細(xì)胞培養(yǎng)基的病毒過濾的制作方法
【專利說明】細(xì)胞培養(yǎng)基的病毒過濾
【背景技術(shù)】
[0001] 在生物制藥行業(yè)，病毒學(xué)安全是很重要的問題。盡管為了減小風(fēng)險(xiǎn)做出了很多努 力，但是生物制品的包含大規(guī)模病毒污染的事件已經(jīng)在行業(yè)內(nèi)受到廣泛關(guān)注。具體描述的 事件包含，例如Genzyme于2009年在它的CH0(中國倉鼠卵巢）細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測到水泡 疫病毒屬2117污染,該事件阻止了 Ccrczynu、?和Fabrazymc?的生產(chǎn)；以及默克于2010年 在Rotarix?疫苗中檢測到豬圓環(huán)病毒1污染。一個(gè)可能的污染源發(fā)生于細(xì)胞培養(yǎng)階段。除 了對生產(chǎn)企業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)壓力（一個(gè)報(bào)告中，估計(jì)每10000L生物反應(yīng)器遭受的污染加上來 自機(jī)構(gòu)的罰款可以導(dǎo)致上億的損失），這種事件也會給病人帶來風(fēng)險(xiǎn)并中斷生物制藥產(chǎn)品 的制備（Liu et al.，Biotechnol. Prog. 2000, 16, 425-434)。其結(jié)果是，監(jiān)管審查加強(qiáng)，以及 對病毒污染的檢測、防止和補(bǔ)救技術(shù)的需求也在加強(qiáng)。
[0002] 總體而言，病毒污染可以被分為上游病毒污染和下游病毒污染。下游污染可以通 過使用封閉系統(tǒng)控制，然而，特別是，上游污染難以控制，其甚至難以通過大量的測試檢測。 病毒污染也可能源自于在生物制藥生產(chǎn)中所使用源自動(dòng)物的材料。其中，所述生產(chǎn)細(xì)胞系 沒有外源病毒污染物，而且生產(chǎn)不涉及使用源自動(dòng)物的材料，但病毒污染物仍然可以通過 細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)入。例如，合成培養(yǎng)基中可能添加了由含有血清的系統(tǒng)產(chǎn)生的重組生長因子， 然而無蛋白培養(yǎng)基可能包含過濾后的蛋白水解物。然而，病毒污染甚至可發(fā)生于整個(gè)化合 物成分清楚的培養(yǎng)基中，這是因?yàn)榇罅康呐囵B(yǎng)基成分可能保存在未經(jīng)滅菌的容器中。傳統(tǒng) 的除菌級濾器既沒有設(shè)計(jì)預(yù)防病毒污染物，也不能夠防范病毒污染物，所以需要使用其他 措施以確保病毒安全性。
[0003] 在生產(chǎn)過程中的一個(gè)或多個(gè)檢查點(diǎn)進(jìn)行外來病毒的檢測是一種標(biāo)準(zhǔn)操作。然而， 對于生物制藥產(chǎn)品的病毒污染來說，單獨(dú)的檢測是一種不充分的措施，特別是，病毒污染物 的存在是未預(yù)測的、未知的或是一種新興病毒制劑。這種病毒制劑甚至能夠逃脫精心設(shè)計(jì) 的對大量病毒測序的DNA微陣列的檢測。該挑戰(zhàn)還包含感染細(xì)胞培養(yǎng)基所需的低水平的病 毒污染物以及目前有限的檢測試驗(yàn)靈敏度。
[0004] 高滴度的病毒污染物可能不以改變細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)（例如，超出它們的正常范圍的 培養(yǎng)密度、蛋白滴度）的形式而顯現(xiàn)。另一方面，感染力試驗(yàn)具有高度特異性，并且每種病 毒需要不同的條件。由于病毒污染，下游設(shè)備、流體和產(chǎn)品可能被污染，批次裝備、廢物處 理、銷售喪失和凈化會導(dǎo)致百萬美元。由于樣品的異質(zhì)性和涉及的生物制藥生產(chǎn)過程的大 體積，因此，難以徹底的篩選原材料中的病毒。
[0005] 清除病毒的技術(shù)可以被分為兩組：滅活和過濾。滅活方法導(dǎo)致病毒感染力不可逆 的損失，然而，過濾方法力圖機(jī)械性地減少病毒污染物。傳統(tǒng)的滅活方法使用暴露于紫外線 (UV)照射、Y照射、加熱、低或高pH、或溶劑/清潔劑的方法。例如，UV照射能夠有效地且 不可逆地消除病毒活性，但是對于大規(guī)模生產(chǎn)可能是無法操作的或者對于成品培養(yǎng)基是不 適合的。高壓滅菌法雖然對于熱穩(wěn)定液體是可行的，但是可能改變敏感型的培養(yǎng)基。一種 已知的替代方法是高溫短時(shí)（HTST)熱處理，其雖然不苛刻，但是需要昂貴的設(shè)備、自動(dòng)化 程序和驗(yàn)證程序以維持培養(yǎng)基特征。暴露于低或高pH的方法，對于可能的病毒污染物范圍 是不起作用的，其會不利地影響培養(yǎng)基的質(zhì)量或滲透性。暴露于溶劑/清潔劑的方法，同樣 不是一個(gè)廣譜方法，其僅對含有脂質(zhì)膜的病毒有效。因此，理想的方法應(yīng)該在成本考慮和達(dá) 到清除原材料病毒的需求之間取得平衡，并能提供一種不影響生長速度或產(chǎn)量的廣譜解決 方案。
[0006] 病毒保留過濾提供了適當(dāng)?shù)钠胶?。它不會用化學(xué)方法改變培養(yǎng)基成分，也適合用 于熱敏感型飼料/培養(yǎng)基。此外，由于它以體積排阻原理起作用，因此，病毒保留過濾是一 種廣譜解決方案。然而，病毒保留濾膜是很昂貴的（大約每平方米約2000至5000歐元）。 由于所需膜面積的費(fèi)用，培養(yǎng)基體積過濾的比流速（specific flow rate)低的特征使得該 方法對于適于大規(guī)模生物反應(yīng)器的大規(guī)模生產(chǎn)造成了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。例如，其中，病毒過濾以串 聯(lián)形式連接，以進(jìn)行無菌級培養(yǎng)基過濾，病毒過濾優(yōu)選在一個(gè)工作日內(nèi)完成，即在制備大批 量（bulk)培養(yǎng)基后最長2至10小時(shí)，以防止大批量培養(yǎng)基的污染。因此，在此關(guān)鍵時(shí)間窗 內(nèi)需要大的過濾面積，但這反過來會增加成本。
[0007] 令人驚異地發(fā)現(xiàn)，所述現(xiàn)有技術(shù)中的病毒過濾的缺點(diǎn)可通過各自制劑（其為細(xì)胞 培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)基的至少一個(gè)成分）在病毒過濾器上進(jìn)行至少大約24小時(shí)的過濾來克 月艮，其中，該病毒過濾器具有最大75nm的有效孔徑。如果各自制劑所需的體積在較長時(shí)間 范圍內(nèi)過濾，例如至少24小時(shí)，那么病毒過濾器的容積需要極大地增加。此外，還令人驚異 地發(fā)現(xiàn)，通過這種延長時(shí)間，可以實(shí)現(xiàn)總體病毒滴度的顯著降低。這對于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的 上游病毒清除是特別有益的。
[0008] 因此，本發(fā)明的方法通過分別增加生產(chǎn)量和容積來加強(qiáng)病毒過濾的經(jīng)濟(jì)效率。根 據(jù)本發(fā)明所述的方法在容積為至少2000L/m 2時(shí)進(jìn)行，因此，有助于使高容量病毒過濾器的 利用最大化，并降低與之相關(guān)的實(shí)際成本，并提供了一個(gè)適于大規(guī)模生產(chǎn)和易于融合到現(xiàn) 存生產(chǎn)過程的解決方案。
[0009] 本發(fā)明所述方法的巨大影響和各自病毒過濾器在無菌生產(chǎn)過程中的創(chuàng)造性使用， 特別是無菌制備過程，例如，所使用的細(xì)胞培養(yǎng)基和緩沖液可以通過以下實(shí)施例的方式來 理解。假設(shè)每平方米病毒濾膜的成本為平均大約3000歐元，所用細(xì)胞培養(yǎng)基的成本為每升 培養(yǎng)基大約10歐元，那么1000L病毒濾過的培養(yǎng)基的成本為每升培養(yǎng)基13歐元，這使得培 養(yǎng)基制劑的成本增加了 30%。如果可以用一個(gè)病毒過濾器膜過濾2000L，那么成本降低到 11. 50歐元。容積的進(jìn)一步增加，例如超過5000L，則可以把成本降低到每升培養(yǎng)基低于0. 6 歐元，這使得提供的病毒過濾后的培養(yǎng)基的額外成本相當(dāng)?shù)?。因此，通過增加病毒過濾方法 的容積，可顯著地降低所使用的病毒過濾器的高成本，特別是對潛在病毒或病毒污染的上 游排除污染的成本。
[0010] 本發(fā)明分別全面地闡述了病毒過濾器的高成本和低容積問題?？蓱{借經(jīng)病毒過 濾器進(jìn)行至少大約24小時(shí)的病毒過濾來增加病毒過濾器的容積，其中，該病毒過濾器具有 最大75nm的有效孔徑。令人驚異地發(fā)現(xiàn)，在維持過濾器完整性的同時(shí)，所用昂貴的病毒過 濾器的容積可以更好地利用至容積增加2~100倍。雖然容積增加2至3倍對生產(chǎn)過程和 相關(guān)生產(chǎn)成本有很大影響，但是根據(jù)本發(fā)明所述的方法可以實(shí)現(xiàn)容積增加至100倍或甚至 更多。這提供了很好的機(jī)會，并使得即使使用昂貴的病毒過濾器，病毒清除的成本也變得高 效；因此，昂貴的病毒過濾器可以用于進(jìn)一步改善細(xì)胞培養(yǎng)過程中的病毒安全性，特別是用 于改善細(xì)胞培養(yǎng)過程、制藥、診斷和/或化妝品和食品過程中的上游病毒清除。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明提供了一種從制劑中清除病毒污染的方法，其中，該制劑為一種細(xì)胞培養(yǎng) 基或細(xì)胞培養(yǎng)基的至少一種成分。該方法包含使所述制劑通過最大有效孔徑為75nm的病 毒過濾器過濾至少大約24小時(shí)。
[0012] 進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及使用最大有效孔徑為75nm的病毒過濾器用于過濾至少大 約24小時(shí)，以清除制劑中的病毒污染物，其中，該制劑為一種細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)基的 至少一種成分。
[0013] 此外，本發(fā)明涉及制劑在細(xì)胞培養(yǎng)、制藥、診斷和/或化妝品制品以及食品制品中 的用途，其中，該制劑為根據(jù)本發(fā)明的任意一種方法所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)基的 至少一種成分。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明所述的所有方法和用途所使用的容積為至少大約2000L/m2,優(yōu)選至少 大約3000L/m 2,最優(yōu)選至少大約5000L/m2。此外，所述制劑需要經(jīng)過過濾，并且分別進(jìn)行過 濾至少24小時(shí)、或至少大約48小時(shí)至大約7個(gè)月、或大約72個(gè)小時(shí)至大約3個(gè)月。該過 濾在大約2°C至大約60°C的溫度之間，或在大約10°C至大約40°C的溫度之間，優(yōu)選在大約 15°C至大約37°C之間進(jìn)行。
[0015] 在本發(fā)明所有實(shí)施方式中，過濾在壓力范圍為大約lOOmbar至大約4000mbar之 間，優(yōu)選在大約200mbar至大約3500mbar之間，最優(yōu)選在大約lOOOmbar至大約3000mbar 之間進(jìn)行。
[0016] 在本發(fā)明的所有實(shí)施方式中，所使用的病毒過濾器為病毒污染物實(shí)現(xiàn)至少lLog1Q 減少值（LRV)。
[0017] 令人驚異地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過濾程序進(jìn)行至少大約24小時(shí)，病毒過濾器的容積可以大大 增加。通常地，在大批量制劑制備之后，用于細(xì)胞培養(yǎng)的制劑例如大批量細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖 液在大約2至大約10小時(shí)以內(nèi)分批過濾，以避免制劑被細(xì)菌或病毒污染。其結(jié)果是，在實(shí)踐 中，過濾程序中所使用的病毒過濾器的最大容積幾乎沒有被利用，所述過濾程序在時(shí)間框 架為大約2至大約10小時(shí)內(nèi)過濾各自制劑。因此，需要使用過多的過濾面積。相比之下，已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于使用本發(fā)明所述的方法，在維持過濾完整性的同時(shí)，所用昂貴的病毒過濾器的 容積可以被利用至容積增加2~100倍。雖然容積增加2至3倍對生產(chǎn)過程和相關(guān)生產(chǎn)成 本有很大影響，但是根據(jù)本發(fā)明所述的方法可以實(shí)現(xiàn)容積增加至100倍或甚至更多。這提 供了很好的機(jī)會，并使得即使使用昂貴的病毒過濾器，病毒清除的成本也變得高效；因此， 昂貴的病毒過濾器可以用于進(jìn)一步改善細(xì)胞培養(yǎng)過程中的病毒安全性，特別是用于改善細(xì) 胞培養(yǎng)過程、制藥、診斷和/或化妝品和食品加工中的上游病毒清除。
[0018] 根據(jù)以下特定實(shí)施方式和權(quán)利要求項(xiàng)的更具體描述，會使本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施 方式更加明顯。
【附圖說明】
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步特別優(yōu)選的說明可參考如附圖所示的特定典型實(shí)施方式。這些附圖 構(gòu)成說明書的一部分。然而，需要注意的是，這些附圖是為了舉例說明本發(fā)明的實(shí)施方式， 因此，不能將其理解為是對實(shí)施方式范圍的限制。
[0020] 圖1表明使用不同的過濾器進(jìn)行流速可控的病毒過濾的病毒過濾動(dòng)力學(xué)（圖1C)， 其中，所述過濾器都結(jié)合添加了 3批不同大豆水解液的細(xì)胞培養(yǎng)基（Kerry HyP印1510#1、 D0M0 SE50MAF UF#1和 #2)。
[0021] 所使用的過濾器和實(shí)驗(yàn)條件（同樣見實(shí)施例1至實(shí)施例4)如下：
[0022] 過濾器 A :Sartorius VirosartCPV，180cm2;在 30 °C 下，流速為大約 30L/ (m2Xhr)；
[0023] 過濾器B :;在30°C下，流速為大約40-60lV(m2Xhr)。
[0024] 過濾進(jìn)行最多9天或直到超過最大壓力2000mbar。圖1A表明每單位膜表面積的 過濾體積相對于時(shí)間的容積，在大約最低4000L/m 2至大約12000L/m 2的范圍內(nèi)。取決于過 濾器類型，過濾終點(diǎn)的最大壓力在大約600mbar至2400mbar (圖1B)之間。一般而言，大豆 水解液之間的區(qū)別對于容積和最大壓力的影響非常地低。
[0025] 圖2表明使用不同的過濾器和結(jié)合