專利名稱：一種雙報(bào)告基因重組腺病毒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種含有雙報(bào)告基因的重組腺病毒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的難治性疾病，能否實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的早期診斷、轉(zhuǎn)移預(yù)警及療效預(yù)測(cè)直接關(guān)系到其臨床治療的成敗，亦是人類最終攻克惡性腫瘤難關(guān)的三個(gè)關(guān)鍵突破點(diǎn)。幾十年來(lái)，科研工作者一直在深入研究惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，努力探索突破此三個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題的有效辦法。腫瘤的發(fā)生一般經(jīng)歷了基因突變-生物大分子改變-代謝異常-功能改變/結(jié)構(gòu)改變-出現(xiàn)癥狀的過(guò)程。目前傳統(tǒng)的影像學(xué)診斷是以大體病理學(xué)改變?yōu)榛A(chǔ)的，只有當(dāng)疾病發(fā)展到“功能改變/結(jié)構(gòu)改變”這一階段才能被發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚于分子、細(xì)胞、組織水平階段，因此不能達(dá)到“早期診斷”的目的。分子影像學(xué)是采用影像學(xué)技術(shù)手段無(wú)創(chuàng)性地對(duì)活體內(nèi)參與生理或病理過(guò)程的分子進(jìn)行可視化檢測(cè)，是在活體狀態(tài)下，對(duì)細(xì)胞、分子水平的生物過(guò)程進(jìn)行特征化和定量化研究的一門學(xué)科。分子成像的應(yīng)用可使腫瘤的診斷水平提前至分子異常階段，對(duì)分子水平的病變進(jìn)行進(jìn)·行檢測(cè)，可在體內(nèi)直接觀察到疾病的起因、發(fā)生、發(fā)展等一系列過(guò)程，并觀察疾病的基因、分子水平異常變化和特征，而不單單是疾病終末期的解剖形態(tài)和生理功能改變。磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)、活體光學(xué)成像及核素顯像是分子影像學(xué)領(lǐng)域的三大主體技術(shù)。核素顯像雖然是目前應(yīng)用于臨床的分子影像學(xué)技術(shù)，但是，因存在成像空間分辨率較低，對(duì)細(xì)胞有一定的輻射損傷，觀察時(shí)間受放射性核素衰減的制約，不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間示蹤等缺點(diǎn)，一定程度上限制了核素顯像的應(yīng)用。MRI和活體光學(xué)成像無(wú)輻射損傷，應(yīng)用更為安全，在腫瘤的早期診斷和靶向治療、干細(xì)胞的標(biāo)記與活體示蹤等方面應(yīng)用越來(lái)越廣泛。MRI具有空間時(shí)間分辨率高、可觀察細(xì)胞的動(dòng)態(tài)遷徙過(guò)程、對(duì)比度好、可同時(shí)獲得解剖和生理信息等優(yōu)點(diǎn)，但也具有敏感性相對(duì)不足的缺點(diǎn)；光學(xué)成像雖穿透深度和解剖分辨率有限，但卻具實(shí)時(shí)成像、敏感性高及連續(xù)活體監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。不同的成像技術(shù)各具優(yōu)勢(shì)與不足，多模態(tài)成像(multimodal imaging)策略,即多種成像模式的結(jié)合與優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可解決單一技術(shù)和顯像模式的缺陷，是分子影像學(xué)的發(fā)展方向，將進(jìn)一步推動(dòng)分子影像學(xué)由基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。報(bào)告基因表達(dá)成像是分子影像學(xué)的重要成像類型之一，是將基因通過(guò)載體送到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因表達(dá)，通過(guò)標(biāo)記的特異性配體或酶反應(yīng)的底物和基因表達(dá)生成的受體和酶進(jìn)行特異性結(jié)合達(dá)到間接反映基因表達(dá)過(guò)程的目的，可用報(bào)告基因標(biāo)記靶細(xì)胞實(shí)現(xiàn)細(xì)胞示蹤。現(xiàn)階段，以腺病毒為載體的報(bào)告基因成像多是單報(bào)告基因，即利用腺病毒為載體將單一報(bào)告基因?qū)塍w內(nèi)進(jìn)行基因表達(dá)，因此難以同時(shí)滿足活體光學(xué)及磁共振雙模態(tài)成像的示蹤要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種含有雙報(bào)告基因的重組腺病毒載體及其構(gòu)建方法，本發(fā)明的目的之二是將所述重組腺病毒載體在磁共振成像和活體光學(xué)成像中作為腫瘤示蹤劑應(yīng)用，以便實(shí)現(xiàn)多種成像模式的結(jié)合與優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。本發(fā)明所述重組腺病毒載體，含有人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFRC，在GenBank上的登錄號(hào):匪001128148)和螢火蟲熒光素酶基因(Luciferase，在GenBank上的登錄號(hào)JN244076)，能在真核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白和熒光素酶蛋白，所述人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所述。本發(fā)明所述重組腺病毒載體，其含的編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白的基因在第一巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，其含的編碼熒光素酶蛋白的基因在第二巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，所述第一巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和第二巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子為相同的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)。本發(fā)明所述重組腺病毒載體，編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白的基因序列和編碼熒光素酶蛋白的基因序列被分別放置在兩個(gè)閱讀框架內(nèi)，即所述人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的表達(dá)讀碼框包含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)、人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因和下游的polyA加尾信號(hào)，所述螢火蟲熒光素酶基因的表達(dá)讀碼框包含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)、螢火蟲熒光素酶基因和下游的polyA加尾信號(hào)。本發(fā)明所述重組腺病毒載體，其腺病毒載體為5型El區(qū)和E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷
型病毒。本發(fā)明所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，依次為以下步驟:(I)用PCR方法擴(kuò)增 人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因；(2)將步驟(I)擴(kuò)增的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因片段插入到含有螢火蟲熒光素酶基因片段的穿梭載體pShuttle-CMV-Luciferase上，獲得重組穿梭載體pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase,并進(jìn)行測(cè)序分析；(3)將驗(yàn)證正確后的重組穿梭載體pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase連接到骨架載體pAdeno上，得到重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase ； (4)對(duì)所述重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行XhoI酶切鑒定；(5)用人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞包裝所述重組腺病毒質(zhì)粒，獲得重組腺病毒載體 Ad-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase。將本發(fā)明將所述重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞L0V0，于裸鼠腹股溝區(qū)皮下接種被重組腺病毒感染的人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞L0V0，建立人結(jié)直腸癌皮下異種移植瘤模型。將所述異種移植瘤模型磁共振成像和光學(xué)成像，在高場(chǎng)強(qiáng)的MR圖像中可以清晰地顯示出腫瘤及其與周邊組織關(guān)系的解剖結(jié)構(gòu)信息，尤其是腫瘤向外周侵襲的低信號(hào)改變，在光學(xué)圖像中，腫瘤病灶從接種被重組腺病毒感染的人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞LOVO第I天開(kāi)始，就可以觀察到明顯的細(xì)胞團(tuán)發(fā)光信號(hào)(見(jiàn)圖11-圖13)。實(shí)驗(yàn)表明，可將本發(fā)明所述重組腺病毒載體在磁共振和光學(xué)雙模態(tài)成像中作為腫瘤示蹤劑應(yīng)用。本發(fā)明具有以下有益效果:1、由于本發(fā)明所述重組腺病毒載體含有人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因和螢火蟲熒光素酶基因(雙報(bào)告基因)，當(dāng)用基因工程方法將重組腺病毒載體導(dǎo)入動(dòng)物體或人體后，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的表達(dá)引起細(xì)胞上轉(zhuǎn)鐵蛋白受體增多，因而靶細(xì)胞的磁共振成像效果更好，螢火蟲熒光素酶基因表達(dá)的熒光素酶可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，通過(guò)相應(yīng)的光學(xué)設(shè)備可捕捉這種熒光實(shí)現(xiàn)生物發(fā)光成像，因而便于實(shí)現(xiàn)多種成像模式的結(jié)合與優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，在早期更好地示蹤腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，有利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究，有利于腫瘤的早期診斷及療效監(jiān)測(cè)。2、由于本發(fā)明所述重組腺病毒載體中編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白的基因在第一巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，編碼熒光素酶蛋白的基因在第二巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，且編碼序列被放置在兩個(gè)閱讀框架內(nèi)，因而能獨(dú)立表達(dá)各自的蛋白產(chǎn)物，且轉(zhuǎn)染效率聞。3、由于本發(fā)明所述重組腺病毒載體中的腺病毒載體是El區(qū)和E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型病毒，因而病毒基因最大量的減少，增加了生物安全性，同時(shí)使插入的外源基因增大，提高了載體的適應(yīng)性和穩(wěn)定性。


圖1 重組穿梭載體 pShuttle-CMV-TFRC-CMV-Luciferase 的結(jié)構(gòu)不意圖。圖2是本發(fā)明所述重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFRC)的PCR產(chǎn)物的I %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，圖中M為Ikb DNAladder ；1為人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFRC)。圖4是瓊脂糖凝膠電泳SfiI酶切鑒定重組穿梭載體pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase 的結(jié)果圖，圖中，M 為 Ikb DNAladder ;1_4 中:陽(yáng)性克隆,2.3kb/3.4kb ;陰性克隆只得到3.4kb 一條帶。圖5是瓊脂糖凝膠電泳XhoI酶切鑒定本發(fā)明所述重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase 的結(jié)果圖，圖中，M 為 Ikb DNAladder ;1 與 2 均為陽(yáng)性克隆，由以下 7 個(gè)條帶組成:14kb,ll.7kb，3.lkb，2.66kb，2.47kb，l.45kb，0.6kb ；3 為錯(cuò)誤克隆。圖6是不含TFRC的腺病毒空載體pAdeno-CMV-Luciferase XhoI酶切鑒定結(jié)果，其中M為Ikb DNA ladder ;I為陰性克隆，由以下6個(gè)條帶組成:14kb，11.8kb，4.0kb，2.47kb，
1.45kb, 0.6kbo圖7是瓊脂糖凝膠電泳鑒定本發(fā)明所述重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase 的 PCR 共擴(kuò)增結(jié)果圖，圖中，M 為 Ikb DNA ladder ;1 為目的基因病毒，約 2.3kb (Ad-CMV-TFRC-CMV-Luc i f erase 為模板)，2 為陽(yáng)性對(duì)照，約 2.3k (TFRC原始cDNA質(zhì)粒為模板)，3為陰性對(duì)照(pAdeno-CMV-Luciferase為模板)。圖8是以GFP (綠色熒光蛋白)為標(biāo)記，觀察對(duì)照腺病毒Ad-GFP感染腫瘤細(xì)胞36小時(shí)后熒光顯微鏡觀測(cè)到的熒光表達(dá)情況圖。圖9是用本發(fā)明所述重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染腫瘤細(xì)胞后用WesternBlot定量檢測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體過(guò)表達(dá)情況的凝膠結(jié)果圖,其中Blank為未感染的空白對(duì)照組，Ad-GFP為對(duì)照腺病毒感染的陰性對(duì)照組，Ad-TFRC-Luciferase為陽(yáng)性重組腺病毒感染的實(shí)驗(yàn)組。圖10是用本發(fā)明所述重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染腫瘤細(xì)胞后用Western Blot定量檢測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白 受體過(guò)表達(dá)情況的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(柱狀圖)，其中Blank為未感染的空白對(duì)照組，Ad-GFP為對(duì)照腺病毒感染的陰性對(duì)照組，Ad-TFRC-Luc為陽(yáng)性重組腺病毒感染的實(shí)驗(yàn)組。圖11是用本發(fā)明所述重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染腫瘤細(xì)胞并構(gòu)建結(jié)直腸癌腫瘤動(dòng)物模型的磁共振成像圖，MR成像T2序列可見(jiàn)明顯低信號(hào)病灶。圖12是用本發(fā)明所述重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染腫瘤細(xì)胞并構(gòu)建結(jié)直腸癌腫瘤動(dòng)物模型的磁共振成像圖，MR成像T2*序列可見(jiàn)明顯低信號(hào)病灶。圖13是用本發(fā)明所述重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染腫瘤細(xì)胞并構(gòu)建結(jié)直腸癌腫瘤動(dòng)物模型進(jìn)行光學(xué)成像，光學(xué)成像可見(jiàn)小鼠腹股溝區(qū)病灶發(fā)光信號(hào)。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述重組腺病毒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1:重組腺病毒載體的構(gòu)建

1、材料和方法1.1目的基因、載體質(zhì)粒、細(xì)胞人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFRC)的原始cDNA質(zhì)粒:GeneCopoeia, USA ;穿梭載體pShuttle-CMV-Luciferase和化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5a菌株:上海漢恒公司；骨架載體pAdenoviral Vector (簡(jiǎn)稱 pAdeno):Qbiogene, USA ;人胚腎細(xì)胞系 HEK293 細(xì)胞:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。1.2 試劑所用限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自New England Biolabs公司；T4DNA Iigase為晶美生物公司的 MBI (Fermentas)產(chǎn)品；CIP 酶(Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal)購(gòu)自promega公司；pfx DNA ploymerase購(gòu)自invitrogen公司；質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒(柱離心型)、DNA凝膠回收與純化試劑盒(柱離心型)均購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司；Ikb DNA ladder購(gòu)自鼎國(guó)生物公司；DNA Marker DL2000為大連寶生物的TAKARA產(chǎn)品；DMEM、胎牛血清、胰酶購(gòu)于Hyclone公司；真核轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 脂質(zhì)體為 GIBCO BRL 產(chǎn)品；CsC12 購(gòu)自 Sigma 公司。1.3 儀器PCR擴(kuò)增儀:Applied Biosystems公司；電泳儀:北京六一儀器廠；臺(tái)式多功能高速冷凍離心機(jī)^ppendorf AG ;恒溫水浴鍋，倒置生物顯微鏡，研究級(jí)倒置熒光顯微鏡及圖像分析系統(tǒng):北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱:美國(guó)Thermo公司。1.4引物設(shè)計(jì)與引物合成以GenBank中已發(fā)表的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFRC)的cDNA序列為模板，借助計(jì)算機(jī)引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)2條引物(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)引物序列如下:TFRC-Sfi1-F:AAAAGGCCGCTGCGGCCACCATGATGGATCAAGCTATFRC-Sfi1-R:AAAAGGCCTGTTTGGCCTTAAAACTCATTGTCAATG1.5PCR擴(kuò)增人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFRC)
以人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFRC)的原始cDNA質(zhì)粒為模板，用高保真酶(pfx DNAploymerase)擴(kuò)增TFRC基因片段。在EP管中依次加入以下反應(yīng)物:10Xpfx AmplificationBuffer5 u L>50mM MgS04 I u I> pfx DNA ploymerase(invitrogen,2.5U/u L) 0.6 u I>dNTP (each 10 u M) 1.5 u 1、TFRC-F-BamHI (10 uM)l.5u 1、TFRC-R-EcoRI (10 uM)l.5u 1、模板1.0iU、加ddH20至50iil反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)條件:95°C、5min ;95°C、30s，65°C、30s，72°C、lmin，10 個(gè)循環(huán);95°C、30s，55°C、30s，72°C、lmin，20 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin,置4°C冰箱保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并拍照，用DNA膠回收純化試劑盒回收TFRC條帶。獲得約2.3kb的片段，與預(yù)期大小一致，見(jiàn)圖3。1.6連接上述PCR回收產(chǎn)物至穿梭載體pShutt le-CMV-Luc if erase上將上述PCR回收片段和穿梭載體pShutt le-CMV-Luc if erase用SfiI酶切處理，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5a菌株中，涂布到卡那抗性固體培養(yǎng)基平皿，挑取若干單克隆菌落，接種到卡那抗性液體培養(yǎng)基中，搖床中370C 300rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜(12小時(shí))，小提質(zhì)粒(威格拉斯質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒，具體步驟參照試劑盒使用說(shuō)明)，得到重組穿梭載體pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase。
1.7 重組穿梭載體 pShutt le-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase 的鑒定用SfiI酶切進(jìn)行鑒定，酶切鑒定體系及反應(yīng)條件如下:
重組穿梭載體DNAI^il
IOxBufferl[j,l
IOxBSAI^il
SfiI (NEB,20 U/^il)0.3(^1
ddH20補(bǔ)齊至I Opl
總體積10(^1
37°C1-2 小時(shí)經(jīng)酶切鑒定，其產(chǎn)物與預(yù)期大小一致，見(jiàn)圖4。選取酶切鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序，從上、下游兩端及中間分別進(jìn)行核苷酸全序列分析，其結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)分析及BLAST軟件分析，以驗(yàn)證重組穿梭載體的正確性。分析結(jié)果表明，TFRC核苷酸序列與GeneBank序列完全一致，成功地獲得了重組穿梭載體pShutt le-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase。1.8將驗(yàn)證正確的重組穿梭載體pShutt le-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase連接到骨架載體pAdeno載體上，得到重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase用1-CeuI+1-SceI雙酶切處理骨架載體pAdeno和重組穿梭載體pShuttle-CMV-TFRC-CMV-Luciferase,然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5a菌株中，涂布到氨芐抗性固體培養(yǎng)基平皿，挑取若干單克隆菌落，接種到氨芐抗性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜(12小時(shí))，小提質(zhì)粒，得到重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase。
1.9對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase進(jìn)行XhoI酶切鑒定酶
切鑒定的反應(yīng)條件如下:
重組腺病毒質(zhì)粒DNA1(^1
IOxBufferl[j,l
IOxBSAI^il XhoI (NEB,20 U/^iL)0.3(^1
ddH20補(bǔ)齊至I Opl
總體積IO^il
37°C1-2 小時(shí)XhoI 酶切結(jié)果見(jiàn)圖 5，可以切出 14kb，11.7kb，3.lkb，2.66kb，2.47kb，1.45kb，
0.6kb7個(gè)條帶，與預(yù)期相符，表明重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase構(gòu)建成功。1.10 包裝重組腺病毒質(zhì)粒 pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase為確保重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase被復(fù)制和包裝的效
率，質(zhì)粒大提后首先用PacI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化酶切，反應(yīng)體系如下
pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase5[j,g
IOxBuffer5.0[j,l
PacI (NEB,20 U/^il)1(^1
ddH20補(bǔ)齊至 50(^1
總體積50.0(^1
37°C3-4 小時(shí)然后用Lipofectamine2000脂質(zhì)體按其所附說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體步驟為:a.每個(gè)轉(zhuǎn)染孔取重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase 5 U g,用300 u I的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min。b.取10 ill的Lipof ectamine2000脂質(zhì)體用300 U I的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min。c.將上述a、b步驟的產(chǎn)物混合，室溫避光放置30min。然后將混合物加入到人胚腎細(xì)胞系J1EK293細(xì)胞中。觀察細(xì)胞病變(CPE)，待細(xì)胞大部分病變并從底部脫落進(jìn)行收毒，反復(fù)凍融三次后，取上清進(jìn)行 下一代擴(kuò)增或于-80°C保存?zhèn)溆谩?.11 重組腺病毒載體 Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase 的鑒定取10 ii I重組腺病毒載體做如下處理:Virus10 U I
Priteinase K (lOmg/ml) 2 U IddH2038 U I配成50 u I反應(yīng)體系，50°C水浴lh，100°C煮沸5min，以上述反應(yīng)產(chǎn)物為模板，分別以 TFRC-Sfi1-F 和 TFRC-Sfi1-R 為引物做 PCR 反應(yīng)。PCR 引物:TFRC-Sfi1-F:AAAAGGCCGCTGCGGCCACCATGATGGATCAAGCTAGTFRC-Sfi1-R:AAAAGGCCTGTTTGGCCTTAAAACTCATTGTCAATGPCR 反應(yīng)體系為取模板 DNA lul, Primer F lul, Primer R I u I, IOXTaqBuffer 5u I, dNTP (IOuM) I u I, Taq 0.5u I, ddH20 40.5 u I,反應(yīng)終體積 50u 10 PCR 反應(yīng)條件:94°C 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 2.5min 循環(huán) 30 次；最后 72°C延伸 10min，4°C保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果并拍照，并用DNA膠回收純化試劑盒回收TFRC條帶?？梢?jiàn)約2.3kb處有帶，與TFRC片段相符，證實(shí)為攜帶TFRC基因的重組腺`病毒載體，見(jiàn)圖7。表明成功獲得重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase。1.12重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase的滴度測(cè)定將收集的人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞鋪于2塊96孔板中，每孔100 yl (IO4個(gè)細(xì)胞)。重組腺病毒載體的稀釋:在96孔板的A-H排各加入100 u I標(biāo)記為從IO6開(kāi)始8個(gè)連續(xù)梯度稀釋的重組腺病毒載體液。用同樣的重組腺病毒載體儲(chǔ)存液進(jìn)行第二組的稀釋。加樣完畢后，將培養(yǎng)板置于37°C、CO2孵箱中培養(yǎng)10天，再讀板分析，計(jì)數(shù)CPE個(gè)數(shù)。陰性對(duì)照為100 ill含5% FBS的DMEM的人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞。用TCID50法計(jì)算病毒的滴度，測(cè)定其滴度為l.eXKTPFU/ml，能滿足下一步腫瘤早期示蹤的實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)施例2:重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase對(duì)人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞LOVO的感染及表達(dá)實(shí)驗(yàn)人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞LOVO來(lái)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，對(duì)照Ad-GFP腺病毒來(lái)自上海漢恒公司(GFP表示綠色熒光蛋白)。步驟如下:(I)將人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞LOVO按I X IO6每孔接種至6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，感染前更換培養(yǎng)液；(2)分別加入實(shí)施例1制備得到的重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase及對(duì)照Ad-GFP腺病毒感染人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞LOVO，按照I X IO1Vml滴度，即每孔細(xì)胞加A5u I重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase或?qū)φ誂d-GFP腺病毒液；(3)對(duì)照組的腺病毒Ad-GFP在感染36小時(shí)后，觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)效果，見(jiàn)圖8，從而間接反映了陽(yáng)性組的重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase對(duì)腫瘤細(xì)胞的感染后表達(dá)效果。(4) Western Blot定量檢測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體過(guò)表達(dá)情況,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9、圖10。從圖9、圖10可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組TFR蛋白表達(dá)水平增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例3:重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase的體內(nèi)腫瘤示蹤實(shí)驗(yàn)1.1 儀器活體突光影像系統(tǒng):IVIS, Caliper公司；7.0T micro-MR成像系統(tǒng):德國(guó)Bruker公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
BALB/c裸小鼠，4_5周齡，體重15_18g，15只，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，在四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF(無(wú)特定病原體)級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)間飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)。1.3實(shí)驗(yàn)方法用實(shí)施例1構(gòu)建成功的重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase，以MOI=50的最佳感染復(fù)數(shù)感染人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞L0V0，于裸鼠腹股溝區(qū)皮下接種被重組腺病毒感染的人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞L0V0(1X IO7/只)，建立人結(jié)直腸癌皮下異種移植瘤模型。被重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染的人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞LOVO通過(guò)腺病毒載體中的雙報(bào)告基因能夠過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和熒光素酶，分別通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與Tf-USPIO即轉(zhuǎn)鐵蛋白-超微超順磁性氧化鐵納米顆粒結(jié)合(受體與配體的結(jié)合形式)、熒光素酶與熒光素結(jié)合(酶與底物的結(jié)合形式)的方式同步在MR和光學(xué)雙模態(tài)下無(wú)創(chuàng)活體成像，連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)15天，其成像見(jiàn)圖11-圖13。如圖11、圖12所示，在高場(chǎng)強(qiáng)的MR圖像中可以清晰地顯示出腫瘤及其與周邊組織關(guān)系的解剖結(jié)構(gòu)信息，尤其是腫瘤向外周侵襲的低信號(hào)改變。如圖13所示，在光學(xué)圖像中腫瘤病灶從接種被重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染的人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞LOVO第I天開(kāi)始，就可以觀察到明顯的細(xì)胞團(tuán)發(fā)光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將本發(fā)明所述雙報(bào)告基因重組腺病毒載體作為示蹤劑應(yīng)用于磁共振和光學(xué)雙模態(tài)成像，能將這兩種成像模式結(jié)合并優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，在早期更好地示蹤腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，有利于研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，有利于腫瘤的早期診斷及療效監(jiān)測(cè) 。
權(quán)利要求
1.一種重組腺病毒載體，其特征在于它含有人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因和螢火蟲熒光素酶基因，能在真核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白和熒光素酶蛋白，所述人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體，其特征在于編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白的基因在第一巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，編碼熒光素酶蛋白的基因在第二巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，所述第一巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和第二巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子為相同的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。
3.據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組腺病毒載體，其特征在于編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白的基因序列和編碼熒光素酶蛋白的基因序列被分別放置在兩個(gè)閱讀框架內(nèi)，所述人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的表達(dá)讀碼框包含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因和下游的PolyA加尾信號(hào)；所述螢火蟲熒光素酶基因的表達(dá)讀碼框包含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、螢火蟲熒光素酶基因和下游的polyA加尾信號(hào)。
4.一種重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于依次為以下步驟: (I)用PCR方法擴(kuò)增人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因；(2)將步驟(I)擴(kuò)增的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因片段插入到含有螢火蟲熒光素酶基因片段的穿梭載體pShutt le-CMV-Luc if erase上，獲得重組穿梭載體pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase,并進(jìn)行測(cè)序分析；(3)將驗(yàn)證正確后的重組穿梭載體pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase連接到骨架載體pAdeno上,得到重組腺病毒質(zhì)粒PAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase ； (4)對(duì)所述重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行XhoI酶切鑒定；(5)用人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞包裝所述重組腺病毒質(zhì)粒，獲得重組腺病毒載體Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase。
5.權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述重組腺病毒載體在磁共振和光學(xué)雙模態(tài)成像中作為腫瘤示蹤劑的應(yīng)用。
全文摘要
一種重組腺病毒載體，含有人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因和螢火蟲熒光素酶基因，能在真核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白和熒光素酶蛋白。其構(gòu)建方法，其特征在于依次為以下步驟(1)用PCR方法擴(kuò)增人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因；(2)將步驟(1)擴(kuò)增的人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因片段插入到含有螢火蟲熒光素酶基因片段的穿梭載體上，獲得重組穿梭載體，并進(jìn)行測(cè)序分析；(3)將驗(yàn)證正確后的重組穿梭載體連接到骨架載體上，得到重組腺病毒質(zhì)粒；(4)對(duì)所述重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行XhoI酶切鑒定；(5)用人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞包裝所述重組腺病毒質(zhì)粒，獲得重組腺病毒載體。實(shí)驗(yàn)表明，所述重組腺病毒載體可在磁共振和光學(xué)雙模態(tài)成像中作為腫瘤示蹤劑應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K49/06GK103160539SQ201210108130
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者郜發(fā)寶, 王一帆, 劉婷 申請(qǐng)人:郜發(fā)寶