專利名稱：類風濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學領(lǐng)域，特別涉及類風濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原。
背景技術(shù)：
類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以滑膜炎為基本病理改變，以慢性破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯娜硇宰陨砻庖卟。蠖嗖∏槌蔬M行性，最終導致關(guān)節(jié)纖維性或骨性強直而嚴重致殘，嚴重影響患者生活質(zhì)量。未經(jīng)正確治療的類風濕關(guān)節(jié)炎可遷延不愈，甚至導致關(guān)節(jié)畸形。作為自身免疫性疾病，致病抗原驅(qū)動的自身反應性CD4+T細胞活化是類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的核心途徑。對于類風濕關(guān)節(jié)炎的診斷，現(xiàn)在主流仍然沿用1987年美國風濕病學學會RA的分類標準，其主要靠臨床表現(xiàn)并排除其他關(guān)節(jié)炎從而對RA進行判斷。另外，X線改變和類風濕因子也是判斷RA的常用標準。但上述方法操作繁瑣且特異性不高，且不適用于早期診斷。眾所周知，RA的病理改變從滑膜組織開始逐漸向軟骨到骨發(fā)展。RA在早期若未得到有效治療，將會引起關(guān)節(jié)功能障礙甚至勞動力喪失，并導致全身多臟器受累進而危及生命。如果能盡早對RA病情做出診斷，及早治療，從而阻止或延緩其發(fā)展，將能有效的提高RA 的治療效果并減少其并發(fā)癥的發(fā)生。而針對RA早期有高度敏感性和特異性的檢測指標是實現(xiàn)RA早期診斷和治療的前提。早期診斷指標中，IL-8、IL-6水平在巨細胞病毒DNA陽性的類風濕關(guān)節(jié)炎患者中升高和CMV基因組出現(xiàn)之間存在聯(lián)系，但特異性和敏感性低。在RA自身抗體作為檢測指標方面類風濕因子(RF)存在靈敏度低的缺點；在早期RF陰性的類風濕關(guān)節(jié)炎病人中可 53. 3%的病人抗核周因子(APF)呈陽性，但APF抗原片的保存時間較短(僅為1 2周)，檢測穩(wěn)定性低；Μ抗體在類風濕關(guān)節(jié)炎中陽性率為40%，特異性為98. 9%，但類風濕關(guān)節(jié)炎早期僅約23% ；過氧化物還原酶IV (在說明書附圖中簡稱“IV”)和類風濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究尚未有人報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種過氧化物還原酶IV的新應用，該應用是通過在RA滑膜組織中篩選出RA備選抗原，再在備選抗原中篩選出過氧化物還原酶IV并對其抗體在初診和復診RA患者血清中通過間接ELISA進行特異性和敏感性檢測，過氧化物還原酶IV主要表達于RA病變起始部位滑膜細胞胞漿，過氧化物還原酶IV體外特異性刺激RA患者外周血單個核細胞(PBMC)增殖并分泌RA發(fā)病相關(guān)細胞因子IL-17、TNF-α和 IFN- γ，所以過氧化物還原酶IV是新的RA疾病相關(guān)抗原，該抗體檢測的新應用在初診RA患者血清當中特異性和敏感性高，為類風濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷及治療提供了新思路。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
過氧化物還原酶IV在制備類風濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原中的應用。
進一步，所述過氧化物還原酶IV在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應用； 進一步，所述過氧化物還原酶IV在制備類風濕關(guān)節(jié)炎早期診斷試劑中的應用； 進一步，過氧化物還原酶IV在制備類風濕關(guān)節(jié)炎疫苗中的應用。本技術(shù)方案分別利用免疫蛋白組學方法在RA滑膜中篩選出RA備選抗原及抗體， 通過TOF-TOF質(zhì)譜法及免疫蛋白印跡(Western Blotting)法進一步鑒定和驗證備選抗原中的五號蛋白點為過氧化物還原酶IV ；利用Western-blot檢測RA和骨性關(guān)節(jié)炎(OA)滑膜組織中過氧化物還原酶IV表達差異；通過免疫組織化學染色方法證實過氧化物還原酶IV主要表達于RA起始病變部位滑膜細胞胞漿；借助間接法ELISA測定過氧化物還原酶IV抗體在 RA血清中的特異性和敏感性；并發(fā)現(xiàn)過氧化物還原酶IV抗體滴度在初診的早期RA患者(病程少于3個月)中明顯高于正常人，并且高于經(jīng)免疫抑制治療的復診RA患者；通過細胞增殖實驗證實了過氧化物還原酶IV特異性刺激RA外周血單核細胞增殖，并分泌IL-17、TNF- α 和IFN-Y等與RA發(fā)病相關(guān)細胞因子。根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明得出如下結(jié)論過氧化物還原酶IV為RA特異性疾病相關(guān)抗原。在上述研究基礎上針對過氧化物還原酶IV抗原進行改造等方式制備疫苗可能為RA的特異性免疫治療提供新的手段。
本發(fā)明的有益效果在于過氧化物還原酶IV在制備類風濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原中的應用中，其特異性和敏感性高，尤其適用于早期診斷試劑的應用，過氧化物還原酶IV還為制備類風濕關(guān)節(jié)炎疫苗中提供了新思路。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中
圖1為RA滑膜組織蛋白點2-D分離后Coomassie blue染色雙向凝膠電泳圖。圖2為RA患者血清與圖1蛋白點雜交的雙向凝膠電泳圖。圖3為OA患者血清與圖1蛋白點雜交的雙向凝膠電泳圖。圖4為正常人血清與圖1蛋白點雜交的雙向凝膠電泳圖。圖5為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者血清與圖1蛋白點雜交的雙向凝膠電泳圖。圖6為RA滑膜組織中特異性與RA患者血清反應的雙向凝膠電泳圖，包含12個蛋白點。圖7為T0F-T0F蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜對第5號蛋白點的鑒定圖譜。圖8為免疫印跡法蛋白定性檢測電泳譜，其中A為單向凝膠電泳圖(1、2為不同 RA滑膜組織，3、4為Hela細胞陽性對照)，B為RA滑膜組織雙向凝膠電泳圖。圖9為免疫印跡法檢測RA患者和OA患者滑膜組織中過氧化物還原酶IV的差異表達電泳圖(1、2分別為RA和OA滑膜組織)。圖10-A和圖10-B為蘇木素-依紅(HE)染色RA滑膜組織的病理照片圖，圖10_C 和圖10-D為RA滑膜組織過氧化物還原酶IV免疫組化染色的病理照片圖。圖11為PBMC增殖實驗的放射強度(cpm)分析圖，其中A為cpm值分析圖，B為刺激指數(shù)(stimulation index, Si)分析圖。圖12為CFSE染色流式細胞檢測PBMC增殖圖。
圖13為ELISA法檢測過氧化物還原酶IV刺激PBMC IFN- y、IL-17和TNF- α分泌量的分析圖，其中，A為IFN-Y的分析圖，B為IL-17的分析圖，C為TNF-α的分析圖。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實驗材料 1. 1試劑
丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉、Tris、甘氨酸、溴酚藍、二硫蘇糖醇(DTT)、CHAPS、低熔點瓊脂糖、低分子量標準蛋白、IPG緩沖液、IPG膠條(pH3_ll L)、IPG 覆蓋油、尿素和 PhastGel Blue R 購自 Amersham Pharmacia Biotech ；碘乙酰胺購自Sigma;測序級胰蛋白酶購自！Iomega;蛋白酶抑制劑和ECL Western blot檢測試劑盒購自Roche ；甲醇、冰乙酸和無水乙醇購自重慶川東化工(集團)有限公司化學試劑廠； 辣根酶標記山羊抗人IgG (H+L)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG (H+L)、Power VisionTM(IgG 抗體-HRP多聚體)復合物和DAB顯色試劑盒購自北京中山生物技術(shù)公司；鼠抗人過氧化物還原酶IV單克隆抗體購自Abcam公司；Recombinant human過氧化物還原酶IV購自 Lifescience公司；多聚甲醛購自北京化學試劑公司。1. 2 儀器
IPGphor等電聚焦儀、SE600垂直電泳儀、MultiTempIII循環(huán)水浴和TE50X電轉(zhuǎn)儀購自 Amersham Pharmacia Biotech公司；550型酶聯(lián)儀和GS-800圖像掃描系統(tǒng)Bio-Rad公司； MALDI-T0F質(zhì)譜儀購自Bruker公司；低溫高速離心機購自中國科學院武漢科學儀器廠；脫色搖床購自江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；LEICA AM 2135型切片機購自Leica公司；BX-50型Olympus顯微鏡和PM-20型Olympus顯微攝像系統(tǒng)Olympus公司；紫外分光光度儀Backmen公司。主要試劑配制
1.3.1樣品裂解液貯液40 mmol/L Tris, 7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，質(zhì)量分數(shù)為 4%的 CHAPS，Iml/ 管分裝，_70°C凍存。1.3.2 10mg/ml RNase A，_20°C凍存?zhèn)溆谩?. 3. 3 mg/ml DNase I，_20°C凍存?zhèn)溆?br> 1. 3. 4 20X蛋白酶抑制劑1粒蛋白酶抑制劑溶解于350 μ L純水中。1.3.5 1 mol/L DTT，_20°C凍存?zhèn)溆谩?. 3. 6 IPG buffer，4°C保存?zhèn)溆谩?.3.7樣品裂解液工作液40mmol/L Tris, 7 mol/L尿素，2mol/L硫脲，質(zhì)量分數(shù)為 4% 的 CHAPS，100μ g/ml DNase I，25 μ g/ml RNase A, IX 蛋白酶抑制劑，0.8% IPG buffer,60 mmol/L DTT。1. 3. 8溶漲液貯液7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，質(zhì)量分數(shù)為2%的CHAPS，痕量溴酚藍，-70°C凍存。1. 3. 9溶漲液工作液溶漲液貯液中加入質(zhì)量分數(shù)為1 %的IPG buffer, 60 mmol/ L DTT (臨用前加)。1. 3. 10 平衡緩沖液50 mmol/L Tris-Cl pH 8. 8，6 mol/L urea,體積分數(shù)為
530%的glycerol，質(zhì)量分數(shù)為2%的SDS，溴酚藍痕量。1. 3. 11質(zhì)量分數(shù)為0. 5%低熔點瓊脂質(zhì)量分數(shù)為0. 5%的低熔點瓊脂溶解于 SDS-PAGE電泳緩沖液。1. 3. 12 30%丙烯酰胺貯液30g丙烯酰胺，0. Sg甲叉丙烯酰胺溶解于IOOml純水中，過濾，4°C貯存于棕色瓶中。1. 3. 13 4X 分離膠緩沖液1. 5 mol/L Tris-Cl (pH 8. 8) 1.3.14 10% SDS IOg SDS 溶解于 50ml H20 中，定容至 IOOml。1. 3. 15 10%過硫酸銨0. Ig過硫酸銨溶解于Iml純水中。1. 3. 16 SDS-PAGE 電泳緩沖液:94g 甘氨酸，12. Ig Tris, 50ml 10% SDS，溶解于水并定容至1000ml。1. 3. 17考馬斯亮藍染色液貯液溶解1片PhastGel Blue R于80ml水中，攪拌 5-lOmin，加入120mL甲醇，攪拌直至染料完全溶解，過濾溶液備用。1. 3. 18考馬斯亮藍染色液工作液(0. 1% )染色液貯液與體積分數(shù)為20%乙酸按體積比為1 :1的比例混合。1. 3. 19脫色液體積分數(shù)為30%乙醇，體積分數(shù)為10%乙酸溶于水中。1. 3. 20轉(zhuǎn)移緩沖液(39mm甘氨酸，48mmTris堿，質(zhì)量分數(shù)為0. 037%的SDS，體積分數(shù)為20%甲醇)稱取甘氨酸2. 9g，1Tris堿5. 8g，SDS 0. 037g，并加入200ml甲醇，最后加水補充至總體積為1000ml。1. 3. 21 TBS (50mM Tris 堿，150mM 氯化鈉，ρΗ7· 5)稱取 6. 05g Tris 堿，8. 76g 氯化鈉，用HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 5，加水至總體積為1L，2_8°C保存3個月。1. 3. 22 TBST 將 ImLTween 20 加入 IL TBS 中，2_8°C保存 3 個月。1. 3. 23 封閉液加入IOmL封閉液貯液到90mlTBS中，在-15 _25°C穩(wěn)定保存。1. 3. 24 0. 5%封閉液加入5mL封閉液貯液到95mLTBS中，在-15 _25°C穩(wěn)定保存。1.3. 25 一抗(血清)用0. 5%的封閉液稀釋一抗。1. 3. 26 POD標記的抗鼠或兔IgG 用100 μ L純水將凍干粉溶解，得到二抗貯液。 用0.5%的封閉液稀釋得到工作液。40mU/mL 二抗通常足夠用來檢測。該貯液在2_8°C可以保存12個月，但工作液需要新鮮配置。1. 3. 27 ECL檢測溶液將溶液A與溶液B以體積比為1 1的比例混合，該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。1. 3. 28 0. OlM PBS :50mL0. 2mol/L PB 加 8. 8g NaCl，雙蒸水定容至 IOOOmL01. 3. 29 RIPA 裂解液1.5M Nacl ImL，IOOmM Tris-HCL (pH7. 4) 5mL，加質(zhì)量分數(shù)為 10% SDS IOOuL, 500mM DTT 100uL，NP_40 lOOuL，Complete Mini (蛋白酶抑制劑)1 片，
三蒸水定容至10 mL。1. 3. 30 包被液0. 85M (PH 9. 6)碳酸鹽緩沖液1. 59g Na2CO3 加 2. 93g NaHCO3, 三蒸水定容1000mL。
1.3.31洗滌液0. OlM pH7. 4 PBS +吐溫-20 (T)使最終質(zhì)量分數(shù)為 0. 05%。1. 3. 32底物溶液磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(ρΗ5· 0 5· 5) :0. IM檸檬酸Μ. 3mL加入 25. 7ml 0. 2M Na2HPO4 · 12H20加入鄰苯二胺40. Omg,定容至50mL，臨用前加0. 15mL體積分數(shù)為30%的吐02。
1.3. 33終止劑22. 2mL硫酸加入蒸餾水177. 8mL。1.4樣品5例RA滑膜組織由北京大學附屬人民醫(yī)院風濕免疫科栗占國教授提供；534例RA (其中初診67例、復診467例)、65例OA、120例SLE、10例硬皮病 (scleroderma)、15例皮肌炎(dermatomyositis)及120例正常對照(NC)血液標本源自西南醫(yī)院。雙向凝膠電泳法篩選RA滑膜組織中的備選抗原
2.1樣品制備
2. 1. 1取出-70°C凍存的RA滑膜組織樣品，室溫平衡約lOmin，加入樣品裂解液工作液充分研磨，渦旋器上振蕩約20-30min后，室溫放置l_2h，使細胞蛋白充分溶解，經(jīng)過超聲裂解后 40C 12000rpm 1 小時。2.1.2 樣品溶液的蛋白定量(DC Protein Assay, BIO-RAD COMPANY)。2. 1. 2. 1配制蛋白標準液(0. 25mg/ml 1. 5mg/ml蛋白)先將BSA溶解于水配制10mg/mL的BSA母液，然后用樣品裂解液稀釋成0,0. 25,0. 5,1. OU. 5mg/ml五個不同濃度的BSA溶液。2. 1. 2. 2樣品液的稀釋用樣品裂解液將樣品液稀釋10、20倍備用。2. 1. 2. 3準備工作液試劑A0 每Iml試劑A加入20 μ L試劑S (該工作液試劑Α0 可穩(wěn)定1周，即使1天以后形成了沉淀。如果形成了沉淀，加熱溶液并振蕩。不要用加樣槍頭吹打，因為容易堵塞槍頭而改變加入樣品中的試劑體積)。2. 1. 2. 4樣品及標準品Α655值的測定吸取5 μ L標準液和樣品加入干凈、干燥的微孔板。每孔加入25 μ L試劑Α0或試劑Α。每孔加入200 μ L試劑B。15min后，655nm測吸光值。Ih內(nèi)吸光值穩(wěn)定。2. 1. 2. 5建立線性方程，計算樣品蛋白濃度。實驗方法
2. 2. 1 2D-PAGE第一向——等電聚焦
2. 2. 1. 1取出_20°C凍存的IPG strip，室溫平衡數(shù)分鐘。2. 2. 1. 2樣品和溶漲液在IPG holder中混合，達到合適的上樣量，去掉IPG膠條的保護膜，膠面朝下，避免產(chǎn)生氣泡，放入溶漲液中。IPG膠條上覆蓋一層礦物油，蓋上蓋子， 溶漲過夜。2. 2. 1. 3儀器運行參數(shù)如下
等電聚焦運行參數(shù)溫度，20°C ；最大電流，50mA per IPG strip ；樣品體積， 350 μ 1 (180mm IPG strip)或 250 μ 1 (130mm IPG strip) ；30V，10-12 小時(溶漲)；200V, 1 小時；500V, 1 小時；500-8000V, 30min ；8000V, 5-6 小時(IPG 3-10L)，6-7 小時(IPG 4-7)。2. 2. 1. 4達到適當?shù)目傠妷?時間積(Total Volt-hours, Vh)后，取出膠條于平衡液中平衡。2. 2. 2 平衡
2. 2. 2. 1 IOOmg DTT溶解于IOmL平衡緩沖液中(平衡緩沖液I )。取出IPG膠條分別放入玻璃管中，在振蕩儀上振蕩平衡15min。2. 2. 2. 2 400mg碘乙酰胺溶解于IOmL平衡緩沖液(平衡緩沖液II )，將膠條轉(zhuǎn)移到平衡緩沖液II中，蓋上蓋，在振蕩儀上振蕩平衡15min。2. 2. 3 2D-PAGE 第二向-SDS-PAGE
權(quán)利要求
1.過氧化物還原酶IV在制備類風濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述過氧化物還原酶IV在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述過氧化物還原酶IV在制備類風濕關(guān)節(jié)炎早期診斷試劑中的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于過氧化物還原酶IV在制備類風濕關(guān)節(jié)炎疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學領(lǐng)域，特別涉及過氧化物還原酶Ⅳ在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑，所述過氧化物還原酶Ⅳ在制備類風濕關(guān)節(jié)炎早期診斷試劑中的應用，過氧化物還原酶Ⅳ在制備類風濕關(guān)節(jié)炎特異性抗原中的應用中，其特異性和敏感性高，尤其適用于早期診斷試劑的應用，過氧化物還原酶Ⅳ還為制備類風濕關(guān)節(jié)炎疫苗中提供了新思路。
文檔編號A61P19/02GK102344916SQ20111002563
公開日2012年2月8日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者吳喬, 吳玉章 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學