專利名稱：一種載蛋白類藥物磁性復合納米材料的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于納米材料的可控制備和應用技術領域，特別涉及用超聲乳化法制備復合磁性納米材料包載細胞因子的技術，以及該復合磁性納米材料的用途。
背景技術：
磁性納米材料因具有強磁性和低細胞毒性，在生物醫(yī)學上有巨大的應用潛力，如在蛋白或細胞的純化、藥物或基因的投遞、免疫檢測和磁共振成像等方面都有廣泛的應用。它具有集靶向治療、成像、低細胞毒性等于一身的優(yōu)勢。無機材料存在分散性好、尺寸和形貌易控以及均一性好等在可控性上的優(yōu)勢，有機材料具有毒性小、體內可降解和易于多功能化等在應用性上的優(yōu)勢，因此結合兩者的長處構建新的多功能磁性材料將彌補相互間的不足和拓展它們在生物醫(yī)學上的應用。
腫瘤是威脅人類健康的主要疾病，目前主要治療手段仍限于手術、放療及化療。隨著現(xiàn)代分子生物學、分子遺傳學及免疫學的迅速發(fā)展，人們對免疫系統(tǒng)的作用機制、腫瘤抗原及其相關基因，機體抗腫瘤效應，腫瘤逃逸機制等有了更深入的認識。人們對免疫系統(tǒng)能夠識別并殺傷腫瘤已深信不疑，并做了許多應用免疫治療腫瘤的嘗試，取得了一些令人鼓舞的結果，其中細胞因子治療是這個領域中的ー個重要組成部分。臨床上常用治療腫瘤的細胞因子包括干擾素(IFN)、白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。其中白介素-2(IL-2)又稱為T細胞生長因子，是調節(jié)機體免疫功能最主要的淋巴因子之一。它能促進T、B細胞活化、増殖和分化，還能活化NK細胞及單核-巨噬細胞，并增強NK細胞殺傷腫瘤的細胞毒作用。大劑量的IL-2誘導活化后的NK細胞稱為LAK細胞，從而產(chǎn)生細胞毒作用。早在20世紀80年代IL-2或與LAK細胞聯(lián)合應用就開始應用于臨床，尤其在轉移性腎癌中作用明顯。⑶8+T細胞、⑶4+T細胞、單核-巨噬細胞受到IL-2的持續(xù)作用后，其抗原遞呈能力、殺菌力、細胞毒性均明顯增強，分泌某些細胞因子的能力也得到加強，使用IL-2治療腫瘤取得了一定的療效。但是這些用于治療的細胞因子在體內半衰期短，需反復大劑量給藥，系統(tǒng)性應用這些蛋白類細胞因子藥物常常導致嚴重的毒副作用，例如IL-2可引起發(fā)熱、嘔吐等一般癥狀，還可導致水鹽代謝紊亂和腎、肝、心、肺等功能異常，最常見、最嚴重的是毛細血管滲漏綜合癥，使患者不得不中止治療，限制了細胞因子IL-2的廣泛應用。為減輕IL-2的毒副作用，改全身用藥為局部用藥，起到了一定作用，但靶向作用不足。納米技術應用于藥物的緩釋開辟了新的途徑，探索ー種集多種功能于一身的納米材料，即可緩釋，又可靶向，將可克服目前的細胞因子治療腫瘤時的因用量大帶來的毒副作用，從而使細胞因子有效的發(fā)揮治療腫瘤作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對目前納米材料應用上的単一化，提供一種制備多功能的載蛋白類藥物(細胞因子)磁性復合納米材料的方法，所制備的載藥磁性復合納米材料可以集磁靶向、緩控釋和蛋白類藥物治療于一身。
本發(fā)明的目的在于針對目前腫瘤治療中存在的問題，如因靶向不好而產(chǎn)生的治療效率低、毒副作用大，提出了ー種制備載蛋白類藥物磁性復合納米材料的制備方法，得到的載蛋白類藥物磁性復合納米材料可通過磁性靶向提高靶向和治療效率，通過緩控釋性能降低藥物毒副作用，從而實現(xiàn)腫瘤的高效、低毒的治療。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案ー種載蛋白類藥物磁性復合納米材料的制備方法，包括如下步驟I)制備表面包覆油酸的Fe3O4磁性納米顆粒，或者表面親油的Y _Fe203、FePt、MgFe2O4^ MnFe2O4 或 CoFe2O4 磁性納米顆粒；2)制備蛋白類藥物的水溶性溶液； 3)配制聚乳酸/こ醇酸共聚物(PLGA)的ニ氯甲烷溶液，其中PLGA的濃度為5 200mg/ml ；4)將步驟I)制備的磁性納米顆粒加入到步驟3)配制的PLGA ニ氯甲烷溶液中，混勻；5)將蛋白類藥物的水溶性溶液與步驟4)制得的液體混勻，并在0°C下超聲乳化；6)在步驟5)所得的乳化液中加入1-3倍體積的I %聚烯こ醇(PVA)，0°C下超聲乳化，再將所得乳化液緩慢加到大量O. 1% PVA中以穩(wěn)定乳化液，隨后置于室溫振蕩以揮發(fā)ニ氯甲烷，最后4°C離心收集載藥磁性復合納米材料。上述步驟I)制備的磁性納米顆粒的尺寸(粒徑)優(yōu)選為2 20nm，所述磁性納米顆粒最常使用的是利用共沉淀方法合成的Fe3O4磁性納米材料。通過Fe3+和Fe2+共沉淀方法得到Fe3O4顆粒是親水性的，為了實現(xiàn)與PLGA的相互融合，需要將磁顆粒表面進行改性使其親油，通過油酸對磁顆粒的表面包覆實現(xiàn)了磁顆粒的親油性。上述步驟2)中所述蛋白類藥物是水溶性的，通常是細胞因子，例如白介素-2，其濃度優(yōu)選 100-200 μ g/ml。上述步驟3)配制的聚乳酸/こ醇酸共聚物(PLGA)的ニ氯甲烷溶液，PLGA濃度優(yōu)選為 15 150mg/ml。上述步驟5)形成的混合液中磁性納米顆粒的終濃度優(yōu)選為O. 01 10mg/ml,更優(yōu)選為O. 05 5mg/ml ;蛋白質藥物的終濃度優(yōu)選為10-20 μ g/ml。上述步驟5)利用超聲乳化法將水溶性藥物和脂溶性溶液混合，超聲乳化的過程可以用帶探頭的細胞破碎儀在功率50-100W的情況下，冰浴條件下超聲O. 5 Imin ；上述步驟6)采用超聲乳化方法實現(xiàn)載蛋白類藥物磁性納米材料的制備，所使用的PVA是水溶性高分子聚合物，有較強的粘接性，并有分散成膜性，用于增強PLGA對水溶性蛋白類藥物的包裏。步驟5)制備的乳化液(記作初乳)與1% PVA混合后超聲乳化的過程可以用帶探頭的細胞破碎儀在功率IOOW的情況下，冰浴條件下超聲O. 5 2min，得到復乳，其中初乳與1% PVA的體積比優(yōu)選為I : (1-3)，更優(yōu)選為I : 2。再將復乳緩慢加入O. 1% PVA中，復乳與O. 1% PVA的體積比優(yōu)選為I : (30-40)，更優(yōu)選為3 100。然后將溶液置于室溫振蕩過夜，揮發(fā)ニ氯甲烷，再9000-1200()rpm低溫離心5 20min，收集攜載了蛋白類藥物的多功能磁性復合納米材料。本發(fā)明通過超聲乳化法制備出了多功能磁性復合納米材料,該納米材料中含有磁性納米顆粒、PLGA和蛋白類藥物(如細胞因子白介素-2)。所得到的多功能納米材料單分散性較好，顆粒大小從幾十納米到幾微米大小不等，粒徑分布在200nm-2 μ m，平均粒徑為697. 6±0. 51nm(參見圖1，圖2)。該多功能磁性復合納米材料具有很好的磁性，能夠對藥物有很好的控制釋放，在PH7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中能持續(xù)釋放IL-2，第一天突釋率為10%左右，5天以后釋放量較恒定，15天內總共釋放約13. 59% (參見圖3)。本發(fā)明得到的多功能磁性復合材料其磁性強度可以通過加入磁顆粒的濃度來調節(jié)，在外加磁場的作用下可以實現(xiàn)對此納米藥物的定位進行控制。磁性納米材料一般是通過Fe3+和Fe2+共沉淀方法得到Fe3O4顆粒，是親水性的，為了實現(xiàn)與PLGA的相互融合，需要將磁顆粒表面進行改性使其親油，通過油酸對磁顆粒的表面包覆實現(xiàn)了磁顆粒的親油性。本發(fā)明得到的納米材料產(chǎn)量、尺寸分布以及蛋白類藥物的包封率和載藥率與PLGA的用量有重要的關系。為了實現(xiàn)PLGA對磁顆粒和蛋白類藥物的有效包覆，需要合適的PLGA用量。隨著PLGA量的増加，包封率會提高。而為了提高載藥率，PLGA與蛋白類藥物需要一個合適的比例。由于PLGA對蛋白類藥物的包裏，使得藥物可以通過PLGA的鏈間縫隙或降解作用得到釋放，從而可以有效的控制蛋白類藥物的濃度，減少對體內的毒副作用。 在本發(fā)明的一些實施例中，所述多功能磁性復合材料包覆小鼠重組IL_2(通過基因工程方法人工合成的細胞因子)，得到的載IL-2磁性復合納米材料，能夠延長IL-2的半衰期，降低反復大劑量給藥的頻率，在體外磁場的作用下可達到靶向作用，降低了 IL-2對全身的毒副作用。實驗證明，本發(fā)明得到的載IL-2磁性復合納米材料，保持了其細胞因子IL-2的生物學活性，促進淋巴細胞増殖，從而實現(xiàn)機體抗腫瘤免疫作用。


圖I是實施例I制備的載IL-2磁性納米粒的粒徑圖。圖2是實施例I制備的載IL-2磁性納米粒的兩張掃描電鏡圖。圖3是實施例I制備的載IL-2磁性納米粒在pH7. 4PBS溶液中的緩釋曲線圖。圖4顯示了實施例I制備的載IL-2磁性納米粒包裹的IL_2在體外刺激T淋巴細胞增殖的作用。圖5顯示了載IL-2磁性納米粒(PLGA/IL_2/Fe304)注射至荷瘤小鼠腫瘤區(qū)，在體外磁場作用下，包裹的IL-2在體內吸引大量淋巴細胞包圍及浸潤至腫瘤區(qū)(A)，而不加磁場的情況下，腫瘤區(qū)內無淋巴細胞浸潤(B)。圖6顯示了載IL-2磁性納米粒注射至荷瘤小鼠腫瘤區(qū)，鉄染色見在體外磁場作用下，鐵顆粒富集于腫瘤區(qū)(A)，而不加磁場組無鐵顆粒沉積(B)。
具體實施例方式下面通過實施例進ー步詳細描述本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1PLGA/IL_2/Fe304磁性復合納米材料在體外刺激T淋巴細胞增殖一、超聲乳化法制備集磁性、緩釋和IL-2于一身的多功能磁性復合納米材料。I)將10 μ g IL-2用100 μ I蒸餾水溶解制備得內水相；2)取118mg左右的PLGA溶于Iml ニ氯甲烷中，與適量Fe3O4磁性顆?；旌系糜拖?；3)將油相倒入內水相中，冰浴下50 100W超聲處理30s得初乳；4)將初乳加入2ml I % PVA中，于冰浴下100W超聲處理30s得復乳；
5)將復乳緩慢加入IOOml O. I % PVA中，放入恒溫磁力攪伴器上攪勻，室溫放置搖床上過夜，讓其揮發(fā)其殘余有機溶劑；最后將乳液在低溫離心機上離心15min(12000r/min,4°C )，用蒸餾水洗滌3適，上清液收集待測其包封率，沉淀為載藥微球，用適量無菌水超聲分散，放入4°C無菌保存。所制備的載IL-2磁性復合納米材料(表示為PLGA/IL_2/Fe304)的粒徑分布圖如圖I所示，掃描電鏡圖如圖2所示。從圖I和圖2中可以看出，載IL-2磁性復合納米材料的顆粒大小從幾十納米到幾微米大小不等，粒徑分布在200nm_2 μ m,平均粒徑為697. 6±0. 51nm。圖3是PLGA/IL-2/Fe304在pH7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中的緩釋曲線圖，PLGA/IL-2/Fe3O4顆粒能持續(xù)釋放IL-2，第一天突釋率為10%左右，5天以后釋放量較恒定，15天內總
共釋放約13.59%。ニ、PLGA/IL_2/Fe304磁性復合納米材料在體外刺激T淋巴細胞增殖取BALB/C小鼠的脾臟，剪碎，篩取細胞，F(xiàn)ecol離心，收集單個核細胞，體外1640培基培養(yǎng)，分組后，加入上述制備的PLGA/IL-2/Fe304磁性復合納米材料或單純IL-2，于24，42，72小時分別取細胞，用MTT法檢測細胞數(shù)，結果PLGA/IL-2/Fe304磁性復合納米材料及單純的IL-2均有明顯刺激淋巴細胞增殖的作用，但PLGA/IL-2/Fe304磁性復合納米材料作用稍低于單純的IL-2，因為前者具有緩釋的作用(見圖4)。實施例2PLGA/IL_2/Fe304磁性復合納米材料在體內刺激T淋巴細胞增殖取實施例I制備的PLGA/IL_2/Fe304磁性復合納米材料進行如下實驗，觀察到PLGA/IL-2/Fe304磁性復合納米粒在體內刺激T淋巴細胞増殖，并聚集淋巴細胞于腫瘤區(qū)，增強了其攻擊腫瘤的作用。BALB/C小鼠皮下接種S180肉瘤細胞5X 104，待腫瘤長至綠豆大，瘤內及瘤周注射PLGA/IL-2/Fe304磁性復合納米材料，其中IL-2為2萬單位，給藥后ー組加體外磁場固定于瘤上，磁力為4.0tesla，共24小吋。對照組只給藥，不加磁場，另設不給藥組(生理鹽水注射)，單純給IL-2組及只給PLGA/Fe304組，給藥后觀察腫瘤生長情況，小鼠死亡或于20天后活殺，取腫瘤及肝、脾、腎臟器，進行病理觀察。結果PLGA/IL-2/Fe304磁性復合納米粒注射入小鼠腫瘤后，在體外磁場作用下，淋巴細胞包圍及浸潤至腫瘤區(qū)，表明IL-2濃集于腫瘤區(qū)，IL-2釋放后促淋巴細胞増殖，從而加強殺傷腫瘤作用，用吋，IL-2釋放，導致脾臟増大，為對照組的I. 5倍(見圖5)。實施例3PLGA/IL_2/Fe304磁性復合納米材料在體外磁場的作用下，藥物富集于腫瘤區(qū)取實施例I制備的PLGA/IL_2/Fe304磁性復合納米材料進行如下實驗，可以看到在體外磁場的作用下，PLGA/IL-2/Fe304磁性復合納米粒富集于腫瘤區(qū)。BALB/C小鼠皮下接種S180肉瘤細胞5X 104，待腫瘤長至綠豆大，瘤內及瘤周注射PLGA/IL-2/Fe304磁性復合納米材料，其中IL-2為2萬單位，給藥后ー組加體外磁場固定于瘤上，磁力為4.0tesla，共24小吋。對照組只給藥，不加磁場，另設不給藥組(生理鹽水注射)，單純給IL-2組及只給PLGA/Fe304組，給藥后觀察腫瘤生長情況，小鼠死亡或于25天后活殺，取腫瘤及肝、脾、腎臟器，進行病理及鉄染色觀察。結果PLGA/IL-2/Fe304磁性復合納米粒注射入小鼠腫瘤后，在體外磁場作用下可使藥物濃集于腫瘤區(qū)，鉄染色見鐵顆粒富集于腫瘤區(qū),而不加磁場的PLGA/IL-2/Fe304組及PLGA/Fe304組均無鐵顆粒沉積(見圖6)。雖然，說明書通過一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本 發(fā)明基礎上，可以對之作ー些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.ー種載蛋白類藥物磁性復合納米材料的制備方法，包括如下步驟 1)制備表面包覆油酸的Fe3O4磁性納米顆粒，或者表面親油的Y-Fe203、FePt、MgFe204、MnFe2O4或CoFe2O4磁性納米顆粒； 2)制備蛋白類藥物的水溶性溶液； 3)配制5 200mg/ml的聚乳酸/こ醇酸共聚物的ニ氯甲烷溶液； 4)將步驟I)制備的磁性納米顆粒加入到步驟3)配制的聚乳酸/こ醇酸共聚物的ニ氯甲烷溶液中，混勻； 5)將蛋白類藥物的水溶性溶液與步驟4)制得的液體混勻，并在0°C下超聲乳化； 6)在步驟5)所得的乳化液中加入1-3倍體積的I%聚烯こ醇，(TC下超聲乳化，再將所得乳化液緩慢加到大量O. 1%聚烯こ醇中以穩(wěn)定乳化液，隨后置于室溫振蕩以揮發(fā)ニ氯甲烷，最后4°C離心收集載藥磁性復合納米材料。
2.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟I)制備的磁性納米顆粒的粒徑為2 20nm。
3.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述蛋白類藥物是細胞因子。
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述蛋白類藥物是白介素-2，其溶液濃度為100-200 μ g/ml。
5.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟3)配制的聚乳酸/こ醇酸共聚物的ニ氯甲烷溶液濃度為15 150mg/ml。
6.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟5)形成的混合液中磁性納米顆粒的濃度為O. 01 10mg/ml，蛋白類藥物的濃度為10-20 μ g/ml。
7.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟5)和步驟6)的超聲乳化在冰浴條件下進行，超聲時間為O. 5 2min。
8.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，在步驟6)中，穩(wěn)定乳化液所用的0.1%聚烯こ醇的體積是乳化液體積的20 40倍。
9.根據(jù)權利要求I 8任一所述的制備方法制備的載蛋白類藥物磁性復合納米材料。
10.權利要求9所述載蛋白類藥物磁性復合納米材料在制備治療腫瘤的藥物中應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種載蛋白類藥物磁性復合納米材料的制備方法及其應用。將表面親油的磁性納米顆粒和水溶性蛋白類藥物加入到聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)的二氯甲烷溶液中混合，并0℃下超聲乳化成初乳，再將初乳與1％聚烯乙醇混合并0℃下超聲乳化成復乳，最后在聚烯乙醇的穩(wěn)定作用下?lián)]發(fā)除去二氯甲烷，4℃離心收集得到載蛋白類藥物磁性復合納米材料。實驗證明，該方法制備的載白介素-2磁性復合納米材料在體外磁場作用下可使藥物濃集于腫瘤區(qū)，白介素-2在一段時間內慢慢釋放，并活化T細胞、NK細胞等免疫細胞，進而殺傷腫瘤細胞。
文檔編號A61K47/02GK102688494SQ201110070298
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權日2011年3月23日
發(fā)明者盧世璧, 唐芳瓊, 沈愛蓉, 眭翔, 袁玫, 許文靜, 郭全義, 黃興祿 申請人:盧世璧