專利名稱：一種樹突狀細胞腫瘤疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物疫苗及其制備方法，特別是涉及一種腫瘤疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
常規(guī)的腫瘤治療方法包括手術(shù)治療、放射線治療以及化療等。但現(xiàn)有的腫瘤治療方法往往不能解決腫瘤復發(fā)的問題。主要原因是構(gòu)成腫瘤的細胞中含有腫瘤干細胞，其具有干細胞的生物學特性，即自我更新、多潛能分化、高耐受性，即對化療藥物的高耐藥性。因此腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的真正元兇。樹突狀細胞(DC，Dendritic Cell)是人體內(nèi)功能最強的專職抗原遞呈細胞，具有活化初始型T細胞的功能。通俗地講DC相當于信使，將抗原信息傳遞給可以發(fā)揮免疫效應(yīng) 和殺傷功能的效應(yīng)者即T細胞。樹突狀細胞腫瘤疫苗(DC腫瘤疫苗)是攜帶腫瘤抗原信息的功能性樹突狀細胞，能激活特異性T細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)及免疫記憶功倉泛。DC腫瘤疫苗的優(yōu)勢以腫瘤抗原誘導DC并使其將腫瘤抗原信息傳遞給T細胞，使T細胞可以重新認識并殺傷腫瘤細胞。用不同形式的腫瘤抗原體外沖擊致敏DC后，可以產(chǎn)生較強的抗腫瘤免疫，并能抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。可在患者體內(nèi)誘發(fā)免疫記憶，使患者體內(nèi)獲得長期的抗痛效應(yīng)，防止腫瘤的復發(fā)。細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK, cytokine induced killer cell)是一種新型的免疫活性細胞，它是將核細胞在體外用多種細胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細胞，由于該種細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，CIK細胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣及非MHC限制性殺瘤的優(yōu)點。CIK細胞、DC腫瘤疫苗臨床可應(yīng)用于多種癌癥不同階段的治療，如肺癌(小細胞肺癌、鱗癌、腺癌等)及其轉(zhuǎn)移癌。消化系統(tǒng)食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)、直腸癌及其轉(zhuǎn)移癌。泌尿系統(tǒng)腎癌、腎上腺癌，及其轉(zhuǎn)移癌。婦科腫瘤子宮癌、卵巢癌及其轉(zhuǎn)移癌。血液系統(tǒng)急慢性白血病、淋巴瘤(除外T細胞淋巴瘤)，及其轉(zhuǎn)移癌。其他腫瘤惡性黑色素瘤、鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、舌癌等等。應(yīng)用至今，未見肝腎損傷、骨髓抑制等重大臨床不良反應(yīng)報告，少部分患者可出現(xiàn)一過性類流感樣癥狀，如發(fā)熱、頭痛，關(guān)節(jié)酸痛，按常規(guī)處理即可，大多可自行緩解。臨床研究表明，DC與CIK細胞共培養(yǎng)可大大增強CIK細胞的數(shù)量和殺傷活性，提高CIK細胞治療的臨床療效。利用負載腫瘤抗原的DC細胞與CIK細胞共孵育，可以同時促進細胞和DC的增殖及免疫功能，從而發(fā)揮CIK細胞的廣譜殺瘤和DC激活的特異性抗腫瘤的雙重效應(yīng)?，F(xiàn)有技術(shù)中的DC腫瘤疫苗，都是以普通腫痛細胞為靶標，即通過裂解普通腫痛細胞得到抗原，并將該抗原負載到患者的樹突狀細胞上。如此得到的靶向腫瘤細胞的樹突狀細胞用于治療癌癥，存在腫瘤在化療后耐藥性增加、復發(fā)和轉(zhuǎn)移率高的問題。原因是腫瘤中的腫瘤干細胞并未被全部殺死，而造成癌組織死灰復燃的生長，甚至極少數(shù)的腫瘤干細胞還驅(qū)動腫瘤的形成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種新的樹突狀細胞腫瘤疫苗(DC腫瘤疫苗)，其是以腫瘤干細胞為靶標，負載了通過裂解腫瘤干細胞得到的抗原組合物，在治療時可以直接靶向殺死腫瘤干細胞，提高腫瘤疾病的治愈率。同時本發(fā)明還通過篩選具有多重耐藥性的腫瘤干細胞來獲取抗原組合物，使其適用于各類患者。本發(fā)明的另一個目的是提供上述樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種樹突狀細胞腫瘤疫苗，其負載有多重耐藥性腫瘤干細胞抗原組合物。
本發(fā)明提供的DC腫瘤疫苗中負載的抗原組合物來自于腫瘤組織本身，主要針對于腫瘤干細胞，具體是將腫瘤組織經(jīng)過腫瘤干細胞原代分離、培養(yǎng)后得到腫瘤干細胞，再經(jīng)過流式細胞儀篩選具有多重耐藥性的腫瘤干細胞，最后經(jīng)過全細胞抗原制備而得到。本發(fā)明的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，包括以下步驟(I)對腫瘤組織進行原代分離和培養(yǎng)得到腫瘤干細胞；(2)采用流式細胞儀篩選具有多重耐藥性的腫瘤干細胞；(3)將步驟⑵得到的腫瘤干細胞制備得到全細胞抗原；(4)分離樹突狀細胞并培養(yǎng)；(5)將步驟(3)得到的全細胞抗原與步驟⑷的樹突狀細胞共培養(yǎng)得到負載有多重耐藥性腫瘤干細胞抗原組合物的樹突狀細胞腫瘤疫苗。由于利用負載腫瘤抗原的DC細胞與CIK細胞共孵育，可以同時促進CIK細胞和DC細胞的增殖及免疫功能，所以本發(fā)明的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，還可以是以下步驟(I)對腫瘤組織進行原代分離和培養(yǎng)得到腫瘤干細胞；(2)采用流式細胞儀篩選具有多重耐藥性的腫瘤干細胞；(3)將步驟⑵得到的腫瘤干細胞制備得到全細胞抗原；(4)分離樹突狀細胞(DC細胞)和細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)并培養(yǎng)；(5)將步驟(3)得到的全細胞抗原與步驟(4)的樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷細胞共培養(yǎng)得到負載有多重耐藥性腫瘤干細胞抗原組合物的樹突狀細胞腫瘤疫苗。本發(fā)明采用的腫瘤組織為已從患者體內(nèi)分離出的離體腫瘤組織，為臨床醫(yī)學中的廢棄物，離體后可在適當環(huán)境中長期保存，而腫瘤干細胞的原代分離和培養(yǎng)技術(shù)已是十分成熟的技術(shù)，在體外環(huán)境中干細胞可長期保存并快速增值，可臨床應(yīng)用。而耐藥性的腫瘤干細胞的篩選和全細胞抗原的制備方法也已是已知的技術(shù)。本發(fā)明的DC細胞或CIK細胞來自于外周血或臍帶血，以來自于臍帶血為優(yōu)。外周血和臍帶血可以通過專門儲存的機構(gòu)得到，如血庫或臍帶血庫，也可在適當環(huán)境中長期保存，隨取隨用，適于臨床應(yīng)用。而DC細胞或CIK細胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)也是已知的技術(shù)。本發(fā)明的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，可以采用各種離體腫瘤組織來制備，如肺癌食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)、直腸癌、腎癌、子宮癌、卵巢癌組織等等。優(yōu)選乳腺腫瘤組織。其中多重耐藥性腫瘤干細胞的篩選的機制是基于腫瘤化療耐藥性的機制，多是由于多重耐藥基因(MDRl)及其產(chǎn)物P-糖蛋白(Pgp)的表達增高，因此本方法基于抗原抗體反應(yīng)的基本原理，采用流式細胞技術(shù)，對培養(yǎng)得到的腫瘤干細胞進行多重耐藥基因(MDRl)及其產(chǎn)物P-糖蛋白(PgP)的檢測，篩選出這兩項表面標志物皆為陽性的細胞，即為多重耐藥性的腫瘤干細胞。常規(guī)以普通腫瘤干細胞為靶標的癌癥免疫治療方法仍然存在放療和化療后腫瘤耐受性尤其是耐藥性增加，復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高的問題。本發(fā)明針對具有多重耐藥性的腫瘤干細胞，用制備得到的抗原負載到樹突狀細胞上，并用所得樹突狀細胞疫苗來特異性殺傷腫瘤干細胞。樹突狀細胞疫苗相對于蛋白質(zhì)、分子水平的疫苗來說，有以下優(yōu)點①制備簡單；②包含有多種T細胞表位，可保證免疫的全面性及強效性；③符合異質(zhì)性腫瘤個體化治療方案。


圖I是DC-CIK細胞疫苗殺瘤實驗結(jié)果圖；圖2是DC細胞疫苗殺瘤實驗結(jié)果圖。
具體實施例方式為進一步說明本發(fā)明，結(jié)合以下實施例具體說明本實施例以優(yōu)選的乳腺腫瘤組織為干細胞來源，制備得到的DC腫瘤疫苗用于制備治療乳腺腫瘤疾病的藥物，但是本發(fā)明不僅僅限于乳腺腫瘤，其可以以任何其它腫瘤組織為干細胞來源，制備過程和治療效果與本實施例類似或本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過有限次試驗得到。一、乳腺癌干細胞的分離培養(yǎng)方法將腫瘤組織用含抗生素的生理鹽水沖洗，用眼科手術(shù)剪刀剪碎，37°C酶消化2小時，并用細胞篩過濾，將細胞懸液用Stemedia WIT-1 Culture Medium(stemgent)培養(yǎng)。該培養(yǎng)基是針對于乳腺癌上皮細胞的專用培養(yǎng)基，無需其他細胞生長因子使細胞保持為腔上皮狀細胞的形態(tài)，細胞會從上上皮細胞形態(tài)逐漸變化成類似腺癌細胞的形狀。再換成Stemedia WIT-P Culture Medium (stemgent)培養(yǎng)基培養(yǎng)，三天換液一次，5天傳代一次。二、乳腺癌干細胞的鑒定使用流式細胞儀對所培養(yǎng)的乳腺癌干細胞表面標志物進行培養(yǎng)，表型為⑶45-⑶31-TER119-(Lin_)⑶29+⑶24+，完全符合乳腺癌干細胞的細胞表型。多重耐藥性乳腺癌干細胞的篩選由于腫瘤干細胞可能對毒物(如化療藥物)具有自身保護機制，對化療藥物更具耐藥性。因此分離出具有多重耐藥性的腫瘤干細胞，并對其進行靶向的治療，為腫瘤的臨床治療提供指導作用。目前的文獻中得知，腫瘤化療耐藥性的機制是由于多重耐藥基因(MDRl)及其產(chǎn)物P-糖蛋白(PgP)的表達增高。因此本發(fā)明基于抗原抗體反應(yīng)的基本原理，采用流式細胞技術(shù)，對培養(yǎng)得到的乳腺癌干細胞進行多重耐藥基因(MDRl)及其產(chǎn)物P-糖蛋白(Pgp)的檢測，篩選出這兩項表面標志物皆為陽性的細胞，即為多重耐藥性乳腺癌干細胞。其他腫瘤干細胞的多重耐藥性的篩選標記也是這兩種，篩選方法類似。三、腫瘤干細胞抗原組合物的制備方法用生理鹽水洗滌并重懸干細胞；腫瘤干細胞熱休克在39°C水浴鍋里孵育干細胞2小時；腫瘤干細胞反復凍融使用篩選得到的具有多重耐藥性實驗的乳腺癌干細胞全細胞進行反復凍融，使細胞裂解，從而釋放出全細胞抗原，由DC去選擇腫瘤抗原并對其進行加工、呈遞。冷凍的溫度選擇為零下196度，融化的溫度選擇為室溫。由于經(jīng)過熱休克后，本發(fā)明的腫瘤干細胞會產(chǎn)生熱休克蛋白，裂解后仍然存在所述熱休克蛋白，熱休克蛋白的存在有助于負載后的樹突狀細胞免疫應(yīng)答。裂解完成后，通常通過離心和過濾的步驟除去裂解液中過大的細胞碎片。離心 600rpm, I分鐘，上清用0. 45um濾膜過濾。四、制備DC來源于血庫的臍帶血或外周血，用淋巴細胞分離液獲得濃縮白細胞，生理鹽水洗滌的得到新鮮的單核細胞。DC誘導用RPM1640培養(yǎng)基重懸新鮮制備的單核細胞后鋪于6孔細胞培養(yǎng)板中，放置于37°C，50ml/L C02培養(yǎng)箱中90min后，洗去未貼壁細胞，于培養(yǎng)板內(nèi)加入含IOOug/LCM-CSF, 50ug/LRPM1640完全培養(yǎng)基，第3天進行換液，第5天收獲iDC。抗原負載DC :用RPM1640完全培養(yǎng)基重懸imDC，加入前述制備的細胞抗原，37°C，50ml/L C02培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)48小時，收獲DC細胞。進行細胞技術(shù)和表型檢測。五、負載多重耐藥性乳腺癌干細胞疫苗對乳腺癌干細胞的殺傷作用的研究采用CCK-8檢測自體/異體抗原負載的DC與CIK共培養(yǎng)以及無抗原負載的DC與CIK共培養(yǎng)、單獨培養(yǎng)CIK對自體原代培養(yǎng)腫瘤干細胞的殺傷活性，為驗證實驗。多重耐藥性乳腺癌干細胞的抗原組合物制備的DC疫苗對腫瘤干細胞的殺傷作用試驗I、DC、CIK的體外誘導擴增、抗原負載及表型檢測分離臍帶血單個核細胞體外誘導制備DC、CIK細胞。于第8d天收集DC、CIK細胞，進行共培養(yǎng)，分為無抗原DC組，自體腫瘤全細胞抗原遞呈DC組，異體腫瘤細胞裂解物抗原遞呈DC組，以10 : I的比例與培養(yǎng)至第8d的CIK混合培養(yǎng)，三天后進行靶細胞殺傷實驗。流式細胞儀檢測DC表面成熟標志⑶83、⑶80、⑶86、HLA-DR的表達，CIK細胞檢測⑶3、⑶4、CD8、CD56的表達。該產(chǎn)品對腫瘤細胞殺傷作用檢測應(yīng)用CCK-8法檢測CIK，CIK-DC，CIK-DC-腫瘤干細胞抗原，分別對原代培養(yǎng)并篩選的多重耐藥性腫瘤干細胞的殺瘤活性。CCK-8試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為該試劑中含有WST-8 [其化學名稱為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H_四唑單鈉鹽],它在電子載體I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(I-MethoxyPMS)的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲基染料(Formazandye)。生成的甲基化合物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。2、實驗結(jié)果
根據(jù)CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit_8,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)說明書設(shè)立對照組，本試驗分為四組，一組為CIK組，一組為CIK-DC混合培養(yǎng)組，一組為腫瘤干細胞抗原負載的CIK-DC組，一組為只有腫瘤干細胞的對照組。應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測特異性靶細胞殺傷率。測定492nm的吸光度值，最后根據(jù)公式[(試驗孔-SR效應(yīng)細胞-SR靶細胞)/ (MR靶細胞-SR靶細胞)]X 100%。實驗共重復3次，對結(jié)果進行分析處理，比較各組細胞殺傷率的差異。CCK-8試劑ELISA法檢測結(jié)果，經(jīng)計算得到結(jié)果見表I和圖I :表I
權(quán)利要求
1.一種樹突狀細胞腫瘤疫苗，其特征在于所述樹突狀細胞腫瘤疫苗負載有多重耐藥性腫瘤干細胞抗原組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗，其特征在于所述多重耐藥性腫瘤干細胞抗原組合物是將腫瘤組織經(jīng)過腫瘤干細胞原代分離、培養(yǎng)后得到腫瘤干細胞，再經(jīng)過流式細胞儀篩選具有多重耐藥性的腫瘤干細胞，最后經(jīng)過全細胞抗原制備而得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗，其特征在于所述具有多重耐藥性的腫瘤干細胞為多重耐藥基因及其產(chǎn)物P-糖蛋白這兩項表面標志物都為陽性的細胞。
4.權(quán)利要求I所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)對腫瘤組織進行原代分離和培養(yǎng)得到腫瘤干細胞； (2)采用流式細胞儀篩選具有多重耐藥性的腫瘤干細胞； (3)將步驟(2)得到的腫瘤干細胞制備得到全細胞抗原； (4)分離樹突狀細胞并培養(yǎng)； (5)將步驟(3)得到的全細胞抗原與步驟(4)的樹突狀細胞共培養(yǎng)得到負載有多重耐藥性腫瘤干細胞抗原組合物的樹突狀細胞腫瘤疫苗。
5.權(quán)利要求I所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)對腫瘤組織進行原代分離和培養(yǎng)得到腫瘤干細胞； (2)采用流式細胞儀篩選具有多重耐藥性的腫瘤干細胞； (3)將步驟(2)得到的腫瘤干細胞制備得到全細胞抗原； (4)分離樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷細胞并培養(yǎng)； (5)將步驟(3)得到的全細胞抗原與步驟(4)的樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷細胞共培養(yǎng)得到負載有多重耐藥性腫瘤干細胞抗原組合物的樹突狀細胞腫瘤疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的腫瘤組織為乳腺腫瘤組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中采用流式細胞儀對培養(yǎng)得到的乳腺腫瘤干細胞進行多重耐藥基因及其產(chǎn)物P-糖蛋白的檢測，篩選出這兩項表面標志物都為陽性的細胞，即為具有多重耐藥性的乳腺腫瘤干細胞。
8.權(quán)利要求6或7所述的制備方法制備得到的樹突狀細胞腫瘤疫苗。
9.權(quán)利要求I所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗在制備治療腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗在制備治療乳腺腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種樹突狀細胞腫瘤疫苗，其負載有多重耐藥性腫瘤干細胞抗原組合物。本發(fā)明提供的DC腫瘤疫苗中負載的抗原組合物來自于腫瘤組織本身，主要針對于腫瘤干細胞，具體是將腫瘤組織經(jīng)過腫瘤干細胞原代分離、培養(yǎng)后得到腫瘤干細胞，再經(jīng)過流式細胞儀篩選具有多重耐藥性的腫瘤干細胞，最后經(jīng)過全細胞抗原制備而得到。
文檔編號A61K39/00GK102793912SQ201110137738
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者田杰 申請人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細胞科技有限公司