專利名稱：用于治療缺血性腦血管疾病的制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種可以治療缺血性腦血管疾病的制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是世界上致死率和發(fā)病率最高的疾病。根據(jù)2010年美國(guó)心臟學(xué)會(huì)的統(tǒng)計(jì)報(bào)告指出，2005年全世界大約有1750萬(wàn)人死于各類心腦血管疾病，大約占死亡總?cè)藬?shù)的30%。預(yù)計(jì)到2020年，全球因心腦血管疾病死亡人數(shù)將達(dá)2500萬(wàn)人。在2004年歐洲有430萬(wàn)人死于各類心腦血管疾病，高達(dá)總死亡人數(shù)的48 %。在各類心腦血管疾病中，動(dòng)脈粥樣硬化所導(dǎo)致的血栓及血管堵塞是最常見和最重要的發(fā)病機(jī)理。在疾病初期，由活性氧激發(fā)的對(duì)低密度脂蛋白的修飾會(huì)逐漸導(dǎo)致血管內(nèi)皮機(jī)能障礙。機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)此產(chǎn)生慢性炎癥并持續(xù)分泌富含T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，肥大細(xì)胞的白血球細(xì)胞群，并形成脂紋，纖維斑塊，粥樣斑塊，使血管腔狹窄并導(dǎo)致血流量減少。當(dāng)最終粥樣斑塊破碎后，脫落的碎斑會(huì)導(dǎo)致血小板聚集并產(chǎn)生大規(guī)模的閉合性血栓及其他繼發(fā)性改變,包括由該動(dòng)脈所供應(yīng)養(yǎng)份的組織或器官的缺血或壞死。由動(dòng)脈粥樣硬化所導(dǎo)致的缺血性心腦血管疾病主要包括有冠心病,缺血性中風(fēng)，以及外周閉塞性動(dòng)脈疾病。缺血性中風(fēng)是由血栓(腦部形成阻塞血塊)，栓塞(栓塞從其他地方形成，見下)，系統(tǒng)性供血不足(一般性系統(tǒng)性供血不足，如休克)或靜脈血栓引起的腦部供血不足，導(dǎo)致腦組織功能障礙及壞死。全球毎年的中風(fēng)患者有1500萬(wàn)人，并導(dǎo)致500萬(wàn)人終身殘疾及570萬(wàn)人死亡，其中87%屬于缺血性中風(fēng)。在美國(guó)，平均每40秒就有一人會(huì)發(fā)生中風(fēng)，平均每4分鐘就有一名患者死于中風(fēng)。在世界范圍內(nèi)中風(fēng)也是第2大死因。盡管有保守鍛煉，抗凝藥物，和手術(shù)(頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除或頸動(dòng)脈血管成形)的傳統(tǒng)治療手段，大部分由動(dòng)脈粥樣硬化所導(dǎo)致的缺血性中風(fēng)病患者依然無(wú)法獲得有效的治療，究其原因，主要是因?yàn)閷?duì)抗凝藥物的副作用，以及身體或疾病條件而無(wú)法進(jìn)行有效的手術(shù)等。干細(xì)胞療法是近年來在治療癌癥和心腦血管疾病等領(lǐng)域最受人期待的新發(fā)展方向。從理論上講，干細(xì)胞可以用于各種疾病的治療，但其最適合的疾病主要是組織壞死性疾病如缺血引起的心肌壞死，退行性病變?nèi)缗两鹕C合征，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖尿病等。尤其是其具有的促進(jìn)血管再生和器官功能恢復(fù)的特殊功效，在心腦血管疾病的治療中有著巨大療效。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是來源于早期中胚層的ー種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。MSC理論上可分化為所有中胚層來源的細(xì)胞，例如內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，并且具有低免疫活性，同種異體移植不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥。MSC廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，也可從胎兒臍血中分離得到，還存在于胎盤、羊水、臍靜脈內(nèi)皮下層、外周血及肝臟、脂肪、肌肉、皮膚等多種組織中。在適宜的條件下，MSC能夠聚集在局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)腦組織中，并具有促進(jìn)缺血區(qū)新生血管形成及改善神經(jīng)功能的趨勢(shì)，新生血管的形成和血液循環(huán)的重建，有助于腦缺血半暗帶區(qū)受損而未死亡神經(jīng)元的修復(fù)，并可為自身神經(jīng)干細(xì)胞向缺血區(qū)遷移和分化，對(duì)損傷神經(jīng)組織的修復(fù)及重建具有重要意義。而MSC促進(jìn)缺血區(qū)血管新生的原因，是由于來源于MSC的內(nèi)皮祖細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化及提高缺血區(qū)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞活素(例如VEGF)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)缺血區(qū)血管生成的結(jié)果。事實(shí)上，移植的MSC在參與缺血腦組織修復(fù)中分泌出的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞活素，可借由MSC在體外特定環(huán)境中所分泌的條件培養(yǎng)基中獲得，并完全可能將其應(yīng)用于受損血管及周邊組織的修復(fù)和再生，從而恢復(fù)缺血性壞死的腦組織的相應(yīng)功能。因此，MSC在體外人エ環(huán)境中分泌的促血管及周邊組織修復(fù)或再生的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞活素在臨床上有巨大的潛力，可以作為干細(xì)胞療法的有效替代品或輔助藥物應(yīng)用于缺血性腦血管疾病的治療中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠有效的治療缺血性腦血管疾病的制劑，用于克服現(xiàn)有藥物的不足，為臨床治療缺血性腦血管疾病提供一種新的治療藥物。
上述缺血性腦血管疾病主要指由于動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的血管阻塞類的疾病，具體包括腦動(dòng)脈硬化引起的中風(fēng)，腦缺血、腦梗塞，腦萎縮，梗塞型癡呆。本發(fā)明的目的還在于提供一種制備能夠有效的治療缺血性腦血管疾病的制劑的方法，該方法步驟為I)從健康人血液中通過白細(xì)胞置換(Ieukapheresis)獲取外周血單核細(xì)胞,或從骨髓中(通過密度梯度離心的方法，可選步驟)獲取骨髓單核細(xì)胞，或從人脂肪吸取物(Iipoaspirate)中直接提取 MSC;2)篩選及培養(yǎng)外周血或骨髓單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞；3)在特定條件下培養(yǎng)MSC細(xì)胞使其分泌促組織修復(fù)和再生的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞活素，分離MSC細(xì)胞和培養(yǎng)基，獲得富含促血管生成因子和細(xì)胞活素的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基；4)對(duì)步驟3)中所獲得的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行后處理，該后處理步驟包括過濾細(xì)胞碎片、純化該無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基、檢測(cè)各有效生長(zhǎng)因子的成分及含量、對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn)行凍干處理或冷凍保存，即獲得治療缺血性腦血管疾病制劑。本發(fā)明所述制備能夠有效的治療缺血性腦血管疾病制劑的方法中，步驟I)所述的健康人血液或骨髄的來源可以是自體來源或異體來源，獲得途徑可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血庫(kù)直接購(gòu)買的健康人外周血白細(xì)胞懸液樣本，或通過臨床白細(xì)胞置換?？蛇x步驟中所述的梯度離心以獲取單核細(xì)胞的步驟為將所獲得的骨髄或外周血液在密度梯度劑中梯度離心，所用的梯度劑可為Fic0Il-Paque(GEhealthcare),Histopaque-1077 (Sigma),或其他公司同類產(chǎn)品，優(yōu)選為Histopaque-1077 ;適用溫度范圍為15到25°C，優(yōu)選為25°C。具體操作為將含有骨髄或外周血及梯度劑的容器在200g-500g下離心20-40分鐘，分層后，用無(wú)菌一次性針管吸取當(dāng)中不透明層，即為富含單核細(xì)胞的懸浮液，經(jīng)鑒定，此單核細(xì)胞群體來源于骨髓髓系干細(xì)胞其內(nèi)所含多種細(xì)胞亞群，呈多形性。本發(fā)明所述制備能夠有效的治療缺血性腦血管疾病制劑的方法中，步驟2)中的培養(yǎng)單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞時(shí)，所用的培養(yǎng)基可為M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的ー種，并可添加有h印arin (0-100U/ml)。培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5 %至20 %的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清。在預(yù)設(shè)條件為培養(yǎng)溫度37°C，ニ氧化碳濃度為5-7%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明所述制備能夠有效的促進(jìn)治療缺血性腦血管疾病制劑的方法中，步驟2)中的培養(yǎng)單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞的步驟為以下所述方法①至④中的ー種方法①將單核細(xì)胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)1_2天，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天。所獲I型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。 方法②將單核細(xì)胞與fibrin微球(直徑50-250微米，可由商業(yè)途徑獲得，如Forticell Bioscience)共同培養(yǎng) 1-2 天，姆 IOO-IOOOmg fibrin 微球可吸附 I X IO6 至
IX IO8個(gè)細(xì)胞的密度，去除懸浮細(xì)胞，將附著于fibrin微球的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7_21天。所獲I型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。方法③將單核細(xì)胞通過⑶14，或⑶45特異性抗體進(jìn)行磁珠分選(MACS ,由德國(guó)Miltenyi Biotec公司生產(chǎn))，篩選出不含⑶14或⑶45的單核細(xì)胞亞群，將此⑶14—或⑶45_單核細(xì)胞亞群以每平方厘米5 X IO5至2 X IO6個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)1_2天(或用方法②培養(yǎng))，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁(或附著于fibrin微球)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7_21天。所獲II型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。方法④將人脂肪吸取物(lipoaspirate,約50_100ml)在pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水中洗浄，用I型和II型膠原酶(collagenase type I，ILSigma-Aldrich)消化(酶的濃度范圍O. 05% -O. 1% )，消化步驟為置于37°C條件下震蕩30-60分鐘。將消化分散后的單核細(xì)胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)1-2天(或用方法②培養(yǎng))，將貼壁(或附著于fibrin微球)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7_21天。所獲III型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。本發(fā)明所述制備能夠有效的治療缺血性腦血管疾病制劑的方法中，步驟3)中所述的在特定條件下培養(yǎng)MSC細(xì)胞的方法為以下所述方法①或②中的ー種方法①將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC置于不含任何生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為O. 5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為M119、DMEM、RPMI-1640, F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。方法②將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC先置于促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，此培養(yǎng)基可為M119、DMEM、F12、RPMI-1640, EBM、EBM-2中的ー種，并可添加有O. 5-1 %的生長(zhǎng)因子添加劑EGM、EGM-MV, EGM-2或EGM2-MV中的ー種(由瑞士 Lonza公司購(gòu)買，其中含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-1、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-2、表皮生長(zhǎng)因子EGF，和胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-1);或添加有內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子ECGF(10-100 μ g/ml);并可添加有h印arin(0-100U/ml);培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清。1-2天后將MSC轉(zhuǎn)入不含任何生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為O. 5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7.4)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。在按照上述方法①或②培養(yǎng)完成后，收集富含細(xì)胞生長(zhǎng)因子的條件培養(yǎng)基，棄去MSC細(xì)胞。本發(fā)明所述制備能夠有效的治療缺血性腦血管疾病制劑的方法中，步驟4)所述的后處理步驟包括①對(duì)步驟3)中所收集的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行過濾，可通過高速離心或過濾器將細(xì)胞雜質(zhì)及碎片去除。②對(duì)過濾后的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行成分鑒定，并對(duì)其中所含的代表性促血管及周邊組織生長(zhǎng)因子及細(xì)胞活素如MCP-I，EGF, MMP-9, MMP-2, PDGF, SDF-I，F(xiàn)GF, VEGF的含量進(jìn)行鑒定，鑒定方法可為蛋白組學(xué)(proteomics),細(xì)胞活素陣列(cytokine array),酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，或Bio-Plex 細(xì)胞因子測(cè)試。③對(duì)過濾后的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行凍干或分裝冷凍保存，以便長(zhǎng)期保存其中的生長(zhǎng)因子及細(xì)胞活素成分的活性。


圖I :本發(fā)明所述治療缺血性腦血管疾病制劑對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞増殖的影響。圖2 :本發(fā)明所述治療缺血性腦血管疾病制劑對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、促進(jìn)遷移及修復(fù)損傷功效。
具體實(shí)施例方式以下通過具體的實(shí)例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)ー步的闡述說明，本發(fā)明包括但不限于下述步驟和內(nèi)容。實(shí)施例I.單核細(xì)胞的制備。將抽取出的骨髓或者由血庫(kù)直接購(gòu)買的健康人外周血白細(xì)胞懸液加入密度梯度劑Histopaque-1077 (Sigma),姆15mL Histopaque中加入30mL骨髓提取液或者外周血白細(xì)胞懸液。將骨髓提取液或外周血白細(xì)胞懸液在梯度劑的存在下于400G的速度下常溫離心30分鐘。分層后，用無(wú)菌一次性針管吸取當(dāng)中不透明層，即為富含骨髄系單核細(xì)胞的懸浮液。實(shí)施例2. MSC細(xì)胞的獲取。 針對(duì)I類MSC細(xì)胞的獲取方法將骨髓或外周血單核細(xì)胞在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米IX IO6個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)2天，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)21天。所獲I型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。針對(duì)II類MSC細(xì)胞的獲取方法將骨髓或外周血單核細(xì)胞在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米I X IO6個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)2天，通過⑶14，或⑶45特異性抗體進(jìn)行磁珠分選(MACS ,由德國(guó)Miltenyi Biotec公司生產(chǎn))，篩選出不含⑶14或⑶45的單核細(xì)胞亞群，將此⑶14_或⑶45_單核細(xì)胞亞群在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米I X IO6個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)2天，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)21天。所獲II型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，即大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。針對(duì)III類MSC細(xì)胞的獲取方法將人脂肪吸取物(lipoaspirate，約50_100ml)在pH = 7. 4,0. 9%的醫(yī)用生理鹽水中洗浄,用II型膠原酶(collagenase type II)消化(質(zhì)量濃度O. 075% ),消化條件為于37°C下震蕩30分鐘。將消化并過濾出的單核細(xì)胞在添加有10%人血清白蛋白或自體血清的DMEM培養(yǎng)液中以每平方厘米I X IO6個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)2天，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)21天。所獲III型MSC為紡錘狀，具有典型MSC特性，大量表達(dá)細(xì)胞表面受體⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞受體。實(shí)施例3.治療缺血性腦血管疾病制劑的獲取。將實(shí)施例2所獲得的各型MSC置于不含任何生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為
O.5%的環(huán)境中在O. 9%的醫(yī)用生理鹽水中培養(yǎng)2天(每平方厘米2 X IO5個(gè)細(xì)胞)，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。培養(yǎng)完成后收集富含細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基，棄去貼壁的MSC細(xì)胞。將收集的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基通過孔徑為O. 2微米的過濾器將細(xì)胞雜質(zhì)及碎片去除井分裝于_80°C冷庫(kù)冷藏備用。視具體情況，每IxlO6個(gè)MSC細(xì)胞可以制備2-5ml所述促血管及周邊組織修復(fù)或再生制劑。實(shí)施例4.治療缺血性腦血管疾病制劑中的生長(zhǎng)因子及細(xì)胞活素的鑒定。實(shí)施例3所制得的治療缺血性腦血管疾病制劑中含有的生長(zhǎng)因子及細(xì)胞活素成分通過細(xì)胞活素陣列(cytokine array)鑒定(由R&D Systems購(gòu)買)，此治療缺血性腦血管疾病制劑的有效成分包含并不局限于以下生長(zhǎng)因子MCP-1、EGF、IL-6、IL-8、MMP-9、SDF-I、HGF、VEGF以及TOGF。通過酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)，其中有效成分的含量為，MCP-I 5-50ng/ml ;IL_8 :1_5μ g/ml ；SDF-1 :0.5_5ng/ml ;IL_6 5-20ng/ml ；PDGF-BB :0.I-IOng/ml ；VEGF :l-20ng/ml。其他成分組成見表I。表I.本發(fā)明所述治療缺血性腦血管疾病制劑中的成分列表(包含并不局限于以下成分)
權(quán)利要求
1.ー種治療缺血性腦血管疾病的制劑的制備方法，其特征在于，該制劑的制備方法包括如下步驟 1)從健康人血液中通過白細(xì)胞置換獲取外周血單核細(xì)胞，或從骨髓中(通過密度梯度離心的方法，可選步驟)獲取骨髓單核細(xì)胞，或從人脂肪吸取物中直接提取MSC ； 2)篩選及培養(yǎng)外周血或骨髄單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞； 3)在特定條件下培養(yǎng)MSC細(xì)胞使其分泌促組織修復(fù)和再生的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞活素，分離MSC細(xì)胞和培養(yǎng)基，獲得富含促血管生成因子和細(xì)胞活素的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基； 4)對(duì)步驟3)中所獲得的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行后處理，該后處理步驟包括過濾細(xì)胞碎片、純化該無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基、檢測(cè)各有效生長(zhǎng)因子的成分及含量、對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn)行凍干處理或冷凍保存，即獲得促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟I)所述的健康人血液或骨髄的來源可以是自體來源或異體來源，獲得途徑可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或 由血庫(kù)直接購(gòu)買的健康人外周血白細(xì)胞懸液樣本，或通過臨床白細(xì)胞置換。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述的制備方法，其特征在于，步驟I)所述的從血液中或骨髓中通過密度梯度離心獲取外周血單細(xì)胞的方法為使用梯度劑為Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同類產(chǎn)品，溫度為15 25°C，離心カ為200g_500g，時(shí)間20-40分鐘，離心完成后，吸取當(dāng)中不透明層，即為單核細(xì)胞懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中的培養(yǎng)單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞時(shí)，所用的培養(yǎng)基為M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的ー種，并添加有heparin (0-100U/ml)，培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5 %至20 %的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清，在預(yù)設(shè)條件為培養(yǎng)溫度37°C，ニ氧化碳濃度為5-7%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的培養(yǎng)單核細(xì)胞以獲得MSC細(xì)胞的方法為以下所述方法①、②、③或④中的ー種 方法①將單核細(xì)胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)1-2天，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天，獲I型MSC。
方法②將單核細(xì)胞與fibrin微球共同培養(yǎng)1_2天，每IOO-IOOOmg fibrin微球可吸附IX IO6至IX IO8個(gè)細(xì)胞的密度，去除懸浮細(xì)胞，將附著于fibrin微球的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21 天，獲 I MMSC0 方法③將單核細(xì)胞通過CD14，或CD45特異性抗體進(jìn)行磁珠分選，篩選出不含CD14或⑶45的單核細(xì)胞亞群，將此⑶14-或⑶45-單核細(xì)胞亞群以每平方厘米5X IO5至2X IO6個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)1-2天(或用方法②培養(yǎng))，去除懸浮細(xì)胞，將貼壁(或附著于fibrin微球)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天，獲II型MSC。
方法④將人脂肪吸取物50-100ml在pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水中洗浄，用I型和II型膠原酶消化(酶的濃度范圍O. 05% -O. 1% )，消化步驟為置于37°C條件下震蕩30-60分鐘。將消化分散后的單核細(xì)胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)1-2天(或用方法②培養(yǎng))，將貼壁(或附著于fibrin微球)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-21天，獲III型MSC。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述的在特定條件下培養(yǎng)MSC細(xì)胞的方法為以下所述方法①或②中的ー種方法①將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC置于不含任何生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為O. 5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為Ml 19、DMEM、RPMI-1640, F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水，并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。
方法②將步驟2)所獲得的I、II、III型MSC先置于促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，此培養(yǎng)基可為Ml 19、DMEM、F12、RPMI-1640, EBM、EBM-2中的ー種，并添加有O. 5-1%的生長(zhǎng)因子添加劑EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的ー種；或添加有內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子ECGF(10-100 μ g/ml);并可添加有h印arin (0-100U/ml);培養(yǎng)基中另可含有質(zhì)量比為5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自體血清。1-2天后將MSC轉(zhuǎn)入不含任何生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基內(nèi)，在氧濃度為0.5%至2%，溫度為37°C的環(huán)境中培養(yǎng)I至3天，所用的培養(yǎng)基為Ml 19、DMEM、RPMI-1640, F12、磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)或O. 9%的醫(yī)用生理鹽水， 并可添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的制備方法，其特征在于，不添加1%的醫(yī)用人血清白蛋白或自體血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的制備方法，其特征在于，所述MSC細(xì)胞為I型MSC細(xì)胞。
9.一種由權(quán)利要求1-8任一所述的方法制備獲得的制劑。
10.權(quán)利要求9所述的制劑在制備治療缺血性腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療缺血性腦血管疾病的制劑及其制備方法，該制劑的制備方法是通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞獲得間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)，進(jìn)而在低血清條件培養(yǎng)上述MSC細(xì)胞，最后分離MSC細(xì)胞獲得無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基，并對(duì)該無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行相應(yīng)后處理，即可獲得所述制劑。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的治療缺血性腦血管疾病的制劑能夠顯著的促進(jìn)缺血性壞死的腦組織的相應(yīng)功能的恢復(fù)。
文檔編號(hào)A61K35/28GK102641293SQ20111004191
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月21日
發(fā)明者楊子江, 顧麗婭, 顧茂健 申請(qǐng)人:楊子江