專利名稱：帶afp啟動子的腺病毒載體介導的il-24在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用的制作方法
帶AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL-24在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用
技術(shù) 領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種將基因治療方法應用于肝癌治療中，特別是一種帶AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL-24在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用。
背景技術(shù)：
肝癌起病隱匿、進展快、侵襲性強、易轉(zhuǎn)移、發(fā)病率和死亡率高，在我國居惡性腫瘤的首位，且傳統(tǒng)的手術(shù)、化療及放療效果均不理想，為此，國內(nèi)外都在尋找和開展肝癌治療的新方法。隨著分子生物學的發(fā)展，特別是重組DNA技術(shù)的建立，使得各種病毒用作載體成為可能。其中，腺病毒載體在基因治療、基因免疫等方面應用開發(fā)得較早的一種基因載體，已經(jīng)發(fā)展成為基因免疫和基因治療的轉(zhuǎn)移載體。因為腺病毒載體安全和轉(zhuǎn)導效率高， 所以成為腫瘤基因治療最常用的載體?；蛑委熥鳛閻盒阅[瘤治療的一部分，為改善腫瘤患者預后提供了一條新的解決途徑和方案。在基因治療的適應證中，腫瘤位居第一，占 66. 2%。在我國已有兩個腫瘤基因治療用腺病毒載體被SFDA批準上市。目前以腺病毒為載體介導外源基因用于癌癥治療的并且獲得批文的僅Ad_P53， 其外源基因為P53蛋白，啟動子為CMV，CMV是一個高強表達的沒有組織特異性的啟動子， 因此，所有感染此缺陷病毒的細胞中均有P53表達，沒有組織特異性，并且Ad-P53也僅對因 P53突變而引發(fā)的癌癥有效，因此具有P53依賴性。腺病毒載體具有許多獨特的優(yōu)點腺病毒粒子相對穩(wěn)定；安全性較好，在人類的腫瘤細胞中尚未發(fā)現(xiàn)有腺病毒的整合，未發(fā)現(xiàn)其與人類腫瘤的發(fā)生有直接關(guān)系；腺病毒基因組較大(36 kb)，插入大片段外源性基因的潛力大；細胞及動物實驗表明，腺病毒載體很容易將外源基因直接轉(zhuǎn)移到靶細胞中，并使其在細胞內(nèi)有效表達成活性蛋白；腺病毒基因組較易操作。同時，宿主細胞較為廣泛，除了可在腸道和呼吸道繁殖以外，還可以感染肝細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等多種人體細胞，腺病毒載體感染的非組織特異性的優(yōu)點在于可作為多種癌癥的治療載體，但是帶來另一個負面效應是腺病毒載體介導的外源基因也會癌細胞外的正常組織細胞中表達，帶來一些不可預測的副面效應.
黑色素瘤分化相關(guān)基因7 (mda-7/IL-24)是利用減數(shù)雜交技術(shù)，從人的黑色素瘤細胞株HO-I中克隆的新基因。它屬于IL-10家簇成員之一，因此重新被命名為IL-24. IL-24是一個具備理想的腫瘤抑制基因特點的基因①選擇性只在癌細胞中促進增長抑制和凋亡， 而且抑癌具有廣譜性；②能引導強烈的旁路抗腫瘤效應(從而抵消低轉(zhuǎn)導效應)；③協(xié)同其他的治療方案(放療，化療)；④放大免疫過程(進一步強烈提高對腫瘤細胞的損傷)；⑤ 抗血管生成的作用(抑制腫瘤的血液供應)。II期臨床研究也證明其有效性與安全性，因此在抑癌方面具有極大的臨床抗腫瘤應用價值，癌癥基因治療可能就此打開一片全新的窗AFP是甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)，其啟動子僅在胎盤中表達，絕大部分肝細胞癌組織具有恢復AFP表達的特性，蛋白質(zhì)的表達由其啟動子的組織特異性決定，因此，在AFP啟動子的介導下使抑癌基因IL-M僅在肝癌細胞中表達，在其它組織來源的細胞與正常肝細胞中不表達。因此，發(fā)明開發(fā)針對某一特定組織來源的癌細胞的治療性腺病毒載體就成為目的最重要的任務。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的是一種帶AFP (人源與鼠源甲胎蛋白alpha-fetoprotein，AFP)啟動子的腺病毒載體介導的IL-M在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，即以肝癌特異性啟動子AFP來介導外源基因IL-M只有在肝癌細胞中才表達并誘導相應的癌細胞凋亡， 即使同樣是肝細胞，在正常肝細胞中IL14也不表達，因此具有高度的選擇性，減少可能的副作用，增強靶向性。1、帶AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL-M在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，其中AFP為甲胎蛋白(alpha-fetoprotein)，AFP啟動子包括人源或鼠源兩種。2、帶AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL-M在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，其中=IL-M是利用減數(shù)雜交技術(shù)，從人的黑色素瘤細胞株HO-I中克隆的新基因，其基因包含一個信號肽系列，系列如下
1 ATGAATTTTC AACAGAGGCT GCAAAGCCTG TGGACTTTAG CCAGCAGACC
51CTTCTGCCCTCCTTTGCTGGCGACAGCCTCTCAAATGCAGATGGTTGTGC101TCCCTTGCCTGGGTTTTACCCTGCTTCTCTGGAGCCAGGTATCAGGGGCC151CAGGGCCAAGAATTCCACTTTGGGCCCTGCCAAGTGAAGGGGGTTGTTCC201CCAGAAACTGTGGGAAGCCTTCTGGGCTGTGAAAGACACTATGCAAGCTC251AGGATAACATCACGAGTGCCCGGCTGCTGCAGCAGGAGGTTCTGCAGAAC301GTCTCGGATGCTGAGAGCTGTTACCTTGTCCACACCCTGCTGGAGTTCTA351CTTGAAAACTGTTTTCAAAAACTACCACAATAGAACAGTTGAAGTCAGGA401CTCTGAAGTCATTCTCTACTCTGGCCAACAACTTTGTTCTCATCGTGTCA451CAACTGCAACCCAGTCAAGAAAATGAGATGTTTTCCATCAGAGACAGTGC501ACACAGGCGGTTTCTGCTATTCCGGAGAGCATTCAAACAGTTGGACGTAG551AAGCAGCTCTGACCAAAGCCCTTGGGGAAGTGGACATTCTTCTGACCTGG601ATGCAGAAATTCTACAAGCTCTGA
3、帶AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL-M在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，其中用人源或鼠源AFP啟動子取代腺病毒載體中CMV啟動子，并將IL-M基因克隆到 AFP啟動子下游，使IL-M基因的表達受AFP啟動子的控制.腺病毒載體作為外源基因表達載體攜帶IL-M基因進入肝癌細胞，IL-24在組織特異性啟動子AFP的控制下特異性表達，即僅在肝癌細胞中表達，在正常肝細胞及其它組織來源的細胞中不表達，從而誘實施例1、帶鼠源AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL14在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，其中腺病毒載體中CMV啟動子被鼠源AFP啟動子所取代，IL-24位于AFP啟動子下游。
1 試劑材料核酸內(nèi)切酶為！^erments公司產(chǎn)品，腺病毒質(zhì)粒pDC315、 pPGHloxPAE3購自深圳市百恩維生物科技有限公司，H印!3B、!fepG II、SMMC27721、正常肝細胞系L02、Hela為本實驗室保存，293購自武漢大學CCTCC。
2 引物
HAFPl AAGCTTTAGAAAATCCTGGTGCHAFP2 TGTTATTGGCAGTGGTGGAMAFPlGGATACTGTGAGCAGTMAFP2:GGATATTTTACTTGAIL2401 ATGAATTTTCAACAGAGGCTGCA,IL2402 CAAAGTGAAACTCTTGGCCCTGGGTIL2403 GCCCAGGGCCAAGAGTTTCACTTTIL2404 TCAGAGCTTGTAGAATTTCTGCATCCAIL2405 ATG GGGGCCCAGGGCCAAGALUC-f ATGGAAGACGCCAAAAACATALUC-R TTACACGGCGATCTTTCCeGFP-F:ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGeGFP-R:TCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG
以上引物均為上海生物工程有限公司合成。3 方法
3. 1鼠源與人源AFP啟動子的擴增基本方法參照《分子克隆》，取AFP陽性的鼠肝癌組織參照TataRa Blood Goneme DNA Extraction KIT的操作說明提取基因組DNA。以MAFPl 與MAFP2為引物擴增鼠源AFP啟動子，以HAFPl與HAFP2為引物從IfepG II基因組中克隆人源AFP啟動子，膠回收片段，雙酶切插入質(zhì)粒PDC315相應位點，替代pDC315中原有的 CMV啟動子，構(gòu)建AFP控制的表達載體AdMAFP與AdHAFP。結(jié)果1 從鼠中擴增的AFP啟動子大小為991bp，經(jīng)雙酶切鑒定后測序，所測定的序列如下
GGATACTGTGAGCAGTAGCGCTGAAGTTCTTTTATATCCTTTTTAAGTGATGTCTGTTAACTAGTAACCTTC AGTGGGCAAACATGTTACTTTTTTTCCTTATGTTGAAGTTAGGCAATTTGCCAATAATTAACAGCACAGGGGTCACT TCTATCTTATGTTCAAGGACAAAGACCACTTCAGAGTGGAAAAAAAAAAACAAAACCTTGCAAATGCTGCAAATGTT CTCTGCCAACTAAACTCTTCCAATAGAAAGTATCTCCTAAGCTGAAGAAAGATTTATTTATTTCAATGTAAAACATT GATACAGCCATAAAGAAAATATAGCAGGCTTACTATGTAGCTCCAAATGCATTAATTCTTTTTTTAAAAAAAATAGT AAAATGCATGTTGCATGCTAGGCGCTGAACGTATGTCTGAGTCATTCAGACTCTTCATCAGTGGGTGTATTTCTTAA TTATCCAGTTGTTATTTAGCTCAAAACCATTGGTCAAGGGGGTGTATTTAATTTTGTGTTTCGTGTCTGGTTTAACA TAGAAAACTTACAGCACAAAGCCTGATGAACGAGTTCCCATTCTAATGTCGTGTGCCAAAGGCTATTCTGCATGTAT GTCACAGATGCATGGGTTAGCTACAGCACCCTCTCAGGCCCTTGGGATGATGATGCTAACACTAACTAACGAGCACT GATATACTCTGACCCTGGGCAGGCTTCATCTCATACCTTCACCCTCGGTGTCCCGGAGTCTGTGACAGTTTCTTTAG TTCTCTACACATCAGAGAGATGCAAACTTGTAAAGAAAAATTCCCAGTGCGCATCTAAACTATACTCGGACTTTTTC TTTTTATGTGCTCAGAGTTTGATGCATATGTGCATCTGTTCTGCAAGGTCAGAAGAGGCAATGGAATCCGGGATCAG CTTTGTTATCAGACGTATCTGGCCGGGGGGATCTTACTTCAGTGGCTGACATGTGGCTCAAGTAAAATATCC
結(jié)果2 從H印G II中擴增的AFP啟動子大小為981bp，經(jīng)雙酶切鑒定后測序，所測定的序列如下aagctttagaaaatcctggtgcctgggtctcaactccacagattctgatttaactggtctgggttacagact aggcattgggaattcaaaaagttcccccagtgattctaatgtgtagccaagatcgggaacccttgtagacagggatg ataggaggtgagccactcttagcatccatcatttagtattaacatcatcatcttgagttgctaagtgaatgatgcac ctgacccactttataaagacacatgtgcaaataaaattattataggacttggtttattagggcttgtgctctaagtt ttctatgttaagccatacatcgcatattaaatactttaaaatgtaccttattgacatacatattaagtgaaaagtgt ttctgagctaaacaatgacaacataattatcaagcaatgataatttgaaatgaatttattattctgcaacttaggga caagtcatctctctgaattttttgtactttgagagtatttgttatatttgcaagatgaagagtctgaatcggtcaga caatctcttgtgtgcctggcatatgataggcatttaatagttttaaagaattaatgtatttagatgaattgcatacc aaatctgctgtcttttctttatggcttcattaacttaatttgagagaaattaattattctgcaacttagggacaagt catctctttgaatattctgtagtttgaggagaatatttgttatatttgcaaaataaaataagtttgcaagttttttt tttctgccccaaagagctctgtgtccttgaacataaaatacaaataaccgctatgctgttaattattggcaaatgtc ccattttcaacctaaggaaataccataaagtaacagatataccaacaaaaggttactagttaacaggcattgcctga aaagagtataaaagaatttcagcatgattttccatattgtgcttccaccactgccaataaca
3.2 IL-24基因的克隆IL-24基因購自武漢三鷹公司，分別選擇引物IL2403與 IL2402先對IL-24基因進行定點突變，再用引物IL2401與IL2404克隆包含1_49位氨基酸的信號序列全長IL-24，該基因命名為SIL-24，所合成的蛋白能外分泌表達，用引物 IL2405與IL2404擴增一個不包含1_49位氨基酸的信號序列，命名為NSIL-24，所合成的蛋白不能分泌表達。同時分別用引物LUC-F與LUC-R擴增Iuciferase酶基因，用eGFP-R 與eGFP-F擴增GFP基因，再將這些基因分別構(gòu)建到AdMAFP與AdHAFP中，最后的質(zhì)粒分另命名為 AdMAFP-SIL-24，AdMAFP-NSIL-24, AdMAFP-LUC, AdMAFP-GFP, AdHAFP-SIL-24, AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC, AdHAFP-GFP,其中 AdMAFP-GFP 與 AdHAFP-GFP 主要用于病毒包裝指示用，AdMAFP-LUC與AdHAFP-LUC主要用于陰性對照。3.3 腺病毒的重組按腺病毒載體操作手冊將質(zhì)粒AdMAFP-SIL-24， AdMAFP-NSIL-24, AdMAFP-LUC, AdMAFP-GFP, AdHAFP-SIL-24, AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC, AdHAFP-GFP 分別與 pBGHloxp Δ E3 通過 Lipo2fectamine2000 共轉(zhuǎn)染至 293 細胞。共轉(zhuǎn)染后15天左右出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3-5次病毒空斑純化，kakaRa試劑盒提取重組腺病毒DNA，再分別用2中的引物進行PCR鑒定，以確定重組腺病毒DNA中成功克隆了 AFP啟動子、IL-24基因、LUC基因與GFP基因，將鑒定正確的增殖缺陷型腺病毒命名分別命名為 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdHAFP-LUCV, AdHAFP-GFPV 進行大量擴增、純化與滴度測定。結(jié)果腺病毒AdM AFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdHAFP-LUCV, AdHAFP-GFPV 在 293 細胞內(nèi)反復擴增，CsCl超速離心純化，獲得高度濃縮的病毒液。經(jīng)TCID50測定，AdMAFP-SIL-24V， AdMAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdHAFP-LUCV，AdHAFP-GFPV 病毒滴度分別是達 6. 1 XlOlOpfu /ml,5. OX IOlOpfu /ml、 5. 3X IOlOpfu /ml、5. 1 XlOlOpfu /ml,5. 6 XlOlOpfu /ml、5. OX IOlOpfu /ml、4. 2 XlOlOpfu /ml, 5. 1 XlOlOpfu /ml。3.4 IL-24定向表達的測定測定所用的細胞系分別為肝癌細胞系H印G II、正常肝細胞系L02與Hela，分別用六孔板按5X104細胞數(shù)/孔接種上述細胞，在培養(yǎng)24h后，分別按 M0I=5 的感染復數(shù)接種 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V缺陷型腺病毒，先輕搖2h然后吸除上清，再換用2%血清培養(yǎng)液，培養(yǎng) 48h,收集細胞，以不加病毒的細胞同步培養(yǎng)作為對照，用AdMAFP-GFPV與AdMAFP-GFPV實驗組在熒光顯微鏡下觀察指示病毒包裝，用測定Iuciferase酶活性來判定人源與鼠源AFP 啟動子的活性，按TataRa公司Protein and RNA Extraction Kit試劑盒的說明分別提取 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL_24V 組的細胞提取液，并以提取液進行 SDS-Page 電泳，用 Western Blotting 分析 IL-24 在 AdMAFP-SIL-24V， AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-SIL-24V，AdHAFP-NSIL-24V 中的表達，其中 IL-24 與 IL-24 單克隆抗體購自SANTA公司，WB方法為常規(guī)方法。用常規(guī)Iuciferase酶法測定Iuciferase的活性。結(jié)果表明，AFP啟動子能介導外源基因在肝癌細胞中特異性表達，在正常的肝細胞及非肝癌組織來源的細胞中不表達，同時腺病毒介導的IL-24在肝癌中表達時有高度的糖基化。LUCIFERASE酶活測定結(jié)果AFP啟動子在肝癌細胞中有較強的表達活性。3. 5 AdMAFP-SIL-24V, AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 誘導肝癌細胞凋亡的效果。用流式細胞儀測定AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdHAFP-LUCV，對肝癌細胞凋亡的影響。肝癌細胞系和正常肝細胞系培養(yǎng)條件為含10%小牛血清、100 mg/L鏈霉素以及100 mU/L青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基、37 ！及5% C02。細胞培養(yǎng)至至對數(shù)生長期，消化，稀釋，計數(shù)，轉(zhuǎn)種至24孔板中培養(yǎng)，105細胞數(shù)/孔，培養(yǎng)24h;去除培養(yǎng)液，每孔加入約Iml無血清培養(yǎng)液，以MO I =50分別加入上述病毒，對照組為AdHAFP-LUCV，孵育 90min,加入含 5% FBS 的培養(yǎng)液。AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdHAFP-LUCV，處理 24 h 后，離心收集細胞并用冷的 PBS 洗兩次，然后用75%酒精重懸，-20°C冰箱固定過夜，固定過的細胞用600g離心力離心回收，再用冰預冷的PBS洗滌兩次，然后用溶于PBS的100 ug/ml RNase A在37 °C處理lh， 最后在黑暗中4 °C冰箱PI (20 ug/ml)處理30 min，最后上機測定。實驗結(jié)果表明AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V能明顯誘導肝癌凋亡，而對正常肝細胞及Hela細胞沒有明顯影響，而對照組AdMAFP-LUCV，AdHAFP-LUCV則誘導肝癌凋亡效率較低，表明AdMAFP-SIL-24V， AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 對肝癌凋亡的誘導作用主要是IL-24本身，并且AFP能啟動外源基因在肝癌細胞中特異性表達，同時結(jié)果還顯示 AdMAFP-SIL-24V, AdHAFP-SIL-24V 的效果要比 AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-NSIL-24V 高， 這可能與IL-24的外分泌對肝癌凋亡有放大作用，能引導強烈的旁路抗腫瘤效應。表明 AdMAFP-SIL-24V, AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 都具有開發(fā)成特異性抗肝癌基因治療新藥，其中優(yōu)以AdMAFP-SIL-24V與AdHAFP-SIL-24V為最佳，具有天發(fā)抗肝癌基因治療藥物的潛力。黑色素瘤分化相關(guān)基因7(mda-7/IL-24)是利用減數(shù)雜交技術(shù)，從人的黑色素瘤細胞株HO-I中克隆的新基因。它屬于IL-10家簇成員之一，因此重新被命名為IL-24. IL-24 是一個具備理想的腫瘤抑制基因特點的基因①選擇性只在癌細胞中促進增長抑制和凋亡，而且抑癌具有廣譜性；②能引導強烈的旁路抗腫瘤效應(從而抵消低轉(zhuǎn)導效應)；③協(xié)同其他的治療方案(放療，化療)；④放大免疫過程(進一步強烈提高對腫瘤細胞的損傷)； ⑤抗血管生成的作用(抑制腫瘤的血液供應)。II期臨床研究也證明其有效性與安全性， 因此在抑癌方面具有極大的臨床抗腫瘤應用價值，癌癥基因治療可能就此打開一片全新的窗口。AFP是甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)，其啟動子僅在胎盤中表達，絕大部分肝細胞癌組織具有恢復AFP表達的特性，蛋白質(zhì)的表達由其啟動子的組織特異性決定，因此，在AFP啟動子的 介導下使抑癌基因IL-24僅在肝癌細胞中表達，在其它組織來源的細胞與正常肝細胞中不表達。本發(fā)明的優(yōu)點在于高效的基因傳遞載體充分利用腺病毒載體安全和轉(zhuǎn)導效率高的特點；治療基因表達的調(diào)控利用肝癌特異性表達的AFP啟動子能介導外源目的基因能在肝癌細胞中特異性定向表達的特性，實現(xiàn)靶向性治療肝癌的目的；有效的治療基因 IL-24具有廣譜性、旁路效應以及協(xié)同性的特點，構(gòu)建能在肝癌細胞中特異性定向表達的能高效誘導癌細胞凋亡的治療性腺病毒栽體，實現(xiàn)其對肝癌的靶向治療作用，從而提高基因表達產(chǎn)物在腫瘤局部的濃度，并通過IL-24的旁路效應放大其治療效果，同時與放療與化療等其它藥物協(xié)同作用提高治療效率。實現(xiàn)將治療基因、高效的基因傳遞載體、治療基因表達的調(diào)控有效綜合利用。本發(fā)明的另一個優(yōu)點在于它是以肝癌特異性啟動子AFP來介導外源基因IL-24， 只有在肝癌細胞中外源基因才表達并誘導相應的癌細胞凋亡，即使同樣是肝細胞，在正常肝細胞中IL-24也不表達，因此具有高度的選擇性，減少可能的副作用，增強靶向性。另外， IL-24具有廣譜的抗癌性，不依賴于P53蛋白，也不依賴于Rb蛋白等。本發(fā)明治療肝癌的方法與放療、化療與手術(shù)法相比還有三個突出的優(yōu)點，一是副作用小，放療與化療對人的上皮細胞等血細胞特別是免疫細胞均有較強的副作用，沒有選擇性，而本發(fā)明的治療方法僅針對肝癌細胞有誘導凋亡作用，對其它組織來源細胞與正常的肝細胞均無副作用，二是IL-24 不但不能損傷免疫系統(tǒng)，還能增強免疫系統(tǒng)的功能，與放療與化療聯(lián)合使用增強放療與化療的效果，三是手術(shù)主要針對未擴散的肝癌，對已擴散的肝癌細胞無能為力，而本治療載體對擴散或未擴散肝癌細胞均有治療效果，因為對已擴散的癌細胞同樣具有同樣的感染能力并誘導其凋亡，因此能明顯提高肝癌晚期病人的生存能力。


圖1為本發(fā)明的效果實施例圖；Lo2正常肝細胞，Hela卵巢癌細胞，其它均是肝癌細胞。
具體實施例方式
實施例1、帶鼠源AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL-24在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，其中腺病毒載體中CMV啟動子被鼠源AFP啟動子所取代，IL-24位于AFP啟動子下游。1 試劑材料核酸內(nèi)切酶為Ferments公司產(chǎn)品，腺病毒質(zhì)粒pDC315、 pPGHloxPAE3購自深圳市百恩維生物科技有限公司，H印3B、!fepG II、SMMC27721、正常肝細胞系L02、Hela為本實驗室保存，293購自武漢大學CCTCC。
2 引物
MAFPl GGATACTGTGAGCAGT MAFP2 GGATATTTTACTTGA IL2401 ATGAATTTTCAACAGAGGCTGCA, IL2402 CAAAGTGAAACTCTTGGCCCTGGGT IL2403 GCCCAGGGCCAAGAGTTTCACTTT IL2404 TCAGAGCTTGTAGAATTTCTGCATCCA IL2405 ATG GGGGCCCAGGGCCAAGA LUC-f ATGGAAGACGCCAAAAACATA LUC-R TTACACGGCGATCTTTCC eGFP-F: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG eGFP-R TCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG 以上引物均為上海生物工程有限公司合成。3 方法
3. 1鼠源AFP啟動子的擴增基本方法參照《分子克隆》，取AFP陽性的鼠肝癌組織參照 TataRa Blood Goneme DNA Extraction KIT 的操作說明提取基因組 DNA。以 MAFPl 與 MAFP2為引物擴增鼠源AFP啟動子，切膠回收片段，雙酶切插入質(zhì)粒pDC315相應位點， 替代pDC315中原有的CMV啟動子，構(gòu)建AFP控制的表達載體AdAFP。結(jié)果從鼠中擴增的AFP啟動子大小為991bp，經(jīng)雙酶切鑒定后測序，所測定的序列如下
GGATACTGTGAGCAGTAGCGCTGAAGTTCTTTTATATCCTTTTTAAGTGATGTCTGTTAACTAGTAACCTTC AGTGGGCAAACATGTTACTTTTTTTCCTTATGTTGAAGTTAGGCAATTTGCCAATAATTAACAGCACAGGGGTCACT TCTATCTTATGTTCAAGGACAAAGACCACTTCAGAGTGGAAAAAAAAAAACAAAACCTTGCAAATGCTGCAAATGTT CTCTGCCAACTAAACTCTTCCAATAGAAAGTATCTCCTAAGCTGAAGAAAGATTTATTTATTTCAATGTAAAACATT GATACAGCCATAAAGAAAATATAGCAGGCTTACTATGTAGCTCCAAATGCATTAATTCTTTTTTTAAAAAAAATAGT AAAATGCATGTTGCATGCTAGGCGCTGAACGTATGTCTGAGTCATTCAGACTCTTCATCAGTGGGTGTATTTCTTAA TTATCCAGTTGTTATTTAGCTCAAAACCATTGGTCAAGGGGGTGTATTTAATTTTGTGTTTCGTGTCTGGTTTAACA TAGAAAACTTACAGCACAAAGCCTGATGAACGAGTTCCCATTCTAATGTCGTGTGCCAAAGGCTATTCTGCATGTAT GTCACAGATGCATGGGTTAGCTACAGCACCCTCTCAGGCCCTTGGGATGATGATGCTAACACTAACTAACGAGCACT GATATACTCTGACCCTGGGCAGGCTTCATCTCATACCTTCACCCTCGGTGTCCCGGAGTCTGTGACAGTTTCTTTAG TTCTCTACACATCAGAGAGATGCAAACTTGTAAAGAAAAATTCCCAGTGCGCATCTAAACTATACTCGGACTTTTTC TTTTTATGTGCTCAGAGTTTGATGCATATGTGCATCTGTTCTGCAAGGTCAGAAGAGGCAATGGAATCCGGGATCAG CTTTGTTATCAGACGTATCTGGCCGGGGGGATCTTACTTCAGTGGCTGACATGTGGCTCAAGTAAAATATCC
3.2 IL-24基因的克隆 IL-24基因購自武漢三鷹公司，選擇引物IL2403與IL2402 先對IL-24基因進行擴增與定點突變，再用引物IL2401與IL2404最后獲得的IL-24基因一個包含1-49位氨基酸的信號序列，該基因命名為SIL-24，所合成的蛋白能外分泌表達， 用引物IL2405與IL2404擴增一個不包含1_49位氨基酸的信號序列，命名為NSIL-24，所合成的蛋白不能分泌表達。同時分別用引物LUC-F與LUC-R從質(zhì)粒載體上擴增Iuciferase 酶基因，用eGFP-F與eGFP-R從質(zhì)粒載體上擴增GFP基因。這些基因經(jīng)雙酶切后，分別 構(gòu)建到 AdMAFP 中，最后的質(zhì)粒分另命名為 AdMAFP-SIL-24，AdMAFP-NSIL-24, AdMAFP-LUC, AdMAFP-GFP。其中AdMAFP-GFP主要用于病毒包裝指示用，AdMAFP-LUC主要用于陰性對照。
結(jié)果，各組基因克隆圖片可參考見說明書附圖中的圖1
3.3 腺病毒的重組按腺病毒載體操作手冊將質(zhì)粒AdMAFP-SIL-24， AdMAFP-NS I L-24, AdMAFP-LUC, AdMAFP-GFP 分另Ij 與 pBGHloxp Δ Ε3 通過 L ipo2fectamine2000共轉(zhuǎn)染至293細胞。共轉(zhuǎn)染后15天左右出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3_5次病毒空斑純化，kakaRa試劑盒提取重組腺病毒DNA，再分別用2中的引物進行PCR鑒定， 以確定重組腺病毒DNA中成功克隆了 AFP啟動子、IL-24基因、Iuciferase酶基因與GFP基因。將鑒定正確的增殖缺陷型腺病毒命名分別命名為AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V， AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV進行大量擴增、純化與滴度測定。結(jié)果腺病毒AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V，AdMAFP-LUCV，AdMAFP-GFPV 在 293細胞內(nèi)反復擴增，CsCl超速離心純化，獲得高度濃縮的病毒液。經(jīng)TCID50測定， AdMAFP-SIL-24V, AdMAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV 病毒滴度分別是達 6. 1 XlOlOpfu /ml、5. OX IOlOpfu /ml >5. 3X IOlOpfu /ml、5. 1 XlOlOpfu /ml。3.4 IL-24定向表達的測定測定所用的細胞系分別為肝癌細胞系H印G II、 H印3B以及對照細胞系(正常肝細胞系L02與Hela)，分別用六孔板按5X104細胞數(shù)/孔接種上述細胞，在培養(yǎng)24h后，分別按M0I=5的感染復數(shù)接種AdMAFP-SIL-24V， AdMAFP-NSIL-24V缺陷型腺病毒，先輕搖2h然后吸除上清，再換用2%血清培養(yǎng)液，培養(yǎng) 48h,收集細胞，以不加病毒的細胞同步培養(yǎng)作為對照，用AdMAFP-GFPV實驗組在熒光顯微鏡下觀察指示病毒包裝，用測定Iuciferase酶活性來判定鼠源AFP啟動子的活性，按 TataRa 公司 Protein and RNA Extraction Kit 試劑盒的說明分別提取 AdMAFP-SIL_24V， AdMAFP-NSIL-24V組的細胞提取液，并以提取液進行SDS-Page電泳，用Western Blotting 分析 IL-24 在 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V 中的表達，其中 IL-24 與 IL-24 單克隆抗體購自SANTA公司，WB方法為常規(guī)方法。用常規(guī)LUCIFERASE酶法測定Iuciferase的活性。表達片段可以參考見說明書附圖中的圖2
結(jié)果表明，AFP啟動子能介導外源基因在肝癌細胞中特異性高效表達，在正常的肝細胞及非肝癌組織來源的細胞中不表達，同時腺病毒介導的IL-24在肝癌中表達時有高度的糖基化。LUCIFERASE酶活測定結(jié)果與IL-24的WB檢測結(jié)果相一致。實施例2、人源AFP啟動子替換CMV啟動子的腺病毒載體介導的IL-24在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，其中腺病毒載體中CMV啟動子被人源AFP啟動子所取代， IL-24位于AFP啟動子下游。1 試劑材料核酸內(nèi)切酶為Ferments公司產(chǎn)品，腺病毒質(zhì)粒pDC315、 pPGHloxPAE3購自深圳市百恩維生物科技有限公司，H印3B、!fepG II、SMMC27721、正常肝細胞系L02、Hela為本實驗室保存，293購自武漢大學CCTCC。2 引物
HAFPl AAGCTTTAGAAAATCCTGGTGC HAFP2 TGTTATTGGCAGTGGTGGA IL2401 ATGAATTTTCAACAGAGGCTGCA,IL2402 CAAAGTGAAACTCTTGGCCCTGGGT IL2403 GCCCAGGGCCAAGAGTTTCACTTT IL2404 TCAGAGCTTGTAGAATTTCTGCATCCA IL2405 ATG GGGGCCCAGGGCCAAGA LUC-f ATGGAAGACGCCAAAAACATA LUC-R TTACACGGCGATCTTTCC eGFP-F: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG eGFP-R TCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG 以上引物均為上海生物工程有限公司合成。3 方法
3. 1人源AFP啟動子的擴增基本方法參照《分子克隆》，取H印G II細胞參照TataRa Blood Goneme DNA Extraction KIT(D9081)的操作說明提取基因組DNA。以 HAFPl 與 HAFP2 為引物從H印G II基因組中克隆人源AFP啟動子，切膠回收片段，雙酶切插入質(zhì)粒PDC315 相應位點，替代PDC315中原有的CMV啟動子，構(gòu)建AFP控制的表達載體AdHAFP。結(jié)果從H印G II中擴增的AFP啟動子大小為981bp，經(jīng)雙酶切鑒定后測序，所測定的序列如下
aagctttagaaaatcctggtgcctgggtctcaactccacagattctgatttaactggtctgggttacagact aggcattgggaattcaaaaagttcccccagtgattctaatgtgtagccaagatcgggaacccttgtagacagggatg ataggaggtgagccactcttagcatccatcatttagtattaacatcatcatcttgagttgctaagtgaatgatgcac ctgacccactttataaagacacatgtgcaaataaaattattataggacttggtttattagggcttgtgctctaagtt ttctatgttaagccatacatcgcatattaaatactttaaaatgtaccttattgacatacatattaagtgaaaagtgt ttctgagctaaacaatgacaacataattatcaagcaatgataatttgaaatgaatttattattctgcaacttaggga caagtcatctctctgaattttttgtactttgagagtatttgttatatttgcaagatgaagagtctgaatcggtcaga caatctcttgtgtgcctggcatatgataggcatttaatagttttaaagaattaatgtatttagatgaattgcatacc aaatctgctgtcttttctttatggcttcattaacttaatttgagagaaattaattattctgcaacttagggacaagt catctctttgaatattctgtagtttgaggagaatatttgttatatttgcaaaataaaataagtttgcaagttttttt tttctgccccaaagagctctgtgtccttgaacataaaatacaaataaccgctatgctgttaattattggcaaatgtc ccattttcaacctaaggaaataccataaagtaacagatataccaacaaaaggttactagttaacaggcattgcctga aaagagtataaaagaatttcagcatgattttccatattgtgcttccaccactgccaataaca
3.2 IL-24基因的克隆IL-24基因購自武漢三鷹公司，分別按下圖的方式LUC、 SIL-24與NSIL-24基因克隆方法與實施例1相同，這些基因經(jīng)雙酶切后，分別構(gòu)建到 AdHAFP 中，最后的質(zhì)粒分另命名為 AdHAFP-SIL-24，AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC， AdHAFP-GFP。其中AdHAFP-GFP主要用于病毒包裝指示用，AdHAFP-LUC主要用于陰性對照。 3.3腺病毒的重組按腺病毒載體操作手冊進行，具體方法參照實施例1， 將鑒定正確的增殖缺陷型腺病毒命名分別命名為AdHAFP-SIL-24，AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC, AdHAFP-GFP。進行大量擴增、純化與滴度測定。結(jié)果腺病毒AdHAFP-SIL-24，AdHAFP-NSIL-24，AdHAFP-LUC，AdHAFP-GFP。在 293細胞內(nèi)反復擴增，CsCl超速離心純化，獲得高度濃縮的病毒液。經(jīng)TCID50測定，AdHAFP-S IL-24，AdHAFP-NS I L-24, AdHAFP-LUC, AdHAFP-GFP。病毒滴度分別是達 5. 6XlOlOpfu /ml、5. OX IOlOpfu /ml、4. 2 XlOlOpfu /ml, 5. 1 XlOlOpfu /ml。3.4 IL-24定向表達的測定測定所用的細胞系分別為肝癌細胞系H印3B、 IfepG II以及對照細胞系(正常肝細胞系L02與Hela)，分別用六孔板按5X104細胞數(shù)/孔接種上述細胞，在培養(yǎng)24h 后，分別按M0I=5的感染復數(shù)接種AdHAFP-SIL-24， AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC，AdHAFP-GFP。缺陷型腺病毒，先輕搖2h然后吸除上清， 再換用2%血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h，收集細胞，以不加病毒的細胞同步培養(yǎng)作為對照，用 AdHAFP-GFPV實驗組在熒光顯微鏡下觀察指示病毒包裝，用測定Iuciferase酶活性來判定人源與鼠源AFP啟動子的活性，按TataRa公司Protein and RNA Extraction Kit試劑盒的說明分別提取AdHAFP-SIL-24V與AdHAFP-NSIL-24V組的細胞提取液，并以提取液進行 SDS-Page 電泳，用 Western Blotting 分析 IL-24 在 AdHAFP-SIL-24V 與 AdHAFP-NSIL-24V 中的表達，其中IL-24與IL-24單克隆抗體購自SANTA公司，WB方法為常規(guī)方法。用常規(guī) LUCIFERASE酶法測定Iuciferase的活性。結(jié)果表明，AFP啟動子能介導外源基因在肝癌細胞中特異性表達，在正常的肝細胞及非肝癌組織來源的細胞中不表達。實施例3 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 誘導肝癌細胞凋亡的效果。用流式細胞儀測定AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdHAFP-LUCV，對肝癌細胞凋亡的影響。肝癌細胞系和正常肝細胞系培養(yǎng)條件為含10%小牛血清、100 mg/L鏈霉素以及100 mU/L青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基、37 ！及5% C02。細胞培養(yǎng)至至對數(shù)生長期，消化，稀釋，計數(shù)，轉(zhuǎn)種至24孔板中培養(yǎng)，105細胞數(shù)/孔，培養(yǎng)24h;去除培養(yǎng)液，每孔加入約Iml無血清培養(yǎng)液，以MO I =50分別加入上述病毒，對照組為AdHAFP-LUCV，孵育 90min,加入含 5% FBS 的培養(yǎng)液。AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdHAFP-LUCV，處理 24 h 后，離心收集細胞并用冷的 PBS 洗兩次，然后用75%酒精重懸，-20°C冰箱固定過夜，固定過的細胞用600g離心力離心回收，再用冰預冷的PBS洗滌兩次，然后用溶于PBS的100 ug/ml RNase A在37 °C處理lh， 最后在黑暗中4 °C冰箱PI (20 ug/ml)處理30 min，最后上機測定。實驗結(jié)果顯示圖可以參考見說明書附圖中的圖3
實驗結(jié)果表明 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 能明顯誘導肝癌凋亡，而對正常肝細胞及Hela細胞沒有明顯影響，而對照組AdMAFP-LUCV， AdHAFP-LUCV 則誘導肝癌凋亡效率較低，表明 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V對肝癌凋亡的誘導作用主要是IL-24本身，并且AFP能啟動外源基因在肝癌細胞中特異性表達，同時結(jié)果還顯示AdMAFP-SIL-24V， AdHAFP-SIL-24V 的效果要比 AdMAFP-NSIL-24V，AdHAFP-NSIL-24V 高，這可能與 IL-24 的外分泌對肝癌凋亡有放大作用，能引導強烈的旁路抗腫瘤效應。表明AdMAFP-SIL-24V， AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 都具有開發(fā)成特異性抗肝癌基因治療新藥，其中優(yōu)以AdMAFP-SIL-24V與AdHAFP-SIL-24V為最佳。
權(quán)利要求
1.帶AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL-M在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，其中AFP為甲胎蛋白(alpha-fetoprotein)，AFP啟動子包括人源或鼠源兩種。
2.帶AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL-M在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，其中IL-M利用減數(shù)雜交技術(shù)，從人的黑色素瘤細胞株HO-I中克隆的新基因，其基因包含一個信號肽系列，系列如下1 ATGAATTTTC AACAGAGGCT GCAAAGCCTG TGGACTTTAG CCAGCAGACC51CTTCTGCCCTCCTTTGCTGGCGACAGCCTCTCAAATGCAGATGGTTGTGC101TCCCTTGCCTGGGTTTTACCCTGCTTCTCTGGAGCCAGGTATCAGGGGCC151CAGGGCCAAGAATTCCACTTTGGGCCCTGCCAAGTGAAGGGGGTTGTTCC201CCAGAAACTGTGGGAAGCCTTCTGGGCTGTGAAAGACACTATGCAAGCTC251AGGATAACATCACGAGTGCCCGGCTGCTGCAGCAGGAGGTTCTGCAGAAC301GTCTCGGATGCTGAGAGCTGTTACCTTGTCCACACCCTGCTGGAGTTCTA351CTTGAAAACTGTTTTCAAAAACTACCACAATAGAACAGTTGAAGTCAGGA401CTCTGAAGTCATTCTCTACTCTGGCCAACAACTTTGTTCTCATCGTGTCA451CAACTGCAACCCAGTCAAGAAAATGAGATGTTTTCCATCAGAGACAGTGC501ACACAGGCGGTTTCTGCTATTCCGGAGAGCATTCAAACAGTTGGACGTAG551AAGCAGCTCTGACCAAAGCCCTTGGGGAAGTGGACATTCTTCTGACCTGG601ATGCAGAAATTCTACAAGCTCTGA。
3.如權(quán)利要求1或2所述的帶AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL-M在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，其中用人源或鼠源AFP啟動子取代腺病毒載體中CMV啟動子， 并將IL-M基因克隆到AFP啟動子下游，使IL-M基因的表達受AFP啟動子的控制.腺病毒載體作為外源基因表達載體攜帶IL-M基因進入肝癌細胞，IL-M在組織特異性啟動子 AFP的控制下特異性表達，即僅在肝癌細胞中表達，在正常肝細胞及其它組織來源的細胞中不表達，從而誘導肝癌細胞凋亡，達到靶向性治療肝癌的目的；鼠源與人源AFP啟動子的擴增基本方法參照《分子克隆》，取AFP陽性的鼠肝癌組織提取基因組DNA ；以MAFPl與MAFP2為引物擴增鼠源AFP啟動子，以HAFPl與HAFP2為引物從H印G II基因組中克隆人源AFP啟動子替代pDC315中原有的CMV啟動子，構(gòu)建AFP控制的表達載體AdMAFP與AdHAFP ；結(jié)果從鼠中擴增的AFP啟動子大小為991bp，經(jīng)雙酶切鑒定后測序，所測定的序列如下GGATACTGTGAGCAGTAGCGCTGAAGTTCTTTTATATCCTTTTTAAGTGATGTCTGTTAACTAGTAACCTTC AGTGGGCAAACATGTTACTTTTTTTCCTTATGTTGAAGTTAGGCAATTTGCCAATAATTAACAGCACAGGGGTCACT TCTATCTTATGTTCAAGGACAAAGACCACTTCAGAGTGGAAAAAAAAAAACAAAACCTTGCAAATGCTGCAAATGTT CTCTGCCAACTAAACTCTTCCAATAGAAAGTATCTCCTAAGCTGAAGAAAGATTTATTTATTTCAATGTAAAACATT GATACAGCCATAAAGAAAATATAGCAGGCTTACTATGTAGCTCCAAATGCATTAATTCTTTTTTTAAAAAAAATAGT AAAATGCATGTTGCATGCTAGGCGCTGAACGTATGTCTGAGTCATTCAGACTCTTCATCAGTGGGTGTATTTCTTAA TTATCCAGTTGTTATTTAGCTCAAAACCATTGGTCAAGGGGGTGTATTTAATTTTGTGTTTCGTGTCTGGTTTAACA TAGAAAACTTACAGCACAAAGCCTGATGAACGAGTTCCCATTCTAATGTCGTGTGCCAAAGGCTATTCTGCATGTAT GTCACAGATGCATGGGTTAGCTACAGCACCCTCTCAGGCCCTTGGGATGATGATGCTAACACTAACTAACGAGCACTGATATACTCTGACCCTGGGCAGGCTTCATCTCATACCTTCACCCTCGGTGTCCCGGAGTCTGTGACAGTTTCTTTAG TTCTCTACACATCAGAGAGATGCAAACTTGTAAAGAAAAATTCCCAGTGCGCATCTAAACTATACTCGGACTTTTTC TTTTTATGTGCTCAGAGTTTGATGCATATGTGCATCTGTTCTGCAAGGTCAGAAGAGGCAATGGAATCCGGGATCAG CTTTGTTATCAGACGTATCTGGCCGGGGGGATCTTACTTCAGTGGCTGACATGTGGCTCAAGTAAAATATCC結(jié)果從!fepG II中擴增的AFP啟動子大小為981bp，經(jīng)雙酶切鑒定后測序，所測定的序列如下 aagctttagaaaatcctggtgcctgggtctcaactccacagattctgatttaactggtctgggttacagact aggcattgggaattcaaaaagttcccccagtgattctaatgtgtagccaagatcgggaacccttgtagacagggatg ataggaggtgagccactcttagcatccatcatttagtattaacatcatcatcttgagttgctaagtgaatgatgcac ctgacccactttataaagacacatgtgcaaataaaattattataggacttggtttattagggcttgtgetctaagtt ttctatgttaagccatacatcgcatattaaatactttaaaatgtaccttattgacatacatattaagtgaaaagtgt ttctgagctaaacaatgacaacataattatcaagcaatgataatttgaaatgaatttattattctgcaacttaggga caagtcatctctctgaattttttgtactttgagagtatttgttatatttgcaagatgaagagtctgaatcggtcaga caatctcttgtgtgcctggcatatgataggcatttaatagttttaaagaattaatgtatttagatgaattgcatacc aaatctgctgtcttttctttatggcttcattaacttaatttgagagaaattaattattctgcaacttagggacaagt catctctttgaatattctgtagtttgaggagaatatttgttatatttgcaaaataaaataagtttgcaagttttttt tttctgccccaaagagctctgtgtccttgaacataaaatacaaataaccgctatgctgttaattattggcaaatgtc ccattttcaacctaaggaaataccataaagtaacagatataccaacaaaaggttactagttaacaggcattgcctga aaagagtataaaagaatttcagcatgattttccatattgtgcttccaccactgccaataacaIL-24基因的克隆分別克隆帶信號肽與不帶信號肽的IL-24基因SIL-24與 NSIL-24，同時分別克隆Iuciferase酶基因以及GFP基因；這些基因經(jīng)雙酶切后，分別構(gòu)建到AdMAFP與AdHAFP中，最后的質(zhì)粒分另命名為 AdMAFP-SIL-24, AdMAFP-NSIL-24, AdMAFP-LUC, AdHAFP-SIL-24, AdHAFP-NSIL-24, AdHAFP-LUC, AdHAFP-GFP, AdMAFP-GFP ；其中 AdMAFP-LUC 與 AdHAFP-LUC 主要用于陰性對照，AdHAFP-GFP, AdMAFP-GFP主要用于指示病毒的包裝；腺病毒的重組按腺病毒載體操作手冊將質(zhì)粒AdMAFP-SIL-24，AdMAFP-NSIL-24， AdMAFP-LUC, AdMAFP-GFP, AdHAFP-S I L-24, AdHAFP-NS I L-24, AdHAFP-LUC, AdHAFP-GFP 分別與 pBGHloxp Δ Ε3 通過 Lipo2fectamine2000 共轉(zhuǎn)染至 293 細胞；經(jīng)病毒空斑純化，提取重組腺病毒DNA進行PCR鑒定，將鑒定正確的增殖缺陷型腺病毒命名分別命名為 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdMAFP-GFPV, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdHAFP-LUCV, AdHAFP-GFPV ；IL-24 定向表達的測定用 AdMAFP-SIL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V缺陷型腺病毒分別感染肝癌細胞系H印G II、及對照細胞系(正常肝細胞系L02與Hela)，分別提取各組的細胞提取液，用Western Blotting分析IL-24在 AdMAFP-SIL-24V, AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 中的表達；AdMAFP-SIL-24V, AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V 誘導肝癌細胞凋亡的效果；用流式細胞儀測定 AdMAFP-S IL-24V，AdMAFP-NSIL-24V, AdHAFP-SIL-24V, AdHAFP-NSIL-24V, AdMAFP-LUCV, AdHAFP-LUCV分別感染肝癌細胞系和正常肝細胞系，處理·24 h后，用流式細胞儀測定各組細胞的凋亡率；其中IL-M基因的克隆IL-M基因購自武漢三鷹公司，分別選擇引物ILM03與 ILM02先對IL-M基因進行定點突變，再用引物ILMOl與ILM04克隆包含1_49位氨基酸的信號序列全長IL-24，該基因命名為SIL-24，所合成的蛋白能外分泌表達，用引物ILM05 與ILM04擴增一個不包含1-49位氨基酸的信號序列，命名為NSIL-24，所合成的蛋白不能分泌表達。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種帶人源或鼠源AFP啟動子的腺病毒載體介導的IL-24在制備肝癌靶向性基因治療藥物中的應用，即用人源或鼠源AFP啟動子取代腺病毒載體中CMV啟動子,并將IL-24基因克隆到AFP啟動子下游,使IL-24在組織特異性啟動子AFP的控制下特異性表達,即僅在肝癌細胞中表達,在正常肝細胞及其它組織來源的細胞中不表達,從而誘導肝癌細胞凋亡,達到靶向性治療肝癌的目的。本發(fā)明的優(yōu)點在于1.實現(xiàn)將治療基因、高效的基因傳遞載體、治療基因表達的調(diào)控有效綜合利用實現(xiàn)對肝癌的靶向治療作用；2.副作用低；3.與放療和化療聯(lián)合使用可以增強其效果；4.對已擴散的癌細胞具有較好的治療作用。
文檔編號A61K38/20GK102284064SQ20111003232
公開日2011年12月21日 申請日期2011年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月30日
發(fā)明者張小華, 楊一兵, 范漢東, 郭建軍 申請人:范漢東