專利名稱：一種蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)及其用途，尤其是在治療帕金森病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
帕金森病是ー種常見于中老年的神經(jīng)退行性疾病，其主要發(fā)病機制是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的選擇性損傷，從而導(dǎo)致紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(dopamine，簡稱DA)的缺失。目前帕金森病的治療主要通過ロ服左旋多巴(L-D0PA，是DA的前體)來提高紋狀體DA水平，緩解帕金森病臨床癥狀，但是不能從根本上改善多巴胺能神經(jīng)元的病態(tài)，不能延緩和阻止神經(jīng)細胞的衰退進程。隨著多巴胺能神經(jīng)元細胞的不斷缺失，療效降低，且不良反應(yīng)多。有研究通過外科手術(shù)移植胚胎多巴胺能神經(jīng)元細胞，替代腦內(nèi)固有的受損神經(jīng)細胞，補充多巴胺能神經(jīng)元細胞功能，但是由于無法準確控制移植細胞的生長、存活率以及免疫反應(yīng)等，可能產(chǎn)生長期的并發(fā)癥，并且存在操作繁瑣、倫理問題而很難成為ー種常規(guī)的治療策略。近年研究表明，ー些活性蛋白如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、腦細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等具有很強的多巴胺能神經(jīng)元營養(yǎng)、保護作用，可以從根本上減緩或阻止受損多巴胺能神經(jīng)元細胞的衰退進程，并且保護正常的神經(jīng)細胞免受損傷。但是由于這些蛋白半衰期短，且無法自主通過血腦屏障，靜脈給藥后腦內(nèi)不能達到治療濃度，因此，目前只能采用腦定位注射、腦內(nèi)微滲透泵給藥等外科手術(shù)方法直接運送這些蛋白到病變部位以達到治療作用。而對于慢性神經(jīng)退行性疾病的治療通常需要持續(xù)5年、10年甚至更長，腦部外科手術(shù)創(chuàng)傷性大，很難維持長期治療?；蛑委熓巧窠?jīng)退行性疾病治療的有效手段之一。由于⑶NF生理活性較強，其基因?qū)τ谏窠?jīng)退行性疾病也有很好的療效。但由于血腦屏障的限制，基因無法自主從血液循環(huán)進入腦內(nèi)而發(fā)揮療效。目前大量研究采用攜帯GDNF基因的病毒載體通過腦內(nèi)定位注射方法對帕金森病進行治療，常用有腺病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒等。病毒載體的基因轉(zhuǎn)染效率高，持續(xù)時間可達數(shù)月，但是病毒載體存在潛在的安全性問題，如免疫原性等。同時腦內(nèi)定位注射的方法傷害性大，很難長期重復(fù)給藥，無法滿足對于如帕金森病等病程長達數(shù)年或更長的神經(jīng)退行性疾病的治療需要。此外，已知人腦體積約為鼠腦的1000多倍，定位注射后病毒載體的擴散范圍十分有限，無法實現(xiàn)腦部治療基因的廣泛表達。以高分子為核心的非病毒基因載體安全性高，但是轉(zhuǎn)染效率較病毒載體低，且表達持續(xù)時間較短，腦內(nèi)的靶向效率不高。陽離子樹狀高分子材料是ー類納米級的合成高分子，高度分枝，末端氨基豐富，強正電性，并易于經(jīng)過適當?shù)男揎椷B接抗體等生物活性物質(zhì)以增加載體的靶向性。已有研究使用聚酰胺-胺(polyamidoamine，簡稱PAMAM)樹狀高分子有效包載基因進入細胞。但是，單獨采用這些荷強正電性的高分子材料具有一定的不足，如較強的溶血性等，因此經(jīng)過一定的修飾后在基因轉(zhuǎn)運方面有很大的應(yīng)用潛力。
有文獻報道在血腦屏障上存在ー些特異性受體，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白等。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體因其在毛細血管上的表達僅限于腦毛細血管內(nèi)皮而備受關(guān)注。但是，近期的研究表明，轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體的解離常數(shù)(Kd)為1UM，而生理狀態(tài)下循環(huán)系統(tǒng)中游離的轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度很高，約為25 ii M,此濃度對于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體而言幾乎是飽和的，使得轉(zhuǎn)鐵蛋白作為藥物轉(zhuǎn)運載體靶向頭基的應(yīng) 用受到限制。因此，尋找新的腦靶向頭基是克服血腦屏障、提高腦部藥物轉(zhuǎn)運的ー個有效途徑。乳鐵蛋白(Iactoferrin,簡稱Lf)屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族,是ー種鐵離子轉(zhuǎn)運糖蛋白，主要在腺上皮細胞表達和分泌。它是ー種多功能蛋白，目前主要用于調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境離子穩(wěn)定、抗微生物感染、調(diào)節(jié)細胞生長、抑制血小板聚集、增強免疫等。最近，有研究表明，乳鐵蛋白的多項生理功能都是通過乳鐵蛋白受體介導(dǎo)乳鐵蛋白進入細胞來實現(xiàn)的。有學(xué)者在不同種屬小腸中發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白受體，并從嬰兒體內(nèi)分離純化出人小腸乳鐵蛋白受體。另有學(xué)者用125I標記乳鐵蛋白后測定其與腦部脈絡(luò)叢內(nèi)皮膜上的乳鐵蛋白受體結(jié)合的Kd值為0. 11UM，說明在腦部有乳鐵蛋白受體的表達。雖然乳鐵蛋白廣泛分布于體液中，但血漿中的濃度僅為5 nM左右，此濃度不會使乳鐵蛋白受體飽和，提示可進ー步研究乳鐵蛋白作為靶向頭基的可行性。更為重要的是，文獻報道帕金森病患者腦部神經(jīng)元和微血管上Lf 受體表達顯著増加，表明Lf可用于構(gòu)建針對帕金森病的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有腦靶向基因遞釋系統(tǒng)存在的不足，提供一種新的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)，具體涉及ー種蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)及其用途，尤其是在治療帕金森病藥物中的用途。本發(fā)明采用乳鐵蛋白作為靶向頭基，陽離子高分子材料為基礎(chǔ)載體，通過親水性聚合物連接乳鐵蛋白構(gòu)筑基因遞釋載體；所獲得的基因遞釋載體與質(zhì)粒DNA構(gòu)筑形成80 300納米大小的基因遞釋系統(tǒng)即本發(fā)明腦靶向基因遞釋系統(tǒng)。具體而言，本發(fā)明的蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，由乳鐵蛋白修飾的基因遞釋載體和質(zhì)粒DNA構(gòu)成，所述的乳鐵蛋白修飾的基因遞釋載體由陽離子高分子材料、親水性聚合物和乳鐵蛋白組成；所述的乳鐵蛋白修飾的基因遞釋載體中，親水性聚合物與陽離子高分子材料的分子比是f 15:1，乳鐵蛋白與陽離子高分子材料的分子比為re: 1，所述的基因為治療基因。本發(fā)明構(gòu)筑的陽離子高分子材料ー親水性聚合物ー乳鐵蛋白/DNA基因遞釋系統(tǒng)，能明顯提高治療基因在腦部的轉(zhuǎn)染效率和表達水平。本發(fā)明構(gòu)筑的陽離子高分子材料ー親水性聚合物ー乳鐵蛋白/DNA基因遞釋系統(tǒng)，經(jīng)尾經(jīng)脈注射后，能顯著改善帕金森模型大鼠的行為障礙，明顯增加紋狀體和黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目，同時提高紋狀體單胺類遞質(zhì)的水平。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
以陽離子高分子材料、親水性聚合物和乳鐵蛋白為組分，三者以共價方式連接制備乳鐵蛋白修飾的高分子基因遞釋載體。其中，親水性聚合物與陽離子高分子材料的分子比是廣15:1，乳鐵蛋白與陽離子高分子材料的分子比為1飛1 ;
上述基因遞釋載體按下述方法制備陽離子高分子材料和親水性聚合物以1:廣15的分子比溶于pH值7. 8 8. 2磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌反應(yīng)10 60分鐘，兩種分子中含有的基團發(fā)生特異性反應(yīng)，生成陽離子高分子材料-親水性聚合物，超濾法除去未反應(yīng)的親水性聚合物并更換為pH值6. 8 7. 2磷酸鹽緩沖液。同吋，乳鐵蛋白與巰基化試劑反應(yīng)后引入巰基，以I 6:1的分子比與陽離子高分子材料-親水性聚合物上的特異治療基團室溫攪拌反應(yīng)12 36小時后生成陽離子高分子材料-親水性聚合物-乳鐵蛋白，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的乳鐵蛋白。上述基因遞釋載體與質(zhì)粒DNA形成80 300納米大小的基因遞釋系統(tǒng)，其中的陽 離子高分子材料與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比是f 15: I。本發(fā)明按下述方法制備基因遞釋系統(tǒng)將制備的陽離子高分子材料-親水性聚合物-乳鐵蛋白基因遞釋載體溶于pH值7. 3 7. 5磷酸鹽緩沖液中配制成所需濃度的溶液，將質(zhì)粒DNA溶于50 mM硫酸鈉溶液中配制成所需濃度的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成基因遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明中，所述的陽離子高分子材料選自聚酰胺-胺型樹狀分枝物、殼聚糖、聚こ烯亞胺、聚賴氨酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙稀酰胺、聚氨基酰胺或陽離子脂質(zhì)。所述親水性聚合物選自聚こニ醇(polyethyleneglycol,簡稱PEG)、聚氧こ烯或聚-N-(2-羥丙基)-甲基丙稀酰胺。所述質(zhì)粒DNA選自任何可在真核細胞表達的質(zhì)粒DNA，所述治療基因為編碼人源性膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)的治療基因(h⑶NF)。本發(fā)明采用核磁共振技術(shù)對所制備的基因遞釋載體及其制備過程的中間產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果顯示，PAMAM與含有雙功能基團的PEG (琥珀酰亞胺-PEG3400-馬來酰亞胺)反應(yīng)后在3. 5 ppm處出現(xiàn)PEG的特征吸收峰,并在6. 7 ppm處出現(xiàn)馬來酰亞胺的特征吸收峰，說明PEG已經(jīng)修飾到PAMAM上，再和乳鐵蛋白反應(yīng)后該馬來酰亞胺的特征吸收峰消失，說明PAMAM-PEG-Lf合成成功。本發(fā)明采用0. 7%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)考察所制備的基因遞釋系統(tǒng)的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，經(jīng)DNase酶處理后，基因遞釋系統(tǒng)中的DNA未被降解，酶降解反應(yīng)中止后采用強陰性的十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate,簡稱SDS)處理，置換出的DNA和對照DNA條帶位置一致，說明基因遞釋系統(tǒng)中的DNA未被DNase酶降解。本發(fā)明所制備的基因遞釋系統(tǒng)轉(zhuǎn)染腦毛細血管內(nèi)皮細胞，定性和定量結(jié)果均顯示，PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)獲得最高的表達效率，其中熒光素酶定量結(jié)果顯示，PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)的基因產(chǎn)物表達量是PAMAM/DNA的3倍左右，是PAMAM-PEG-Tf/DNA 的 I. 5 倍左右。本發(fā)明所制備的基因遞釋系統(tǒng)通過Balb/c小鼠尾靜脈注射方式考察體內(nèi)靶向性和基因表達效果，冰凍切片的定性結(jié)果顯示，經(jīng)乳鐵蛋白修飾后基因遞釋系統(tǒng)在小鼠腦部不同區(qū)域的表達量均顯示提高，熒光素酶定量結(jié)果顯示，PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)在小鼠腦部的基因表達量是PAMAM/DNA的3. 5倍左右，是PAMAM-PEG-Tf/DNA的I. 6倍左右。本發(fā)明所制備的基因遞釋系統(tǒng)在魚藤酮誘導(dǎo)的慢性帕金森病模型大鼠尾靜脈注射考察其抗帕金森病的藥效。結(jié)果顯示，經(jīng)乳鐵蛋白修飾的基因遞釋系統(tǒng)5次給藥后，帕金森病大鼠的行為學(xué)顯著改善，紋狀體和黑質(zhì)酪氨酸輕化酶(tyrosine hydroxylase,簡稱TH)免疫反應(yīng)陽性細胞明顯增加，單胺類遞質(zhì)的含量約是陰性對照組的31倍。
本發(fā)明的突出優(yōu)點及特征在干，采用極具臨床應(yīng)用潛力的腦靶向頭基——乳鐵蛋白修飾陽離子高分子材料，増加了基因在腦毛細血管內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染效率和表達水平，特別是通過無創(chuàng)傷的靜脈注射方式給藥后顯著提高基因遞釋系統(tǒng)的腦靶向性和基因在腦部的表達，與現(xiàn)有技術(shù)采用的靶向頭基如轉(zhuǎn)鐵蛋白構(gòu)筑的基因遞釋系統(tǒng)比較，腦靶向作用和外來基因表達效率均顯著提高。同時，使用本發(fā)明制備的基因遞釋系統(tǒng)治療帕金森病模型大鼠，與未經(jīng)修飾的對照組比較，能顯著改善帕金森模型大鼠的行為障礙，明顯增加紋狀體和黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目，同時提高紋狀體單胺類遞質(zhì)的水平。本發(fā)明的乳鐵蛋白修飾的基因遞釋系統(tǒng)還可用于轉(zhuǎn)染人體來源和動物來源的內(nèi)皮細胞、上皮細胞、各種組織實質(zhì)細胞和/或神經(jīng)細胞。


圖1 PAMAM-PEG-Lf核磁共振圖譜 其中，A :重水的溶劑峰，
B =PEG的特征峰，
C PAMAM和Lf中各類質(zhì)子的重疊峰。圖2瓊脂糖凝膠電泳考察不同基因遞釋系統(tǒng)的穩(wěn)定性 其中，I Hind III 消化的 DNA Marker,
2:單純質(zhì)粒DNA，
3:單純質(zhì)粒DNA, DNase I處理過，
4PAMAM/DNA基因遞釋系統(tǒng)，
5:PAMAM-PEG/DNA基因遞釋系統(tǒng)，
6:PAMAM-PEG-Lf/DNA 基因遞釋系統(tǒng)，
7PAMAM/DNA基因遞釋系統(tǒng)，DNase I處理過，
8:PAMAM-PEG/DNA基因遞釋系統(tǒng)，DNase I處理過，
9:PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)，DNase I處理過，
10PAMAM/DNA基因遞釋系統(tǒng)，DNase I處理后采用SDS處理，
11PAMAM-PEG/DNA基因遞釋系統(tǒng)，DNase I處理后采用SDS處理，
12PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)，DNase I處理后采用SDS處理。圖3 熒光顯微鏡下觀察腦毛細血管內(nèi)皮細胞中PEGFP-N2綠色熒光蛋白質(zhì)粒的表達情況(200 X )
其中，A PAMAM/DNA基因遞釋系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，PAMAM:DNA (6:1, w/w)，
B :PAMAM-PEG/DNA 基因遞釋系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，PAMAM:DNA (6:1，w/w),
C :PAMAM-PEG-Tf/DNA 基因遞釋系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，PAMAM:DNA (6:1，w/w),
D :PAMAM-PEG-Lf/DNA 基因遞釋系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，PAMAM:DNA (6:1，w/w),
E :PAMAM/DNA基因遞釋系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，PAMAM:DNA (10:1, w/w)，
F :PAMAM-PEG/DNA 基因遞釋系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，PAMAM:DNA (10:1, w/w),
G :PAMAM-PEG-Tf/DNA 基因遞釋系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，PAMAM:DNA (10:1, w/w),
H PAMAM-PEG-Lf/DNA 基因遞釋系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，PAMAM:DNA (10:1, w/w)。圖4用熒光素酶分析系統(tǒng)分析腦毛細血管內(nèi)皮細胞中基因產(chǎn)物熒光素酶的表達量。圖5冰凍切片考察不同基因遞釋系統(tǒng)在腦組織的表達情況 其中，A-E PAMAM/DNA基因遞釋系統(tǒng)的表達結(jié)果，
F-J :PAMAM-PEG/DNA基因遞釋系統(tǒng)的表達結(jié)果，
K-O PAMAM-PEG-Tf/DNA基因遞釋系統(tǒng)的表達結(jié)果，
P-T PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)的表達結(jié)果，
A, F，K和P :大腦皮層冰凍切片圖，
B，G，L和Q :海馬冰凍切片圖，
C，H，M和R :紋狀體冰凍切片圖，
D，I，N和S :黑質(zhì)冰凍切片圖，
E,J，0和T :第四腦室冰凍切片圖。圖6行為學(xué)評價不同基因遞釋系統(tǒng)抗帕金森病的效果 其中A為越格次數(shù)結(jié)果，B為停留時間結(jié)果
第一組(Group I):植物油組，不給予任何治療，
第二組到第六組為治療組，45天全程給予魚藤酮，
第二組(Group 2):陰性對照組，給予魚藤酮第35天開始尾靜脈注射PAMAM-PEG-Lf/GFP納米粒,5次給藥,_天注射，
第三組(Group 3):在給予魚藤酮第43天時，尾靜脈注射PAMAM-PEG/h⑶NF納米粒，單次給藥，
第四組(Group 4)在給予魚藤酮第43天時，尾靜脈注射PAMAM-PEG_Lf/h⑶NF納米粒，單次給藥，
第五組(Group 5):給予魚藤酮第39天開始尾靜脈注射PAMAM-PEG_Lf/h⑶NF納米粒，3次給藥，隔天注射，
第六組(Group 6):給予魚藤酮第35天開始尾靜脈注射PAMAM-PEG_Lf/h⑶NF納米粒，5次給藥，隔天注射。圖7紋狀體TH免疫組織化學(xué)評價不同基因遞釋系統(tǒng)抗帕金森病效果
按照圖6所述分組，其中A為第一組，B為第二組，C為第三組，D為第四組，E為第五組，F(xiàn)為第六組；
大鼠給予魚藤酮第45天時處死，進行紋狀體TH免疫反應(yīng)性檢測。圖8黑質(zhì)TH免疫組織化學(xué)評價不同基因遞釋系統(tǒng)抗帕金森病的效果
按照圖6所述分組，其中A為第一組，B為第二組，C為第三組，D為第四組，E為第五組，F(xiàn)為第六組；
大鼠給予魚藤酮第45天時處死，進行紋狀體TH免疫反應(yīng)性檢測。圖9高效液相色譜法測定紋狀體中相關(guān)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量評價不同基因遞釋系統(tǒng)抗帕金森病的效果， 按，圖6所述分組，大鼠給予魚藤酮第45天時處死，HPLC法測定紋狀體各單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，其中A為多巴胺(dopamine，DA)測定結(jié)果，B為ニ羥苯こ酸(dihydroxyphenylacetic acid, D0PAC)測定結(jié)果，C 為高香草酸(homovanillic acid,HVA)測定結(jié)果。具體實 施方式實施例I.
PAMAM和含有雙功能基團的PEG按照分子比1:2溶于pH 8. 0的磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS)中，室溫攪拌反應(yīng)15分鐘，生成PAMAM-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH7. 0的PBS。與此同吋，乳鐵蛋白與巰基化試劑N-琥珀酰-S-こ酰硫代こ酸酯(簡稱SATA)反應(yīng)后引入巰基基團，純化后與PAMAM-PEG按照I: I分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)12小時后生成PAMAM-PEG-Lf，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的乳鐵蛋白即得PAMAM-PEG-Lf。實施例2.
PAMAM和含有雙功能基團的PEG按照分子比1:4溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)15分鐘，生成PAMAM-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同吋，乳鐵蛋白與巰基化試劑SATA反應(yīng)后引入巰基基團，純化后與PAMAM-PEG按照2:1分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)12小時后生成PAMAM-PEG-Lf ，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的乳鐵蛋白即得 PAMAM-PEG-Lf。實施例3.
PAMAM和含有雙功能基團的PEG按照分子比1:8溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應(yīng)15分鐘，生成PAMAM-PEG，超濾除去未反應(yīng)的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同吋，乳鐵蛋白與巰基化試劑SATA反應(yīng)后引入巰基基團，純化后與PAMAM-PEG按照4:1分子比混合，室溫攪拌反應(yīng)12小時后生成PAMAM-PEG-Lf ，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的乳鐵蛋白即得 PAMAM-PEG-Lf。實施例4.
將實施例I制備的PAMAM-PEG-Lf基因遞釋載體I. 0 mg，溶于0. 5 ml重水中，MercuryPlus 400 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀鑒定基因遞釋載體的結(jié)構(gòu)，獲得理想的核磁共振圖譜，說明成功合成PAMAM-PEG-Lf，見附圖I。實施例5.
將實施例3制備的PAMAM-PEG-Lf基因遞釋載體I. 0 mg，溶于0. 5 ml重水中，MercuryPlus 400 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀鑒定基因遞釋載體的結(jié)構(gòu)，獲得理想的核磁共振圖譜，說明成功合成PAMAM-PEG-Lf。實施例6.
將實施例I制備的PAMAM-PEG-Lf基因遞釋載體溶于適量pH 7.4的PBS中配成600 u g/ml (以PAMAM的質(zhì)量計算)的溶液，將pEGFP_N2綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA溶于適量的50 mM硫酸鈉溶液中配制成IOOii g/ml的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)。實施例7.
將實施例I制備的PAMAM-PEG-Lf基因遞釋載體溶于適量pH 7. 4的PBS中配成I mg/ml(以PAMAM的質(zhì)量計算)的溶液，將pEGFP-N2綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA溶于適量的50 mM硫酸鈉溶液中配制成100 u g/ml的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)。實施例8.將實施例I制備的PAMAM-PEG-Lf基因遞釋載體溶于適量pH 7. 4的PBS中配成600 y g/ml (以PAMAM的質(zhì)量計算)的溶液，將pGL2-Control Vector熒光素酶質(zhì)粒DNA溶于適量的50 mM硫酸鈉溶液中配制成IOOii g/ml的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)。實施例9.
將實施例I制備的PAMAM-PEG-Lf基因遞釋載體溶于適量pH 7. 4的PBS中配成I mg/ml (以PAMAM的質(zhì)量計算)的溶液，將pGL2-Control Vector熒光素酶質(zhì)粒DNA溶于適量的50 mM硫酸鈉溶液中配制成IOOii g/ml的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)。實施例10.
將實施例I制備的PAMAM-PEG-Lf基因遞釋載體溶于適量pH 7. 4的PBS中配成I mg/ml (以PAMAM的質(zhì)量計算)的溶液，將hGDNF編碼人源性膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子質(zhì)粒DNA溶于適量的50 mM硫酸鈉溶液中配制成IOOy g/ml的溶液,室溫下兩者等體積鏇渦30s混勻制成PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)。實施例11.
將實施例6制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)與DNase I溶液混合，基因遞釋系統(tǒng)中含有l(wèi)ug DNA時用100 U DNase I進行切割，和37°C孵育2小時，加入EDTA溶液終止酶反應(yīng)(終濃度為0. I M)，10% SDS處理(終濃度為2. 5%), 100 V電壓、0. 7%瓊脂糖凝膠電泳25分鐘考察基因遞釋系統(tǒng)的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示該復(fù)合物可有效保護DNA免受DNase I的降解，見附圖2。實施例12.
使用實施例6中制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)和腦毛細血管內(nèi)皮細胞于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育I小時，采用pH 7. 4的PBS溶液潤洗細胞，48小時后采用OLYMPUSIX 71顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并拍照(200倍放大)，結(jié)果顯示，細胞中有綠色熒光蛋白表達，見附圖3D。實施例13.
使用實施例7中制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)和腦毛細血管內(nèi)皮細胞于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育I小時，采用pH 7. 4的PBS溶液潤洗細胞，48小時后采用OLYMPUSIX 71顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果并拍照(200倍放大)，結(jié)果顯示，細胞中有綠色熒光蛋白表達，見附圖3H。實施例14.
使用實施例8中制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)和腦毛細血管內(nèi)皮細胞于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育I小吋，48小時后采用熒光素酶分析系統(tǒng)分析腦毛細血管內(nèi)皮細胞中熒光素酶的表達量，結(jié)果顯示，細胞中有熒光素酶表達，見附圖4。實施例15.
使用實施例9中制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)和腦毛細血管內(nèi)皮細胞于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育I小吋，48小時后采用熒光素酶分析系統(tǒng)分析腦毛細血管內(nèi)皮細胞中熒光素酶的表達量，結(jié)果顯示，細胞中有熒光素酶表達，見附圖4。實施例16.Balb/c小鼠尾靜脈注射實施例6中制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)，劑量為50 iig DNA/只小鼠，2天后取全腦，4°C、4%的多聚甲醛溶液中固定48小吋，4°C、15%的蔗糖溶液中脫水6小吋，4°C、30%的蔗糖溶液中脫水24小時，包埋、冷凍后進行冰凍切片，厚度為20 iim，采用熒光試劑DAPI (300 nM)進行核染色，用OLYMPUS IX 71顯微鏡觀察小鼠大腦皮層、海馬、紋狀體、黑質(zhì)和第四腦室中綠色熒光蛋白的表達結(jié)果并拍照，結(jié)果表明，本發(fā)明基因遞釋系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)基因遞釋系統(tǒng)比較，腦靶向效果顯著提高。實施例17. Balb/c小鼠尾靜脈注射實施例7中制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)，劑量為50 iig DNA/只小鼠，2天后取全腦，4°C、4%的多聚甲醛溶液中固定48小吋，4°C、15%的蔗糖溶液中脫水6小吋，4°C、30%的蔗糖溶液中脫水24小時，包埋、冷凍后進行冰凍切片，厚度為20 iim，采用熒光試劑DAPI (300 nM)進行核染色，用OLYMPUS IX 71顯微鏡觀察小鼠大腦皮層、海馬、紋狀體、黑質(zhì)和第四腦室中綠色熒光蛋白的表達結(jié)果并拍照，結(jié)果表明，本發(fā)明基因遞釋系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)基因遞釋系統(tǒng)比較，腦靶向效果顯著提高，見附圖5。實施例18.
大鼠腹腔注射魚藤酮，毎日一次，連續(xù)注射45天，制備帕金森病模型大鼠。分別在給予魚藤酮第35天、39天和43天開始尾靜脈注射實施例10中制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)，隔天注射，分別為5次、3次和單次給藥。在給予魚藤酮第15天、25天、35天和45天時,大鼠進行行為學(xué)評價。具體步驟為大鼠置于80 cmX48 cmX50 cm的開放場(底部分成16 cmX16 cm的方格15格)中，觀察時間為5 min，記錄以下五個參數(shù)越格次數(shù)(3肢進入小方格)，后肢直立(前肢脫離地面I cm以上)，修飾次數(shù)(整理頭部毛發(fā))，糞便粒數(shù)和停留時間(四肢靜止不動)，評價大鼠的運動能力。整個行為學(xué)測試實驗為雙盲進行。結(jié)果顯示，在五個參數(shù)中只有越格次數(shù)和停留時間這兩個參數(shù)上顯著性差異，經(jīng)5次給藥后大鼠越格次數(shù)最多，停留時間最短，治療帕金森病效果最好，見附圖6。實施例19.
大鼠腹腔注射魚藤酮，毎日一次，連續(xù)注射45天，制備帕金森病模型大鼠。分別在給予魚藤酮第35天、39天和43天開始尾靜脈注射實施例10中制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)，隔天注射，分別為5次、3次和單次給藥。在給予魚藤酮第45天時，進行TH免疫反應(yīng)性檢測。具體步驟為分別隨機取每組大鼠各2只，10%水合氯醛麻酔后，心臟灌注固定。先用生理鹽水300 ml進行預(yù)灌注，將其體內(nèi)血液沖出，再用4%多聚甲醛固定液400 ml進行灌注固定，完整剝?nèi)∧X組織，繼續(xù)4 °(過夜固定。后浸入30%蔗糖溶液4 °C脫水至下沉，作連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚為30i!m，進行TH染色。具體方法為挑選紋狀體位置的切片一PBS洗滌，5 minX3次一0. 25% Triton-XlOO中孵育30 min，增加組織滲透性一
0.3% H2O2中孵育15 min，滅活過氧化物酶一PBS洗滌，5 minX3次一正常山羊血清中封閉2 h —與ー抗(200倍稀釋)4 °(過夜孵育一PBS洗滌，10 minX3次一與生物素化的ニ抗工作液37 °C孵育I h — PBS洗滌，10 minX3次一與辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液室溫孵育I h — PBS洗滌，10 minX3次一DAB染色，變色后置蒸餾水中終止染色反應(yīng)一展片一風干一梯度こ醇脫水(70%，3 min ；80%,3 min ；90%,3min ； 100%, 3 min ；100%, 3 min ；70%, 3 min) — ニ甲苯透化，10 minX2次一中性樹脂封片一顯微鏡觀察并拍照。結(jié)果顯示，隨著給藥次數(shù)増加，TH免疫反應(yīng)性改善明顯，5次給藥組大鼠紋狀體中TH陽性細胞和植物油組大鼠已無肉眼可見區(qū)別，見附圖7。實施例20
大鼠腹腔注射魚藤酮，每日一次，連續(xù)注射45天，制備帕金森病模型大鼠。分別在給予魚藤酮第35天、39天和43天開始尾靜脈注射實施例10中制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)，隔天注射，分別為5次、3次和單次給藥。在給予魚藤酮第45天時，進行TH免疫反應(yīng)性檢測。具體步驟為分別隨機取每組大鼠各2只，10%水合氯醛麻酔后，心臟灌注固定。先用生理鹽水300 ml進行預(yù)灌注，將其體內(nèi)血液沖出，再用4%多聚甲醛固定液400ml進行灌注固定，完整剝?nèi)∧X組織，繼續(xù)4 °(過夜固定。后浸入30%蔗糖溶液4 °C脫水至下沉，作連續(xù)冰凍冠狀切片，片厚為30 ym，進行TH染色。具體方法為挑選黑質(zhì)位置的切片一PBS洗滌，5 minX3次一0. 25% Triton-XlOO中孵育30 min，增加組織滲透性一
0.3% H2O2中孵育15 min，滅活過氧化物酶一PBS洗滌，5 minX3次一正常山羊血清中封閉2 h —與ー抗(200倍稀釋)4 °(過夜孵育一PBS洗滌，10 minX3次一與生物素化的ニ抗工作液37 °C孵育I h — PBS洗滌，10 minX3次一與辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液室溫孵育I h — PBS洗滌，10 minX3次一DAB染色，變色后置蒸餾水中終止染色反應(yīng)一展片一風干一梯度こ醇脫水(70%，3 min ；80%,3 min ；90%,3min ； 100%, 3 min ；100%, 3 min ；70%, 3 min) — ニ甲苯透化，10 minX2次一中性樹脂封片一顯微鏡觀察并拍照。結(jié)果顯示，隨著給藥次數(shù)増加，TH免疫反應(yīng)性改善明顯，5次給藥組大鼠黑質(zhì)中TH陽性細胞和植物油組大鼠已無肉眼可見區(qū)別，見附圖8。實施例21.
大鼠腹腔注射魚藤酮，毎日一次，連續(xù)注射45天，制備帕金森病模型大鼠。分別在給予魚藤酮第35天、39天和43天開始尾靜脈注射實施例10中制備的PAMAM-PEG-Lf/DNA基因遞釋系統(tǒng)，隔天注射，分別為5次、3次和單次給藥。在給予魚藤酮第45天吋，HPLC法檢測紋狀體中單胺類遞質(zhì)包括DA、DOPAC和HVA的含量。樣品處理步驟為每組大鼠各6只，即刻處死，解剖取出紋狀體，稱重并記錄，先于液氮中速凍5 min后置-80 °C保存?zhèn)溆?。HPLC檢測當天，樣品按照100 mg加入lOOOii I樣品處理液(0. 2 M高氯酸,0.2 mM焦亞硫酸鈉、0. 01%EDTA-2Na),同時含有0. 5 u M DHBA作為內(nèi)標，超聲粉碎(強度20%,時間30秒)，14，000 rpm離心10 min，上清液經(jīng)0.22 水相濾膜過濾后用于HPLC檢測，以上過程均在4 °C下操作。色譜條件為色譜柱Dikma Platisil ODS (5 u m, 250 mmX4. 6 mm);流動相16*%甲醇水溶液，含40 mMこ酸鈉，15 mM檸檬酸，0.25 mM辛烷磺酸鈉，0.2 mM EDTA_2Na，未加甲醇前調(diào)節(jié)PH至4. 3 ;檢測器電化學(xué)檢測器(EOT);流速1 ml/min ;電壓500 mV ;量程I U A ;柱溫25 0C ;進樣體積10 u I。結(jié)果顯示，隨著給藥次數(shù)増加，各神經(jīng)遞質(zhì)含量有所增加，5次給藥組中DA、DOPAC和HVA含量分別增加至植物油組的86. 5%,93. 4%和91. 0%，見附圖9。
本發(fā)明上述實驗中采用的PEGFP-N2綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA購自Clontech公司，pGL2-Control Vector突光素酶質(zhì)粒DNA購自Promega公司，h⑶NF編碼人源性膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子質(zhì)粒DNA由芬蘭大學(xué)惠贈，第五代PAMAM和乳鐵蛋白購自Dendritech公司，雙功能PEG購自北京健凱公司。
權(quán)利要求
1.ー種蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，由乳鐵蛋白修飾的基因遞釋載體和質(zhì)粒DNA構(gòu)成，所述的乳鐵蛋白修飾的基因遞釋載體由陽離子高分子材料、親水性聚合物和乳鐵蛋白組成；所述的乳鐵蛋白修飾的基因遞釋載體中，親水性聚合物與陽離子高分子材料的分子比是f 15:1，乳鐵蛋白與陽離子高分子材料的分子比為1飛1，所述的基因為治療基因。
2.按權(quán)利要求I所述的蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的乳鐵蛋白修飾的基因遞釋載體與質(zhì)粒DNA形成80 300納米大小的復(fù)合物，其中的陽離子高分子材料與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比是15: I。
3.按權(quán)利要求I所述的蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的陽離子高分子材料選自聚酰胺-胺型樹狀分枝物、殼聚糖、聚こ烯亞胺、聚賴氨酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙稀酰胺或聚氨基酰胺。
4.按權(quán)利要求I所述的蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的親水性聚合物選自聚こニ醇、聚氧こ烯或聚-N- (2-羥丙基)-甲基丙稀酰胺。
5.按權(quán)利要求I所述的蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)，其特征在于，所述的質(zhì)粒DNA是任何可在真核細胞表達的質(zhì)粒DNA，所述的治療基因為編碼人源性膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的治療基因。
6.權(quán)利要求I的蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，采用乳鐵蛋白作為靶向頭基，陽離子高分子材料為基礎(chǔ)載體，通過親水性聚合物連接乳鐵蛋白構(gòu)筑基因遞釋載體；所獲得的基因遞釋載體與質(zhì)粒DNA構(gòu)筑形成80 300納米大小的基因遞釋系統(tǒng)。
7.按權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述的基因遞釋載體，其中陽離子高分子材料、親水性聚合物和乳鐵蛋白以共價方式連接。
8.按權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述的基因遞釋載體通過下述步驟制備 陽離子高分子材料和親水性聚合物以I: Γ15的分子比溶于pH值7. 8 8. 2磷酸鹽緩沖液，室溫攪拌反應(yīng)10 60分鐘，其中含有的基團發(fā)生特異性反應(yīng)，生成陽離子高分子材料-親水性聚合物，超濾法除去未反應(yīng)的親水性聚合物并更換為pH值6. 8 7. 2磷酸鹽緩沖液；同時，乳鐵蛋白與巰基化試劑反應(yīng)后引入巰基，以I 6:1的分子比與陽離子高分子材料-親水性聚合物上的特異基團室溫攪拌反應(yīng)12 36小時后生成陽離子高分子材料-親水性聚合物-乳鐵蛋白，分子排阻色譜法除去未反應(yīng)的乳鐵蛋白。
9.權(quán)利要求I的蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)在制備治療帕金森病藥物中的用途。
10.按權(quán)利要求的用途，其特征在于，所述的蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)改善帕金森模型大鼠的行為障礙，增加紋狀體和黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目，提高紋狀體單胺類遞質(zhì)的水平。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種蛋白介導(dǎo)的腦靶向基因遞釋系統(tǒng)及其用途，尤其是在治療帕金森病藥物中的用途。本發(fā)明通過親水性聚合物將乳鐵蛋白修飾于陽離子高分子材料上，與質(zhì)粒DNA通過靜電作用復(fù)合形成基因遞釋系統(tǒng)。本發(fā)明可有效提高腦毛細血管內(nèi)皮細胞上基因的轉(zhuǎn)染效率和表達效率，特別是通過無創(chuàng)傷的靜脈注射方式給藥后顯著提高基因遞釋系統(tǒng)的腦靶向性和基因在腦部的表達，與現(xiàn)有技術(shù)采用的靶向頭基構(gòu)筑的基因遞釋系統(tǒng)比較，腦靶向效果顯著提高。經(jīng)動物模型實驗，結(jié)果證實，該基因遞釋系統(tǒng)，能顯著改善帕金森模型動物的行為障礙，明顯增加紋狀體和黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目，同時提高紋狀體單胺類遞質(zhì)的水平。
文檔編號A61K47/42GK102614525SQ20111003449
公開日2012年8月1日 申請日期2011年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月1日
發(fā)明者蔣晨, 裴元英, 黃容琴 申請人:復(fù)旦大學(xué)