更多個囊層。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微囊，其中所述兩個或更多個囊層各自包括一個或更多個標(biāo)記。
6.根據(jù)任意前述權(quán)利要求所述的微囊，其中所述微囊是由層-層加入聚電解質(zhì)囊形成的。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項所述的微囊，其中所述微囊是通過噴射包囊形成的。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項所述的微囊，其中所述微囊是通過微流體包囊形成的。
9.根據(jù)任意前述權(quán)利要求所述的微囊，其中所述微囊是由聚合物組成的，組成囊層的聚合物通過并入熒光染料而被標(biāo)記。
10.一種標(biāo)記細(xì)胞單元的方法,包括步驟 (a)提供一個或更多個細(xì)胞單元，各單元包括一個或更多個細(xì)胞；以及 (b)和一個或更多個第一標(biāo)記共同微包囊細(xì)胞單元。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，還包括(c)和第二標(biāo)記共同重復(fù)步驟(b)的微包囊。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的方法，其中所述第一標(biāo)記和第二標(biāo)記是不同的。
13.一種用多個標(biāo)記來標(biāo)記一群細(xì)胞的方法，包括步驟 a)提供第一群一個或更多個細(xì)胞單元，各單元包括一個或更多個細(xì)胞； (b)和第一鑒定標(biāo)記共同微包囊所述細(xì)胞單元； (c)任選，將細(xì)胞單元與已經(jīng)和第二鑒定標(biāo)記微包囊的一個或更多個細(xì)胞單元混合形成第二群； (d)使用第三鑒定標(biāo)記，用第二群重復(fù)步驟(b)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述第一、第二和第三標(biāo)記中的至少兩個是不同的。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第一群細(xì)胞單元在步驟(c)之前或之后分裂至兩個或更多個群。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞單元的群暴露于不同培養(yǎng)條件。
17.—種標(biāo)記暴露于多個培養(yǎng)條件的一群細(xì)胞的方法，包括步驟 a)提供第一套細(xì)胞單元的群，各單元包括一個或更多個細(xì)胞，以及將所述群暴露于所需的培養(yǎng)條件； (b)和鑒定標(biāo)記共同微包囊所述細(xì)胞單元； (c)匯聚兩個或更多個所述群來形成至少一個庫； (d)再重分庫來產(chǎn)生又一套細(xì)胞單元的群； (d)將所述又一套的群暴露于所需的培養(yǎng)條件； (e)重復(fù)(b)-(d)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項所述的方法，其中通過噴射程序進(jìn)行微包囊，所述噴射程序任選選自生物-電噴射、空氣動力-輔助的生物-噴射和壓力-輔助的細(xì)胞噴射。
19.根據(jù)權(quán)利要求13至17任一項所述的方法，其中通過層-層加入聚電解質(zhì)進(jìn)行微包囊。
20.根據(jù)權(quán)利要求13至19任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞單元包括至少一個微載體和一個或更多個細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求10至20任一項所述的方法，其中所述標(biāo)記選自熒光化合物、仲胺、穩(wěn)定同位素的混合物、條形碼、光學(xué)標(biāo)簽、珠、量子點和射頻編碼標(biāo)簽。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述標(biāo)記是微球。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述培養(yǎng)條件選自生長培養(yǎng)基、溫度狀況、基質(zhì)、大氣條件和物理細(xì)胞操作。
24.根據(jù)權(quán)利要求10至23任一項所述的方法，其中基本上各微囊含有單一細(xì)胞單元。
25.根據(jù)權(quán)利要求10至23任一項所述的方法，其中基本上各微囊含有多個細(xì)胞單元。
26.根據(jù)權(quán)利要求10至23任一項所述的方法，其中各微囊含有多個細(xì)胞單元，各細(xì)胞單元本身是各自被微包囊的。
27.一種微包囊的細(xì)胞單元，其包括與第一鑒定標(biāo)記共同包囊于第一微囊中的至少一個細(xì)胞單元，所述包囊的細(xì)胞單元其本身與第二鑒定標(biāo)記共同包囊于第二微囊中。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的微包囊的細(xì)胞單元，其中所述第二微囊包括多個微包囊的細(xì)胞單元。
29.一種用于包囊細(xì)胞單元的試劑盒,包括 (a)微載體； (b)可檢測的標(biāo)簽； (c)藻酸鈉；和任選地 (d)聚電解質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及包囊活細(xì)胞和標(biāo)記的方法，以及用于進(jìn)行這種包囊的包囊的標(biāo)記的細(xì)胞和試劑盒。包囊的細(xì)胞可用于多重平行的組織培養(yǎng)實驗，其中各微囊中的標(biāo)記可用于解碼經(jīng)過一系列培養(yǎng)步驟的細(xì)胞途徑。
文檔編號A61K9/16GK102713613SQ201080047567
公開日2012年10月3日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月22日
發(fā)明者C·J·約翰遜, P·K·奧登瓦爾德, S·N·賈亞辛哈, Y·初 申請人:可塑細(xì)胞有限公司