專利名稱：抗腫瘤生長的dna疫苗及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼可有效引發(fā)抗腫瘤細胞免疫應答的適宜分子的脫氧核糖核酸(DNA)疫苗。更具體地說，本發(fā)明涉及編碼癌癥相關凋亡抑制家族(IAP)蛋白和免疫活性基因產物的DNA疫苗。本發(fā)明還涉及使用該DNA疫苗抑制腫瘤生長的方法。
背景技術：
通過給予非常有限的預防性制劑，疫苗已用于對多種疾病提供長期保護，所述預防性制劑可刺激機體免疫系統(tǒng)在病原體增殖和引起病理反應之前破壞病原體。關于疫苗和用疫苗接種的各種方法述于Bernard R.Glick and Jack J.Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles and Applications of Recombinant DNA，Second Edition，ASMPress pp.253-276，(1998)。
接種疫苗是一種誘導機體自身免疫系統(tǒng)在感染物引起病理反應之前發(fā)現(xiàn)和消滅該感染物的方法。典型的疫苗是活的但減毒的感染物(病毒或細菌)或滅活形式的感染物。含活細菌或活病毒的疫苗必須是非病原性的。典型的細菌或病毒培養(yǎng)物通過物理或化學方式處理而減毒(弱化)。雖然這些感染物是非毒性的，但其仍可在疫苗治療患者中引發(fā)免疫應答。
免疫應答由抗原引發(fā)，而抗原可以是特異性大分子或感染物。這些抗原通常是蛋白、多糖、脂質或糖脂，它們被稱為B細胞和T細胞的淋巴細胞識別為“異物”。這兩類淋巴細胞與抗原接觸引發(fā)快速的細胞分裂和分化反應，導致形成接觸淋巴細胞的多個克隆。B細胞產生漿細胞，后者又產生稱為抗體(Ab)的蛋白，抗體可選擇性結合感染性物中存在的抗原，從而中和或滅活病原體(體液免疫)。在某些情況下，B細胞應答需要CD4輔助T細胞的輔助。
針對抗原接觸而形成的特異性T細胞克隆是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，其能夠結合并除去存在抗原的病原體和組織(細胞介導免疫或細胞免疫)。在某些情況下，抗原提呈細胞(APC)如樹突狀細胞，通過胞吞作用包裹病原體或其它外源細胞。然后APC加工細胞中的抗原，并將這些抗原以組織相容性分子肽復合物的形式提呈至CTL上的T細胞受體(TCR)，由此刺激免疫應答。
以形成特異性抗體為特征的體液免疫通常對抗急性細菌感染和病毒的反復感染最有效，而細胞介導免疫對抗病毒感染、慢性胞內細菌感染和真菌感染最有效。已知細胞免疫還可起抗癌的保護性作用，并負責排斥器官移植。
針對先前感染抗原而產生的抗體在很長時間內都可以在血液中檢測到，因而提供了檢測以前接觸的病原體的方法。當再次接觸同一種病原體時，免疫系統(tǒng)可通過在該病原體增殖和產生病理反應之前除去病原體而有效預防其再感染。
有時，由病原體引發(fā)的免疫應答也可以由與病原體具有相同抗原的非病原物產生。在這種情況下，患者無需先前受到感染也可以得到抗隨后接觸的病原體的保護作用。
但是，并不是所有的感染物都可如疫苗配制所要求的那樣輕易培養(yǎng)和滅活?，F(xiàn)代重組DNA技術允許基因工程改造獲得新疫苗，從而設法克服上述局限?？梢詣?chuàng)造缺失致病基因的感染物，由此可將活的、非毒性形式的微生物用作疫苗。也可以將相對非病原性的微生物如大腸桿菌工程改造為具有病原載體的細胞表面抗原。用這種轉化載體接種的患者的免疫系統(tǒng)就會受到“欺騙”，由此形成針對該病原體的抗體。將病原物的抗原性蛋白進行工程改造，使其在非病原性物種中表達，可分離并純化該抗原性蛋白，獲得“亞單位疫苗”。亞單位疫苗具有穩(wěn)定、安全、化學結構確定的優(yōu)點；但其生產可能受到成本限制。
近年來出現(xiàn)了新的疫苗生產方法，廣義地稱為基因免疫。該方法是將編碼病原物抗原的基因有效插入到要免疫患者的細胞中。處理細胞優(yōu)選為抗原提呈細胞(APC)，例如樹突狀細胞，其經過轉化，產生病原體的抗原性蛋白。然后，這些體內產生的抗原在宿主內引發(fā)所需的免疫應答。用于此類基因疫苗的遺傳物質可以是DNA或RNA構建物。通常，將編碼抗原的多核苷酸連同其它啟動子多核苷酸序列一起導入，以增強基因的插入、復制或表達。
編碼抗原基因的DNA疫苗可通過各種傳遞系統(tǒng)導入到患者的宿主細胞中。這些傳遞系統(tǒng)包括原核和病毒傳遞系統(tǒng)。例如，一種方法是用病毒性載體，如整合了新遺傳物質的痘苗毒株，接種宿主細胞。另一種方法是可將遺傳物質整合在質粒載體中，或作為“裸”多核苷酸(即簡單作為純化DNA)直接導入宿主細胞中。此外，DNA可穩(wěn)定地轉染到減毒細菌如鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)中?；颊哂棉D化的沙門氏桿菌(Salmonella)口服接種時，則細菌就轉運到腸道的淋巴集結處(即次級淋巴組織)，然后刺激免疫應答。
DNA疫苗提供了免疫對抗不是由非傳統(tǒng)病原體所引起的疾病(如遺傳疾病和癌癥)的良機。通常，遺傳癌癥疫苗將編碼抗原的基因導入到APC中，如此轉化的APC生產針對特定類型腫瘤細胞的抗原。因此，有效地抗多種癌癥的通用疫苗可能需要多種能免疫對抗每種癌癥細胞的單個疫苗。
凋亡抑制蛋白(即IAP-家族蛋白)是一類在多種不同腫瘤細胞中表達的天然抗原。顧名思義，這些蛋白以其天然形式抑制凋亡(即程序性細胞死亡)，而對凋亡的抑制又可導致癌癥細胞對誘發(fā)凋亡的化療劑如依托泊苷的抗性。IAP-家族蛋白的實例包括X染色體相關性IAP(XIAP)、NAIP、cIAP1(也稱為BIRC2)、cIAP2(也稱為BIRC3)、bruce(也稱為BIRC6)、生存蛋白(也稱為BIRC5)和liyin(也稱為BIRC7、KIAP和ML-IAP)。哺乳動物IAP家族蛋白包括具有三個BIR結構域的蛋白(例如XIAP、cIAP1、cIAP2和NAIP)以及具有單個BIR結構域的蛋白(例如生存蛋白和livin)。
Tamm等，Cancer Res.1998；58(23)5315-20已經報道了人生存蛋白在60多種人腫瘤細胞系中表達。Tamm等還報道了生存蛋白和XIAP都有效抑制凋亡誘導劑如Bax或Fas(CD95)治療癌癥細胞所誘發(fā)的程序性細胞死亡(凋亡)。有報道指生存蛋白和IAP-家族蛋白通過結合效應細胞死亡蛋白酶如胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7抑制凋亡。IAP-家族蛋白突變可導致凋亡抑制活性乃至凋亡誘導活性相對野生型IAP-家族蛋白活性下降。IAP-家族蛋白的抗凋亡活性據(jù)信與BIR結構域相關。
生存蛋白據(jù)報道存在于大多數(shù)常見人癌癥細胞中，包括肺癌、前列腺癌、乳癌和胰腺癌。此外，在高惡度非Hodgkin氏淋巴瘤中也鑒定出生存蛋白，但在低惡度非Hodgkin氏淋巴瘤中未鑒定出生存蛋白。據(jù)報道，胎兒發(fā)育期的正常細胞中存在生存蛋白，但與大多數(shù)其它IAP-家族蛋白不同，生存蛋白實際上在正常成年人組織中不能檢出。參閱Ambrosini等，Nat.Med.1997；3(8)917-21。
已經在某些成人組織和胚胎組織中檢測出livin。據(jù)報道livin在黑素瘤、結腸癌細胞、膀胱癌細胞和肺癌細胞中的表達水平提高。已經報道了兩種livin剪接變體，它們都包含單個BIR結構域。全長α變體有298個氨基酸殘基，而β變體有280個氨基酸殘基。
除了人之外，還在其它多個物種中鑒定出IAP-家族蛋白，這些物種包括哺乳動物如小鼠、兩棲動物如非洲爪蟾(Xenopus)屬、昆蟲如果蠅(Drosophila)屬，以及桿狀病毒。
生存蛋白在癌癥細胞中普遍且高度選擇性表達的特性使其成為潛在有用的癌癥診斷標記。例如，據(jù)Rohayem等Cancer Res.2000；601815-17報道，已經在人肺癌和結直腸癌患者中鑒別出針對生存蛋白的自身抗體。
還已經將生存蛋白確定為癌癥治療靶點。生存蛋白對胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7的抑制作用與癌癥細胞對各種凋亡刺激性化療的抗性相關。已經報道了針對生存蛋白表達的反義寡核苷酸在腺癌細胞系中下調生存蛋白表達，并使癌癥細胞對化療劑依托泊苷敏化。參閱Olie等，Cancer Res.2000；602805-9；和Mesri等，J.Clinical Res.，2001；108981-990。
細胞因子是由細胞產生的可影響其它細胞行為的蛋白和多肽，所述細胞行為例如為細胞增殖、細胞分化、調節(jié)免疫應答、血細胞生成和炎癥反應。細胞因子被分類為許多家族，包括趨化因子、血細胞生成素、免疫球蛋白、腫瘤壞死因子和各種未指定的分子。一般參見Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Revised Edition，Oxford University Press，2000；和C.A.Janeway，P.Travers，M.Walport and M.Schlomchik，Immunobiology，F(xiàn)ifth Edition，Garland Publishing，2001(后文稱為Janeway and Travers)。細胞因子的簡明分類描述于Janeway and Travers，Appendix III，677-679頁，該文獻的相關公開內容通過引用結合到本文中。
血細胞生成素包括例如促紅細胞生成素、白介素-2(IL-2，由T細胞產生的133個氨基酸的蛋白，參與T細胞增殖)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-15(114個氨基酸的IL-2樣蛋白，其刺激腸上皮細胞、T細胞和NK細胞生長)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、制癌蛋白M(OSM)和白血病抑制因子(LIF)。
干擾素包括例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ(由T細胞和NK細胞產生的143個氨基酸的同源二聚體蛋白，其參與巨噬細胞活化、增加MHC分子和抗原加工元件的表達、IG類別轉換以及TH2抑制)。
免疫球蛋白包括例如B7.1(CD80)和B7.2(CD86)，它們共刺激T細胞應答。
腫瘤壞死因子(TNF)家族包括例如TNF-α、TNF-β(淋巴毒素)、淋巴毒素-β(LT-β)、CD40配體、Fas配體、CD27配體、CD30配體、4-1BB配體、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(Trail)和OPG配體。
未指定具體家族的各種細胞因子包括例如腫瘤生長因子-β(TGF-β)、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-10、IL-12(天然殺傷細胞刺激因子；具有一條197個氨基酸的鏈和一條306個氨基酸的鏈的異源二聚體，其參與NK細胞活化和誘導T細胞分化為TH1-樣細胞)、巨噬細胞抑制因子(MIF)、IL-16、IL-17(一種誘導細胞因子產生的因子，其在上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞中誘導細胞因子產生)和IL-18。
趨化因子是一個為相對較小的趨化蛋白和多肽的細胞因子的家族，其刺激各種細胞的遷移和活化，例如白細胞遷移(如吞噬細胞和淋巴細胞)。趨化因子對炎癥和其它免疫反應起作用。趨化因子分類為多個家族，包括C趨化因子、CC趨化因子、CXC趨化因子和CX3C趨化因子。這些名稱表示分子中半胱氨酸殘基的數(shù)目和間隔；C趨化因子具有一個半胱氨酸，CC趨化因子具有兩個連續(xù)的半胱氨酸，CXC趨化因子具有兩個半胱氨酸，它們由一個氨基酸殘基分隔，而CX3C趨化因子具有兩個半胱氨酸，它們由三個氨基酸殘基分隔。趨化因子作用于細胞表面上存在的多種趨化因子受體。參見Janeway andTravers，Appendix IV，680頁，該文獻的相關公開內容通過引用結合到本文中。
另外，趨化因子可具有免疫調節(jié)活性，參與對癌癥的免疫應答。例如，鼠6Ckine/SLC是現(xiàn)在一般稱為CCL21的人次級淋巴組織趨化因子(SLC)的小鼠類似物，據(jù)報道其在C-26結腸癌腫瘤細胞系中誘導抗腫瘤反應。參閱Vicari等，J.Immunol.2000；165(4)1992-2000。人CCL21及其鼠對應物6Ckine/SLC被分類為CC趨化因子，其作用于CCR7趨化因子受體。Vicari等還報道了鼠6Ckine/SLC(muCCL21)是CXCR3趨化因子受體的配體。人CCL21、鼠muCCL21和各種其它趨化因子都參與調節(jié)各種免疫系統(tǒng)細胞，例如樹突狀細胞、T細胞和天然殺傷(NK)細胞。
Mig和IP-10是作用于CXCR3受體的CXC趨化因子，CXCR3與T細胞活化有關。淋巴細胞趨化因子(Lymphotactin)是C趨化因子，作用于與T細胞和NK細胞相關的XCR1受體。Fractalkine是CX3C趨化因子，作用于與T細胞、單核細胞和嗜中性粒細胞相關的CX3CR1受體。
NK細胞是大顆粒淋巴細胞，識別并破壞感染病毒的細胞。NK細胞可由免疫調節(jié)多肽配體和NK細胞表面受體之間的相互作用調節(jié)。例如，可調節(jié)NK細胞活性的NKG2D受體的配體包括趨化因子如muCCL21，以及應激誘導性多肽配體如MHC I類鏈相關抗原和UL16結合蛋白。據(jù)報道，鼠H60次要組織相容性抗原肽也結合NKG2D受體。參閱例如Robertson等，Cell Immunol 2000；199(1)8-14；Choi等，Immunity 2002，17(5)593-603和Farag等，Blood，2002；100(6)1935-1947。
目前，急需可刺激抗癌癥細胞的系統(tǒng)免疫應答的疫苗，本發(fā)明通過提供單一載體中的編碼癌癥相關IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物的DNA疫苗而滿足了該需要。
發(fā)明概述有效激發(fā)抗癌癥細胞的免疫應答的DNA疫苗包含藥物可接受載體中，DNA構建物，該DNA構建物有效編碼癌癥相關IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物。所述DNA構建物優(yōu)選有效整合入載體如減毒細菌(例如減毒鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)載體)中。DNA疫苗包括編碼至少一種癌癥相關IAP-家族蛋白的多核苷酸和編碼免疫活性基因產物的多核苷酸。DNA構建物優(yōu)選編碼成人組織基本沒有、但在癌癥組織中增加的癌癥相關IAP-家族蛋白，例如生存蛋白(如人生存蛋白、鼠生存蛋白等)或livin蛋白。由DNA構建物編碼的免疫活性基因產物優(yōu)選為細胞因子、天然殺傷細胞表面受體的配體或類似的免疫活性分子。
在一個實施方案中，DNA疫苗優(yōu)選包含有效編碼生存蛋白的DNA，所述生存蛋白選自(a)具有SEQ ID NO2氨基酸殘基序列的野生型人生存蛋白；(b)其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO2至少80％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物；(c)具有SEQ ID NO23氨基酸殘基序列的人生存蛋白剪接變體；(d)具有SEQ ID NO24氨基酸殘基序列的人生存蛋白剪接變體；和(e)結合MHC I類分子并由細胞毒性T細胞識別的生存蛋白片段。
在又一個實施方案中，DNA疫苗優(yōu)選包含有效編碼livin蛋白的DNA構建物，所述livin蛋白選自(a)具有SEQ ID NO27氨基酸殘基序列的全長野生型人livin α剪接變體；(b)具有SEQ ID NO29氨基酸殘基序列的人livinβ剪接變體；(c)其氨基酸殘基序列與SEQ IDNO27至少80％相同的全長野生型人livin的免疫原性同源物；(d)其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO29至少80％相同的野生型人livinβ剪接變體的免疫原性同源物；和(e)結合MHC I類分子并由細胞毒性T細胞識別的livin蛋白片段。
優(yōu)選的細胞因子包括趨化因子，如人CCL21、鼠CCL21、淋巴細胞趨化因子、Fractalkine、IP-10等；血細胞生成素，如IL-2、IL-15等；干擾素，如IFN-γ等；以及其它與T細胞和NK細胞遷移或增殖相關的細胞因子，如IL-12、IL-17等。
優(yōu)選的天然殺傷細胞表面受體配體是結合NKG2D細胞表面受體的應激誘導性蛋白，如人MICA、人MICB、人ULBP1、人ULBP2、人ULBP3等。特別優(yōu)選的NKG2D配體是MICA和MICB。
疫苗中也可存在常規(guī)佐劑如鋁、水包油乳液、防腐劑等。本發(fā)明的DNA疫苗刺激抗腫瘤細胞的免疫應答，包括刺激腫瘤細胞凋亡，由此抑制腫瘤生長和轉移。
在本發(fā)明的方法方面，DNA疫苗用于在疫苗接種患者中提供腫瘤生長的長期抑制。將藥物可接受載體中的包含有效編碼IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物的多核苷酸構建物的DNA疫苗，以足以激發(fā)抗腫瘤細胞免疫應答的量，給予(優(yōu)選口服)需要抑制腫瘤生長的患者。
本發(fā)明疫苗可用于治療各種類型的癌癥。例如，患肺癌、結直腸癌、黑素瘤等的患者，可受益于本發(fā)明疫苗的免疫。
附圖簡述在附圖中，

圖1顯示編碼人生存蛋白的核酸序列SEQ ID NO1；圖2顯示人生存蛋白的氨基酸殘基序列SEQ ID NO2；圖3顯示編碼鼠TIAP的核酸序列SEQ ID NO3；圖4顯示鼠TIAP的氨基酸殘基序列SEQ ID NO4；圖5顯示人生存蛋白和鼠TIAP之間的蛋白同源性；圖6顯示編碼人SLC(CCL21)的核酸序列SEQ ID NO5；圖7顯示人SLC(CCL21)的氨基酸殘基序列SEQ ID NO6；圖8顯示編碼鼠6Ckine/SLC(muCCL21)的核酸序列SEQ IDNO7；圖9顯示鼠6Ckine/SLC(muCCL21)的氨基酸殘基序列SEQ IDNO8；圖10顯示人SLC(CCL21)和鼠6Ckine/SLC(muCCL21)之間的蛋白同源性；圖11顯示編碼鼠次要組織相容性抗原肽H60的部分核酸序列SEQ ID NO9；圖12顯示次要組織相容性抗原肽H60的部分氨基酸殘基序列SEQ ID NO10；圖13圖示在pBudCE4.1載體中的編碼生存蛋白(鼠生存蛋白，也稱為TIAP)和免疫調節(jié)細胞因子(CCL21，也稱為SLC)的DNA構建物；圖14A圖示用對照緩沖液(E)、含空載體的對照疫苗(D)、含趨化因子的DNA疫苗(C)、含生存蛋白的疫苗(B)和本發(fā)明疫苗(A)治療的小鼠中Lewis肺癌肺轉移瘤的平均腫瘤體積；圖14B包括由圖14A所述接種小鼠切除的典型肺癌轉移瘤的圖片；圖15顯示由圖14A所述DNA疫苗誘導的抗D121肺癌細胞的T細胞介導細胞毒性；對每類接種，以裂解百分率(Y軸)對三個不同的效應細胞/靶細胞(E/T)比率作圖(即100∶1，第一個數(shù)據(jù)點；50∶1，第二個數(shù)據(jù)點；和25∶1，第三個數(shù)據(jù)點)；圖16根據(jù)流式細胞儀分析測定，圖示說明本發(fā)明疫苗接種小鼠中T細胞活化分子的表達上調；圖17圖示說明本發(fā)明疫苗和各種對照疫苗接種小鼠后樹突狀細胞對共刺激分子的表達增強；圖18根據(jù)流式細胞儀分析測定，圖示說明本發(fā)明疫苗和各種對照疫苗接種小鼠后誘導胞內細胞因子釋放；圖19顯示FACS圖，表明用本發(fā)明疫苗和各種對照疫苗對小鼠(A)接種后3小時和(B)接種后24小時D121肺癌細胞的凋亡增加；圖20圖示整合TIAP和次要組織相容性抗原肽H60的表達構建物；圖21圖示對分離自本發(fā)明疫苗接種小鼠的脾細胞的細胞毒性測定的數(shù)據(jù)；
圖22顯示由實施例10所述接種小鼠切除的肺(頂部)和治療組小鼠平均肺重量的條圖(底部)；圖23圖示接種并用CT-26腫瘤細胞攻擊的小鼠的生存百分率；圖24圖示H60肽(A)和鼠生存蛋白(B)的表達；圖25顯示編碼6CKine/SLC的CCL21b變體的核酸序列SEQ IDNO11；圖26顯示6CKine/SLC的CCL21b變體的氨基酸殘基序列SEQ IDNO12；圖27顯示編碼人MICA的核酸序列SEQ ID NO13；圖28顯示人MICA的氨基酸殘基序列SEQ ID NO14；圖29顯示編碼人MICB的核酸序列SEQ ID NO15；圖30顯示人MICB的氨基酸殘基序列SEQ ID NO16；圖31顯示編碼人ULBP1的核酸序列SEQ ID NO17；圖32顯示人ULBP1的氨基酸殘基序列SEQ ID NO18；圖33顯示編碼人ULBP2的核酸序列SEQ ID NO19；圖34顯示人ULBP2的氨基酸殘基序列SEQ ID NO20；圖35顯示編碼人ULBP3的核酸序列SEQ ID NO21；圖36顯示人ULBP3的氨基酸殘基序列SEQ ID NO22；圖37顯示人生存蛋白剪接變體生存蛋白-2B(SEQ ID NO23)和剪接變體生存蛋白-ΔEx3(SEQ ID NO24)的氨基酸殘基序列；圖38是檢索號NP 005922的GENBANK記錄副本，描述了MICB的等位基因變異體；圖39顯示編碼全長人livinα剪接變體的核酸序列SEQ ID NO26；圖40顯示人livinα剪接變體的氨基酸殘基序列SEQ ID NO27；圖41顯示編碼人livinβ剪接變體的核酸序列SEQ ID NO28；圖42顯示人livin β剪接變體的氨基酸殘基序列SEQ ID NO29。
優(yōu)選實施方案詳述有效激發(fā)抗腫瘤細胞的免疫應答的DNA疫苗包含有效編碼IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物的DNA構建物。本文和后附權利要求書中使用的術語“DNA構建物”是指可在靶細胞中轉錄的合成DNA結構。該構建物可包含線性核酸，如純化DNA、整合到質粒載體中，DNA或整合到任何其它適于將DNA導入宿主細胞的載體的DNA。優(yōu)選所述DNA整合到病毒或細菌載體中，更優(yōu)選整合到非致病性減毒病毒或細菌載體中，最優(yōu)選整合到減毒細菌載體中。
本文使用的術語“免疫性”指抗毒性感染物或腫瘤抗原的長期免疫保護。術語“免疫接種”指預防性接觸非毒性來源的病原體抗原，使受治療患者對該病原體產生免疫性。
本文使用的術語“抗體”是指特異性結合抗原的為糖基化蛋白、免疫球蛋白的分子。
本文使用的術語“抗原”是指這種物質當其導入到免疫活性動物中時，刺激產生可結合該抗原的一種或多種特異性抗體。本文使用的術語“免疫原”是指這種物質其自身不能刺激抗體產生，但如果與載體組合就可以。
本文使用的術語“保守置換”是指一個氨基酸殘基由另一個生物學相似的殘基置換。保守置換的實例包括一個疏水殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸由另一個疏水殘基置換，或者一個親水殘基如精氨酸由賴氨酸置換或反之，谷氨酸由天冬氨酸置換或反之，或谷氨酰胺由天冬酰胺置換或反之，等等。
本文使用的術語“大致相當于”以各種語法形式修飾肽序列時，是指所述肽序列在其氨基端和羧基端的任一側或兩側加或減至多3個氨基酸殘基，并在多肽序列上僅包含保守置換。
本文及后附權利要求書使用的術語“免疫活性基因產物”及其語法變體包括具有免疫調節(jié)活性的蛋白和多肽，例如作用于T細胞和NK細胞并調節(jié)其活性的蛋白和多肽。
本文及后附權利要求書使用的術語“IAP-家族蛋白”包括在腫瘤細胞中表達的、以其天然形式抑制凋亡的任一類天然抗原。IAP家族蛋白包括例如人生存蛋白、人X染色體連鎖-IAP(XIAP)、鼠TIAP(生存蛋白的鼠類似物)、人livin、人c-IAP-1、人c-IAP-2、人NAIP、任何包括至少一個桿狀病毒凋亡抑制重復蛋白(BIR)結構域的其它蛋白或其同源物。BIR結構域存在于所有的野生型IAP-家族蛋白中。該結構域包含4個相對較短的α-螺旋和一個三鏈反向平行β折疊結構區(qū)。該結構域用三個半胱氨酸殘基和一個組氨酸殘基結合Zn，它們在IAP-家族蛋白中是保守的。本文及后附權利要求書使用的術語“IAP-家族蛋白”還包括野生型IAP蛋白的變體，例如剪接變體和置換變體等，以及其結合主要組織相容性(MHC)I類分子并由細胞毒性T細胞識別的片段和免疫原性同源物(即生存蛋白表位)。
本文及后附權利要求書使用的術語“癌癥相關”在修飾IAP-家族蛋白時是指在癌癥細胞中的表達水平比在正常非癌癥細胞中的表達水平高的IAP-家族蛋白。癌癥相關IAP-家族蛋白的實例包括但不限于人生存蛋白和人livin。
本文及后附權利要求書使用的術語“生存蛋白”包括全長人生存蛋白分子(SEQ ID NO2)、其全長鼠類似物(即本文所述的TIAP)、人生存蛋白或鼠生存蛋白變體如剪接變體和置換變體，以及結合主要組織相容性(MHC)I類分子并由細胞毒性T細胞識別的人生存蛋白片段(例如表位)和人生存蛋白免疫原性同源物。已知的人生存蛋白置換變體包括在SEQ ID NO2氨基酸殘基序列中具有T34A置換的蛋白、在SEQ ID NO2氨基酸殘基序列中具有D53A置換的蛋白以及在SEQ ID NO2氨基酸殘基序列中具有C84A置換的蛋白(參見Song等，Mol.Biol.Cell，2004；15(3)1287-1296，2003年12月29日電子出版)。這些已知變體每個都具有凋亡活性，與野生型生存蛋白具有抗凋亡活性相反。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的DNA疫苗包含有效編碼生存蛋白的DNA構建物，所述生存蛋白例如為具有SEQ ID NO2氨基酸殘基序列的野生型人生存蛋白、其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO2至少80％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物、具有SEQ IDNO23氨基酸殘基序列的人生存蛋白剪接變體、具有SEQ ID NO24氨基酸殘基序列的人生存蛋白剪接變體，以及結合MHC I類分子并由細胞毒性T細胞識別的生存蛋白片段。
本文及后附權利要求書使用的術語“l(fā)ivin蛋白”包括全長人livinα剪接變體(SEQ ID NO27)、人livinβ剪接變體(SEQ ID NO29)、人livinα和β剪接變體的置換變體，以及結合MHC I類分子并由細胞毒性T細胞識別的livin蛋白片段和免疫原性同源物。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的DNA疫苗包含有效編碼livin蛋白的DNA構建物，所述livin蛋白例如為具有SEQ ID NO27氨基酸殘基序列的全長野生型人livinα剪接變體、具有SEQ ID NO29氨基酸殘基序列的人livinβ剪接變體、其氨基酸殘基序列與SEQ IDNO27至少80％相同的全長野生型人livin的免疫原性同源物、其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO29至少80％相同的野生型人livinβ剪接變體的免疫原性同源物，以及結合MHC I類分子并由細胞毒性T細胞識別的livin蛋白片段。
本文及后附權利要求書使用的術語“免疫原性同源物”及其語法變體當用于修飾癌癥相關IAP-家族蛋白如生存蛋白和livin時，是指與野生型癌癥相關IAP-家族蛋白具有高度同源性的蛋白，其可結合MIC I類分子，并可由對相應野生型IAP-家族蛋白有活性的細胞毒性T細胞識別。免疫原性類似物優(yōu)選其氨基酸殘基序列與野生型癌癥相關IAP-家族蛋白至少約80％相同，更優(yōu)選至少約90％相同，最優(yōu)選至少約95％相同。
非為理論所囿，相信用本發(fā)明疫苗接種患者如人類患者，可使來源于癌癥相關IAP-家族蛋白的抗原選擇性提呈至免疫細胞如抗原提呈細胞的表面，另外還在這些細胞中選擇性表達免疫活性基因產物?？乖岢始毎砻嫔习┌Y相關IAP-家族蛋白如生存蛋白或livin蛋白的提呈增加，結合免疫活性基因產物如細胞因子或NK細胞表面受體的配體的表達，導致對表達癌癥相關IAP-家族蛋白如生存蛋白或livin蛋白的癌癥細胞的免疫應答增強。在成年人中，生存蛋白幾乎僅在癌癥細胞中表達。同樣，據(jù)報道livin在某些癌癥細胞系中表達升高，特別是在黑素瘤細胞系中。
在一個優(yōu)選實施方案中，DNA疫苗包含有效編碼生存蛋白和細胞因子的多核苷酸序列。所述生存蛋白優(yōu)選為人生存蛋白、鼠生存蛋白，或其表位。所述細胞因子優(yōu)選調節(jié)T細胞或NK細胞活性。優(yōu)選的細胞因子包括趨化因子、血細胞生成素和干擾素。其它優(yōu)選的細胞因子包括活化NK細胞的細胞因子如IL-12和刺激細胞因子產生的因子如IL-17。
在另一個優(yōu)選實施方案中，DNA疫苗包含有效編碼livin蛋白和細胞因子的多核苷酸序列。所述livin蛋白優(yōu)選為野生型人livin或其表位。所述細胞因子優(yōu)選調節(jié)T細胞或NK細胞活性。優(yōu)選的細胞因子包括趨化因子、血細胞生成素和干擾素。其它優(yōu)選的細胞因子包括活化NK細胞的細胞因子如IL-12和刺激細胞因子產生的因子如IL-17。
優(yōu)選的趨化因子包括CC趨化因子，特別是為CCR7趨化因子受體配體的CC趨化因子，如CCL21(SLC)等；為CR1受體配體的C趨化因子，如淋巴趨化因子等；為CX3CR1受體配體的CX3C趨化因子，如Fractalkine等；CXC趨化因子，特別是為CXCR3受體配體的CXC趨化因子，如IP-10等。所述趨化因子最優(yōu)選為人CCL21或其鼠類似物(鼠CCL21)。
優(yōu)選的血細胞生成素包括T細胞生長因子，如IL-2、IL-15等。優(yōu)選的干擾素包括T細胞和NK細胞產生的干擾素，例如IFN-γ等。其它優(yōu)選的細胞因子包括活化NK細胞的細胞因子如IL-12等；以及在上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞之類的細胞中誘導細胞因子產生的細胞因子，包括IL-17等。
在另一個優(yōu)選實施方案中，DNA疫苗包含有效編碼生存蛋白及天然殺傷細胞表面受體配體的多核苷酸序列。所述生存蛋白優(yōu)選為人生存蛋白、鼠生存蛋白或人生存蛋白表位。所述天然殺傷細胞表面受體配體優(yōu)選為NKG2D細胞表面受體配體。NKG2D細胞表面受體配體優(yōu)選為MHC I類鏈相關(MIC)抗原如MICA和MICB、UL16結合蛋白(ULBP)如ULBP1、ULBP2和ULBP3等。鼠NKG2D配體包括例如Rae1和次要組織相容性抗原肽H60。NKG2D細胞表面受體配體最優(yōu)選為MICA或MICB。
在又一個優(yōu)選實施方案中，DNA疫苗包含有效編碼livin蛋白和NK細胞受體配體的多核苷酸序列。livin蛋白可為野生型人livin或人livin表位或livin變體。
有效編碼癌癥相關IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物的本發(fā)明DNA構建物，優(yōu)選還有效連接至本領域廣為人知的基因表達所需調節(jié)元件。
所述DNA構建物優(yōu)選有效整合入表達載體中，如可得自Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA的BUDCEA.1表達載體。其它合適的表達載體可由例如BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA商購。一旦整合入表達載體中，則可通過用該表達載體轉染宿主細胞，將所述DNA構建物導入到宿主載體如減毒活細菌載體中，從而提供本發(fā)明的疫苗。
DNA構建物優(yōu)選包括核苷酸表達所必需的調控元件。此類元件包括例如啟動子、起始密碼子、終止密碼子和多腺苷酸化信號。此外，免疫原性靶蛋白編碼序列的表達通常還需要增強子。如本領域所知，這些調控元件優(yōu)選有效與編碼目的蛋白的序列相連接。選擇的調控元件優(yōu)選與其被施用的物種相容。
起始密碼子和終止密碼子優(yōu)選是編碼本發(fā)明基因疫苗中生存蛋白和免疫調節(jié)多肽的核苷酸序列的一部分。當然，起始密碼子和終止密碼子必須符合生存蛋白和免疫調節(jié)多肽的編碼序列讀框。
本發(fā)明疫苗所包含的啟動子和多腺苷酸化信號優(yōu)選在被免疫患者細胞中有功能。
用于本發(fā)明疫苗的啟動子，特別是用于生產人基因疫苗的啟動子，其實例包括但不限于猿病毒40(SV40)啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)如HIV長末端重復序列(LTR)啟動子、莫洛尼病毒啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子如CMV立即早期啟動子、EB病毒(EBV)啟動子、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子以及來自人基因的啟動子，如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸和人金屬硫蛋白的啟動子。
用于本發(fā)明疫苗的多腺苷酸化信號，特別是在用于生產人基因疫苗的多腺苷酸化信號，其實例包括但不限于SV40多腺苷酸化信號和LTR多腺苷酸信號。
除了DNA表達所需的調控元件外，在DNA分子中還可包括其它元件。這些其它元件包括增強子。增強子可以是例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸的增強子和病毒增強子，如CMV、RSV和EBV病毒增強子。
調控序列和密碼子通常是與種屬相關的。為了最大量地生產蛋白，選擇在被免疫種屬中有效的調控序列和密碼子。本領域一般技術人員可輕易制備出在給定種屬中有功能的DNA構建物。
本發(fā)明疫苗的DNA構建物可以是如Restifo等，Gene Therapy2000；789-92中所定義的“裸”DNA，該文獻的相關公開內容通過引用結合到本文中。所述DNA優(yōu)選有效整合到載體中?？墒褂玫膫鬟f載體包括生物可降解微膠囊、免疫刺激復合體(ISCOM)或脂質體，以及經遺傳改造的減毒活載體，如病毒或細菌。
適宜的減毒活細菌載體的實例包括鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhi)、志賀氏菌(Shigella)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬、乳桿菌(Lactobacillus)屬、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin(BCG))、大腸桿菌(Escherichia coli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、彎曲桿菌(Campylobacter)屬、李斯特氏菌(Listeria)屬或本領域已知的任何其它合適的細菌載體。載體優(yōu)選為減毒活鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)載體。優(yōu)選的減毒活鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)包括AroA-菌株如SL7207，或者雙減毒AroA-、dam-菌株，如RE88。特別優(yōu)選的載體是雙減毒AroA-、dam-鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)。
用外源DNA構建物轉化活細菌載體的方法在本領域廣為闡述。參閱例如Joseph Sambrook and David W.Russell，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(2001)(Sambrook and Russell)。
優(yōu)選的病毒載體包括噬菌體、皰疹病毒、腺病毒、脊髓灰質炎病毒、牛痘病毒和禽痘病毒。用外源DNA構建物轉化病毒載體的方法在本領域也是廣為闡述。見上述Sambrook and Russell。
有用的脂質體載體是單層或多層囊泡，具有由親脂性物質所形成的膜部分和內部的水相部分。本發(fā)明所使用的水相部分包含有要傳遞至靶細胞的多核苷酸物質。通常，優(yōu)選脂質體形成物質具有一個陽離子基團如季銨基團，以及一個或多個親脂性基團，如具有大約6-30個碳原子的飽和或不飽和烷基。公開號為No.0187702的歐洲專利描述了一組合適的物質，Wolff等的美國專利No.6,228,844進行了進一步的討論，這兩個文獻的相關公開內容通過引用結合到本文中。文獻中還描述了許多其它合適的脂質體形成陽離子脂質化合物。參閱例如L. Stamatatos等.，Biochemistry 1988；273917-3925；和H.Eibl等，Biophysical Chemistry 1979；10261-271。另一方面，也可使用微球體，如丙交酯-乙交酯共聚物生物可降解微球體。為將核酸傳遞到組織中，將核酸構建物用脂質體或微球體包裝或復合，如本領域技術人員已知的。
其它有用的載體包括含生物可降解聚(原酸酯)物質的多聚微球體，如Wang等，Nat.Mater.，2004；3(3)190-6.Epub 2004Feb.15所述，該文獻的相關公開內容通過引用結合到本文中。
本發(fā)明的方法方面包括將DNA疫苗施用于哺乳動物(如人)組織，其中，所述DNA疫苗有效編碼癌癥相關IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物。在某些優(yōu)選實施方案中，DAN疫苗經口服、肌內、鼻內、腹膜內、皮下、皮內或局部施用。DNA疫苗優(yōu)選經口服施用。
在一個優(yōu)選方法中，本發(fā)明的DNA疫苗可在用疫苗治療的患者中提供長期的腫瘤生長抑制。所述DNA疫苗包含有效編碼癌癥相關IAP-家族蛋白(如生存蛋白)和免疫活性基因產物(如細胞因子或NK細胞表面受體配體)的DNA多核苷酸構建物，以及用于其的藥物可接受載體。以足以激發(fā)抗腫瘤細胞的免疫應答的量，將該疫苗給予需要抑制腫瘤生長的哺乳動物。
本發(fā)明疫苗治療的哺乳動物優(yōu)選為人?；加邪┌Y，如肺癌或結腸癌、乳癌或前列腺癌等癌癥的患者可受益于本發(fā)明疫苗的免疫接種。
本發(fā)明的疫苗優(yōu)選與藥物可接受的載體或賦形劑如水、鹽水、葡萄糖、甘油等及其組合一起配制。該疫苗也可以含有助劑，如保濕劑、乳化劑、緩沖劑、防腐劑、佐劑等。
本發(fā)明的疫苗優(yōu)選以藥物可接受載體中的溶液或懸濁液形式經口服給予哺乳動物，如人，其中DNA濃度為約1-10微克/毫升。疫苗的適用劑量因接種患者不同而不同，部分根據(jù)施用或要求施用疫苗的醫(yī)師的判斷而定。
本發(fā)明疫苗可以多劑量或單位劑量形式包裝在適宜的滅菌容器中，例如安瓿、瓶或小瓶中。容器優(yōu)選在裝入疫苗制備物后密封。優(yōu)選將疫苗包裝在貼有標簽的容器中，標簽標注疫苗標識，并附有政府部門如美國食品和藥品管理局所規(guī)定的表明該疫苗得到相關法律許可的通告以及劑量信息等。標簽優(yōu)選包含對給予患者疫苗的衛(wèi)生保健專業(yè)人員來說有用的疫苗信息。包裝優(yōu)選還含有有關疫苗施用、用法說明、適應癥及任何必須警告等印刷信息資料。
人生存蛋白DNA序列及其對應的蛋白序列已由Strausberg報告，在European Bioinformatics Institute，Wellcome Trust GenomeCampus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.BC034148，其公開內容通過引用結合到本文中。鼠TIAP的DNA序列及對應的蛋白序列已由Kobayashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.1999；961457-62報道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.AB01389，其公開內容通過引用結合到本文中。
圖1顯示了編碼人生存蛋白的核酸序列(SEQ ID NO1)，圖2提供了其對應氨基酸殘基序列(SEQ ID NO2)。圖3顯示了編碼鼠生存蛋白(即TIAP)的核酸序列(SEQ ID NO3)，圖4提供了其對應氨基酸殘基序列(SEQ ID NO4)。
圖5顯示了人生存蛋白及其鼠對應物TIAP之間的蛋白同源性。如圖5所示，人生存蛋白(SEQ ID NO2)和鼠TIAP(SEQ ID NO4)之間的氨基酸殘基同源性大約為83％。
Mahotka等鑒別出兩種人生存蛋白剪接變體，命名為生存蛋白-ΔEx3和生存蛋白-2B，它們也適用于本發(fā)明。Mahotka等，Cancer Res.，1999；596097-6102的相關公開內容通過引用結合到本文中。生存蛋白-2B(SEQ ID NO23)和生存蛋白-ΔEx3(SEQ ID NO24)的氨基酸殘基序列示于圖37。Hirohashi等鑒別出生存蛋白-2B的有效T細胞表位，氨基酸殘基序列為AYACNTSTL(SEQ ID NO25)，命名為生存蛋白-2B80-88，其激發(fā)抗生存蛋白-2B的細胞毒性T淋巴細胞應答。Hirohashi等，Clinical Cancer Res.，2002；81731-39的相關公開內容通過引用結合到本文中。該表位是能夠結合MHC I類分子并由細胞毒性T細胞識別的生存蛋白片段，適于用作本發(fā)明疫苗的IAP-家族蛋白組分。
人生存蛋白的另一個剪接變體是Badran等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2004；314(3)902-907描述的生存蛋白-3B變體。編碼生存蛋白-3B的多核苷酸序列及其對應的氨基酸殘基序列報告于EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號No.AB154416，其公開內容通過引用結合到本文中。
全長人livin(稱為α變體)是具有單一BIR結構域并由298個氨基酸殘基組成的IAP-家族蛋白。人livinα變體的DNA序列及對應蛋白序列由Clark等報告，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.NM139317，其公開內容通過引用結合到本文中。人livinβ變體的DNA序列及對應蛋白序列報告于EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號No.NM022161，其公開內容通過引用結合到本文中。
圖39顯示了編碼全長人livin(α變體)的核酸序列(SEQ ID NO26)，圖40提供了其對應氨基酸殘基序列(SEQ ID NO27)。圖41顯示了編碼人livin β變體的核酸序列(SEQ ID NO28)，圖42提供了其對應氨基酸殘基序列(SEQ ID NO29)。人livinβ變體沒有全長人livinα剪接變體(SEQ ID NO27)的氨基酸殘基216-233。人livin的β變體和α變體在所有其它方面都相同。人livin的α和β變體的BIR結構域都是在SEQ ID NO27和SEQ ID NO29的氨基酸殘基R90至氨基酸殘基L155的區(qū)域中。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明疫苗包含編碼一種或多種生存蛋白(例如人生存蛋白、TIAP(鼠生存蛋白))及其免疫原性同源物的DNA構建物。所述免疫原性同源物優(yōu)選與人生存蛋白具有至少約80％的氨基酸殘基序列一致性，更優(yōu)選與SEQ ID NO2具有至少約90％的氨基酸殘基序列一致性，最優(yōu)選與SEQ ID NO2具有至少約95％的氨基酸殘基序列一致性。另一方面，該疫苗可包含編碼一個或多個人生存蛋白T細胞表位的DNA構建物。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明疫苗包含編碼一種或多種livin蛋白(例如人livinα和β剪接變體(分別為SEQ ID NO27和29))及其免疫原性同源物的DNA構建物。所述免疫原性同源物優(yōu)選與人livinα和β剪接變體具有至少約80％的氨基酸殘基序列一致性，更優(yōu)選與SEQ ID NO27或SEQ ID NO29具有至少約90％的氨基酸殘基序列一致性，最優(yōu)選與SEQ ID NO27或SEQ ID NO29具有至少約95％的氨基酸殘基序列一致性。另一方面，該疫苗可包含編碼一個或多個人livin蛋白T細胞表位的DNA構建物。
由于遺傳密碼固有的簡并性，編碼與天然(即天然存在的)癌癥相關IAP-家族蛋白(如人生存蛋白、鼠生存蛋白和人livin剪接變體)基本相同或功能等同的氨基酸殘基序列的DNA序列，也可用于本發(fā)明疫苗。此類DNA序列包括能夠與天然生存蛋白或livin DNA序列以及等位基因變體等雜交的序列。功能等同同源物的DNA優(yōu)選與編碼前述天然生存蛋白或livin蛋白的DNA具有至少約70％的核苷酸序列一致性，更優(yōu)選具有至少約80％的核苷酸序列一致性。
由本發(fā)明疫苗的DNA構建物編碼的免疫活性基因產物優(yōu)選為細胞因子或天然殺傷細胞表面受體的配體。特別優(yōu)選的細胞因子是CC趨化因子。特別有用的CC趨化因子是CCR7趨化因子受體的配體。選擇性CCR7配體包括CCL19(也稱為exodus-3、ELC、MIP-3β和CKβ11)和CCL21(也稱為exodus-2、SLC、6CKine、TCA4和CKβ9)。特別優(yōu)選的趨化因子是人CCL21及其鼠對應物6CKine/SLC(muCCL21)以及與其大致相當?shù)内吇蜃印?br> 人SLC的DNA和蛋白序列由Nishimura等報告，在EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.AB002409，其公開內容通過引用結合到本文中。6CKine/SLC的鼠CCL21a變體的DNA和蛋白序列由Hromas等，J Immunol.1997；159(6)2554-2558報道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.NM011335，其公開內容通過引用結合到本文中。6CKine/SLC的鼠CCL21b變體的DNA和蛋白序列由Hedrick等，J. Immunol.1997；159(4)1589-1593報道，在EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.NM011124，其公開內容通過引用結合到本文中。
圖6顯示了編碼人CCL21(SLC)的核酸序列(SEQ ID NO5)，圖7提供了其對應氨基酸殘基序列(SEQ ID NO6)。圖8顯示了編碼鼠CCL21(CCL21b變體)的核酸序列(SEQ ID NO7)，圖9提供了其對應氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
圖10顯示了人CCL21(SLC)與其鼠對應物(鼠6CKine/SLC，CCL21b)之間的蛋白同源性。如圖10所示，人CCL21(SEQ ID NO6)和鼠CCL21(SEQ ID NO8)之間的氨基酸殘基序列一致性約為73％。
圖25顯示了編碼鼠SLC的CCL21a變體的核酸序列(SEQ IDNO11)，圖26提供了其對應氨基酸序列(SEQ ID NO12)。
優(yōu)選的天然殺傷細胞表面受體的配體是鼠NKG2D表面受體的配體。優(yōu)選的NKG2D表面受體配體是MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3等。最優(yōu)選MICA和MICB。其它已知的NKG2D表面受體配體包括鼠Rea-1β和鼠次要組織相容性抗原肽H60。
鼠H60次要組織相容性抗原肽的DNA和蛋白序列由Malarkannan等，J. Immunol.1998；161(7)3501-3509報道，在EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.AF084643，其公開內容通過引用結合到本文中。圖11顯示了編碼鼠H60次要組織相容性抗原肽的部分核酸序列(SEQ ID NO9)，圖12提供了其對應的部分氨基酸殘基序列(SEQ ID NO10)。
人MICA的DNA和蛋白序列由Zwirner等報道，在EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.AY204547，其公開內容通過引用結合到本文中。圖27顯示了編碼人MICA的核酸序列(SEQ ID NO13)，圖28提供了其對應氨基酸殘基序列(SEQ ID NO14)。
人MICB的DNA和蛋白序列由Bahram等，Immunogenetics 1996；45(2)161-162報道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.U65416，其公開內容通過引用結合到本文中。圖29顯示了編碼人MICB的核酸序列(SEQ ID NO15)，圖30提供了其對應氨基酸殘基序列(SEQ ID NO16)。MICB的等位基因變體描述于GENBANK檢索號No.NP005922，其通過引用結合到本文中。圖38是檢索號No.NP005922的GENBANK條目副本。
人ULBP1的DNA和蛋白序列由Cosman等，Immunity 2001；14(2)123-133報道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.AF304377，其公開內容通過引用結合到本文中。圖31顯示了編碼人ULBP1的核酸序列(SEQ ID NO17)，圖32提供了其對應氨基酸殘基序列(SEQ ID NO18)。
人ULBP2的DNA和蛋白序列由Cosman等，Immunity 2001；14(2)123-133報道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.AF304378，其公開內容通過引用結合到本文中。圖33顯示了編碼人ULBP2的核酸序列(SEQ ID NO19)，圖34提供了其對應氨基酸殘基序列(SEQ ID NO20)。
人ULBP3的DNA和蛋白序列由Cosman等，Immunity 2001；14(2)123-133報道，在European Bioinformatics Institute，WellcomeTrust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK的EMBL數(shù)據(jù)庫中，DNA檢索號為No.AF304379，其公開內容通過引用結合到本文中。圖35顯示了編碼人ULBP3的核酸序列(SEQ ID NO21)，圖36提供了其對應氨基酸殘基序列(SEQ ID NO22)。
特別優(yōu)選的天然殺傷細胞表面受體配體包括NKG2D受體配體，例如MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3及其功能等同物。所述功能等同物優(yōu)選與前述免疫調節(jié)多肽具有至少約80％的氨基酸殘基序列一致性，更優(yōu)選具有至少約90％的氨基酸殘基序列一致性，最優(yōu)選具有至少約95％的氨基酸殘基序列一致性。
由于遺傳密碼固有的簡并性，編碼與有用的天然免疫活性基因產物(如人CCL21、鼠CCL21、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3及與其大致相當?shù)念愃莆镔|)基本相同或功能等同的氨基酸殘基序列的DNA序列，也可用于本發(fā)明疫苗。此類DNA序列包括能夠與免疫調節(jié)多肽DNA序列以及等位基因變體等雜交的序列。功能等同同源物的DNA優(yōu)選與編碼前述天然免疫調節(jié)多肽的DNA具有至少約70％的核苷酸序列一致性。
可用于本發(fā)明的改變的DNA序列包括在編碼野生型癌癥相關IAP-家族蛋白的天然多核苷酸序列中不同核苷酸殘基的缺失、添加或置換，獲得編碼野生型蛋白或其免疫原性同源物的序列。可用于本發(fā)明的改變的DNA序列還可包括在編碼野生型免疫原性基因產物的天然多核苷酸中不同核苷酸殘基的缺失、添加或置換，獲得編碼免疫活性基因產物或其功能等同物的序列。功能等同的免疫活性基因產物可在野生型細胞因子或NK細胞表面受體配體中包含導致沉默改變的氨基酸殘基的缺失、添加或置換，由此產生功能等同分子。此類氨基酸置換(例如保守置換)可以所涉及殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或兩親性特性方面的相似性為基礎進行。例如，帶負電氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；其不帶電極性頭部基團親水值相似的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
本文使用的功能等同的免疫活性基因產物，例如細胞因子或NK細胞表面受體配體，是指與其對應天然免疫活性基因產物具有大致相同的免疫調節(jié)活性的多肽。
用于本發(fā)明疫苗的有效編碼IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物的DNA序列可進行基因工程改造，以改變編碼序列來用于各種目的，包括但不限于改變以修飾基因產物的加工和表達。例如，可使用本領域眾所周知的技術如定點誘變來導入突變，以插入新的限制性位點、改變糖基化模式、磷酸化等。
本發(fā)明的另一個方面是接種哺乳動物抗癌癥的方法。該方法包括以足以激發(fā)抗癌癥細胞的免疫應答的量，給予哺乳動物本發(fā)明疫苗，如本文所述。優(yōu)選哺乳動物為人。
在另一方面，本發(fā)明還包括用載體轉染的轉化宿主細胞，所述載體包含有效編碼凋亡抑制家族蛋白和免疫活性基因產物的DNA構建物，如本文所述。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。
本發(fā)明還提供含有效編碼凋亡抑制家族蛋白和免疫活性基因產物的DNA構建物的分離質粒載體。該載體用于轉染宿主細胞，例如減毒細菌細胞，以制備本發(fā)明疫苗。
提供以下的實施例是為了進一步闡述本發(fā)明的特征和實施方案，沒有限制意義。
材料、方法和實施例材料。C57/BL/6J和Balb/C小鼠來自Scripps Research Institute飼養(yǎng)場。編碼TIAP(生存蛋白的鼠形式)的DNA通過PCR由MC3PcDNA克隆。編碼鼠6Ckine(鼠CCL21)的DNA由脾細胞克隆。編碼H60次要組織相容性抗原肽(MICA和MICB的鼠形式)的DNA由University of California(Berkley)的Dr.David H.Ranlet惠贈。對于MuCCL21使用限制位點HindIII和BamHI，對于鼠生存蛋白兩端使用XhoI，將編碼鼠CCL21(muCCL21，也稱為6Ckine/SLC)和鼠生存蛋白(也稱為TIAP)的疫苗DNA克隆入Invitrogen，Inc.的pBudCE4.1真核表達載體中。對于H60使用限制位點HindIII和XbaI，對于鼠生存蛋白使用限制位點KpnI和XhoI，將編碼H60和TIAP的DNA克隆入Invitrogen，Inc.的pBudCE4.1真核表達載體中。鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)AroA-減毒菌株(SL2707)和鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)雙減毒AroA-、dam-菌株(RE88)得自Remedyne，Santa Barbara，CA。抗體得自BD Biosciences，Bedford，MA。異硫氰酸熒光素(FITC)和R-藻紅蛋白(PE)得自Molecular Probes，Eugene，OR。FITC標記抗體和PE標記抗體根據(jù)廠家推薦方法制備。
A.得自轉化的AroA-減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)的疫苗實施例1.編碼鼠生存蛋白和muCCL21的DNA疫苗的制備用Bio-Rad脈沖發(fā)生器，按照廠家推薦的方法，在2.5kV、25μF和200Ω下將含鼠生存蛋白和muCCL21 DNA的pBudCE4.1載體(約1-10μg pDNA)電穿孔入到新制備的減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)(SL2707)中。在含有Zeocin的平板上選擇含有載體的沙門氏桿菌(Salmonella)。第二天挑出菌落并在添加Zeocin的LB培養(yǎng)液(EM Science，Gibbstown，NJ)中培養(yǎng)過夜。分離細菌并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗。然后以約1×109個重組沙門氏桿菌(Salmonella)/ml PBS的濃度，將漂洗過的細菌懸浮在PBS培養(yǎng)基中，以形成之后要使用的疫苗溶液。
另外，按照同樣步驟，制備對照疫苗，包括用僅有載體、僅整合鼠生存蛋白DNA的載體、僅整合muCCL21DNA的載體轉化的沙門氏桿菌(Salmonella)。圖13提供了展示表達構建物的圖。
在使用前，將疫苗保存在密封安瓿中。質粒DNA在轉化沙門氏桿菌(Salmonella)之前保存于約-80℃。
實施例2.用實施例1的DNA疫苗免疫接種小鼠用實施例1的DNA疫苗(約1×108個重組沙門氏桿菌的約100μlPBS溶液)經口管飼接種Balb/C小鼠(每個處理組約8只小鼠)，每兩周接種一次，共三次。
實施例3.評價接種小鼠對腫瘤的抗性最后一次接種后約1周，用約1×105個D121Lewis肺癌細胞(皮下)攻擊實施例2的Balb/C小鼠(每個處理組約8只小鼠)。生長約2周，以使腫瘤自發(fā)彌散至肺，此后經手術去除皮下Lewis肺癌腫瘤。每隔一天測量皮下腫瘤生長的長度和寬度，并根據(jù)下式計算每個腫瘤的腫瘤體積體積＝(寬度2)(長度÷2)。去除皮下原發(fā)腫瘤后約24至約28天，評價肺部D121自發(fā)轉移瘤的數(shù)量。將小鼠殺死后解剖，根據(jù)腫瘤所覆蓋的肺表面積百分比評價肺部腫瘤負荷，無腫瘤記為“0”；腫瘤覆蓋約小于20％記為“1”；腫瘤覆蓋約20％至約30％記為“2”；腫瘤覆蓋約大于50％記為“3”。
表1提供了實施例1疫苗接種小鼠的腫瘤負荷記分。圖14顯示了實施例1疫苗接種小鼠的肺部圖片。表1和圖14報告了腫瘤體積。在圖14中，條A表示用本發(fā)明的鼠生存蛋白/muCCL21疫苗接種小鼠的平均肺部腫瘤體積(mm3)；條B表示僅整合鼠生存蛋白DNA的疫苗接種小鼠的平均腫瘤體積；條C表示僅整合muCCL21 DNA的疫苗接種小鼠的平均腫瘤體積；條D表示僅整合空載體的疫苗接種小鼠的平均腫瘤體積；而條E表示用PBS緩沖液接種小鼠的平均腫瘤體積。圖14還包括展示每個處理組的代表性切除肺的圖片，每張圖分別示于圖14其各自條的下方。
表1.D121 Lewis肺癌細胞攻擊的Balb/C小鼠的轉移瘤
表1和圖14(圖A和圖B)提供的結果證明，含編碼IAP-家族蛋白(即鼠生存蛋白)和免疫活性基因產物(即muCCL21)的DNA構建物的DNA疫苗可有效免疫小鼠抗肺轉移瘤，并抑制肺部腫瘤生長。
實施例4.由本發(fā)明DNA疫苗誘導的抗D121肺癌細胞的T細胞介導細胞毒性如實施例2所述，用實施例1的DNA疫苗接種C5/7BL/6J小鼠(每個處理組約8只小鼠)。接種后約4天分離脾細胞，如CurrentProtocols in Immunology的3.11.4，Coligan等編輯，John Wiley & Sons，Inc.(1994)所述，用4小時51Cr-釋放法分析其裂解活性。D121細胞用作脾細胞的靶細胞。
圖15圖示由本發(fā)明DNA疫苗誘導的抗D121肺癌細胞的T細胞介導細胞毒性?？招膱A圈代表的數(shù)據(jù)點表示得自抑制實驗的數(shù)據(jù)，其中細胞用50μg/ml抗H-2Kb/H-2DbMHC I類抗原的抗體(克隆SF1-1.1；34-2-12IgG2a，κ)處理，實心黑色方塊代表沒有抑制性抗體的數(shù)據(jù)。對每個接種組，將腫瘤細胞裂解百分率(Y軸)對三個不同的效應細胞/靶細胞(E/T)比率作圖(即第一個數(shù)據(jù)點為100∶1的E/T；第二個數(shù)據(jù)點為50∶1；第三個數(shù)據(jù)點為25∶1)。結果表明，本發(fā)明的鼠生存蛋白/muCCL21疫苗(標記為SLC/TIAP)相比于含PBS、空載體和muCCL21DNA的對照疫苗，在100∶1E/T比率時誘導的裂解幾乎增加了5倍，相比于僅含鼠生存蛋白DNA的對照疫苗，增加了約2倍。
實施例5.接種疫苗小鼠脾細胞(CD8+T細胞)中CD25、CD69和CD28活化標記物的上調如實施例2所述，用實施例1的DNA疫苗接種C5/7BL/6J小鼠(每個處理組約4只小鼠)。最后一次接種后約1周從免疫小鼠和對照小鼠組中分離脾細胞。然后用FITC-偶聯(lián)的CD8+抗體和PE-偶聯(lián)的CD25、CD69和CD28抗體對細胞進行染色。用雙色流式細胞儀BectonDickenson FAC scan評測細胞懸液，以確定每種脾細胞中CD25、CD28和CD69呈陽性的CD8+T細胞的百分比。圖16列出了結果。每張FACS圖右上象限的數(shù)值表示同時提呈CD8+抗原以及CD25、CD28或CD69(具體視情況而定)的細胞百分率。數(shù)值結果示于表2。這些結果表明使用本發(fā)明疫苗使T細胞標記物表達增加，這表示T細胞活化增強。
表2.接種小鼠脾細胞中CD25、CD69和CD28活化標記物的上調
表2和圖16的數(shù)據(jù)證實，實施例1的含編碼鼠生存蛋白和muCCL21的DNA構建物的本發(fā)明疫苗，使T細胞活化分子表達上調。
實施例6.接種疫苗小鼠中樹突狀細胞上共刺激分子的表達增強如實施例2所述，用實施例1的DNA疫苗接種C5/7BL/6J小鼠(每個處理組約4只小鼠)。最后一次接種后約1周從免疫小鼠和對照小鼠組中分離脾細胞。然后用FITC-偶聯(lián)的CD11c抗體聯(lián)合共刺激分子B7(CD80)、ICAM-1和DEC205的PE-偶聯(lián)抗體對細胞進行染色。用雙色流式細胞儀Becton Dickenson FAC scan評測細胞懸液。圖17圖示了細胞的平均熒光值，結果顯示與對照疫苗相比，分離自本發(fā)明鼠生存蛋白/muCCL21疫苗接種小鼠脾細胞的ICAM-1(頂部)、CD80(中部)和DEC205(底部)的表達增加。
實施例7.胞內細胞因子釋放的誘導如實施例3所述，用D121肺癌細胞攻擊如實施例2所述免疫的小鼠(每組8只小鼠)。腫瘤細胞攻擊后約1周，由每只小鼠收集脾細胞。用FITC-抗CD3抗體染色脾細胞，然后固定化、透化，隨后用PE偶聯(lián)的抗IFN-γ抗體染色。用FACS流式細胞儀分析雙色染色細胞。結果示于圖18。使用BD Pharmingen，La Jolla，CA的胞內染色StarterKit固定細胞。
圖示于圖18的結果表明，對于分離自本發(fā)明疫苗接種小鼠的脾細胞，釋放細胞因子IFN-γ的細胞百分率增加至約3.17％，相比之下，接受PBS對照疫苗小鼠僅有0.41％，接受空載體對照疫苗的小鼠約為0.38％，接受SLC對照疫苗的小鼠約為0.96％，而接受鼠生存蛋白對照疫苗的小鼠約為1.53％。
實施例8.疫苗接種小鼠中肺癌細胞的凋亡增加如實施例3所述，用D121肺癌細胞攻擊如實施例2所述免疫的小鼠(每組8只小鼠)。腫瘤細胞攻擊后約1周，由每只小鼠收集脾細胞。將脾細胞和D121腫瘤細胞在約37℃的溫度溫育約3小時。然后通過FCAS分離和分析細胞。使用Annexin V-FITC定量群體中能夠進行凋亡的細胞的百分率。使用BD Pharmingen，La Jolla，CA的凋亡檢測試劑盒，使用碘化丙錠(PI)區(qū)分存活和非存活的細胞。
圖19圖示了約3小時后(圖頂部)和約24小時后(圖底部)評價的FACS分析結果。每張圖右下象限的數(shù)字表示每個處理組進行凋亡的細胞的百分率。3小時后，約5.39％的完整D121細胞(即未接觸脾細胞)凋亡。在與僅含PBS緩沖液的對照疫苗接種小鼠的脾細胞溫育的D121細胞中，約有2.28％凋亡。在與含空載體DNA的對照疫苗接種小鼠的脾細胞溫育的D121細胞中，僅有約5.19％凋亡。以類似的方式，D121細胞在與僅含muCCL21 DNA的對照疫苗接種小鼠的脾細胞溫育時約有5.15％凋亡；而D121細胞與僅含鼠生存蛋白DNA的對照疫苗接種小鼠的脾細胞溫育時約有11.46％凋亡。令人驚奇的是，D121細胞與同時含muCCL21和鼠生存蛋白DNA的本發(fā)明疫苗接種小鼠的脾細胞溫育時，3小時后約有18.44％凋亡。
同樣，在選通FACS分析(選通凋亡細胞)中，24小時后沒有完整的D121細胞(即未接觸脾細胞)經歷凋亡。在與僅含PBS緩沖液的對照疫苗接種小鼠的脾細胞溫育的D121細胞中，約有8.46％凋亡。在與含空載體DNA的對照疫苗接種小鼠的脾細胞溫育的D121細胞中，僅有約4.78％凋亡。令人驚奇的是，D121細胞與同時含muCCL21和鼠生存蛋白DNA的本發(fā)明疫苗接種小鼠的脾細胞溫育時，24小時后約有59.2％凋亡。
實施例9.制備編碼TIAP和鼠H60次要組織相容性抗原肽的DNA疫苗用Bio-Rad脈沖發(fā)生器，按照廠家推薦的方法，在2.5kV、25μF和200Ω下將含TIAP和鼠H60次要組織相容性抗原DNA的pBudCE4.1載體(約1μg pDNA)電穿孔入新制備的減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)(SL2707)中。圖20提供了H60和鼠生存蛋白整合入載體的表達載體圖。
在含有Zeocin的平板上選擇含有載體的沙門氏桿菌(Salmonella)。第二天挑出菌落并在添加Zeocin的LB培養(yǎng)液(EMScience，Gibbstown，NJ)中培養(yǎng)過夜。分離細菌并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗。然后以約5×109個重組沙門氏桿菌(Salmonella)/ml PBS的濃度，將漂洗過的細菌懸浮在PBS培養(yǎng)基中，以形成之后要使用的疫苗溶液。
另外，按照同樣步驟，制備對照疫苗，包括用僅有載體、僅整合鼠生存蛋白DNA的載體和僅整合鼠H60次要組織相容性抗原(H60)DNA的載體轉化的沙門氏桿菌(Salmonella)。
在使用前，將疫苗保存在密封安瓿中。質粒DNA在轉化沙門氏桿菌(Salmonella)之前保存在約-20℃。
實施例10.用實施例9的DNA疫苗免疫接種小鼠用實施例9的DNA疫苗(約5×108個重組沙門氏桿菌(Salmonella)的約100μl PBS溶液)經口管飼接種Balb/C小鼠(每個處理組約8只小鼠)，每兩周接種一次，共三次。
實施例11.分離自實施例10的DNA疫苗接種小鼠的脾細胞的細胞毒性測定由實施例10的接種小鼠分離脾細胞，用照射過的CT-26細胞刺激。5天后，收獲脾細胞，以CT-26細胞和Yac-1細胞(NK敏感性T細胞)為靶進行細胞毒性測定。如Current Protocols in Immunology的3.11.4，Coligan等編輯，John Wiley & Sons，Inc.(1994)所述，以4小時51Cr-釋放實驗，測定E/T比率為25∶1、50∶1和100∶1時的細胞特異性裂解程度。結果圖示于圖21。
結果表明，相比于由用空載體、H60和鼠生存蛋白對照疫苗接種小鼠分離的脾細胞，含鼠生存蛋白和H60DNA的本發(fā)明疫苗接種小鼠的脾細胞在100∶1E/T比率時裂解的CT-26結直腸癌細胞增加了2倍或2倍以上。所有疫苗在所有E/T比率下觀測到的Yac-1裂解都非常少，表明觀測到的殺傷可能由T細胞介導。
實施例12.評價接種小鼠對腫瘤的抗性第三次接種后約2周，用約1×105個CT-26結直腸癌細胞(靜脈；i.v.)攻擊實施例10的Balb/C小鼠(每個處理組約8只小鼠)。
用CT-26細胞i.v.攻擊后約25天，評價肺部CT-26細胞自發(fā)轉移瘤的量。將小鼠殺死后解剖，通過記錄各組的肺平均重量，評價肺部腫瘤負荷。正常肺重量為約0.2克。圖22展示了由接種的CT-26攻擊小鼠中取出的典型肺臟(頂部)。圖22還包括各個處理組平均肺重量的圖解(底部)。與對照疫苗相比，觀察到本發(fā)明H60/鼠生存蛋白疫苗接種小鼠的腫瘤負荷顯著縮小。
圖23包括26天后各個處理組小鼠存活百分率的圖解。與對照疫苗相比，觀察到本發(fā)明H60/鼠生存蛋白疫苗接種小鼠的存活明顯增加。
實施例13.評價H60和鼠生存蛋白在293T細胞中的表達圖24A圖解了H60的表達。用空載體(V)或pH60(H)轉染293T細胞24小時，收獲，并用NKG2D四聚體染色，用流式細胞儀進行分析。根據(jù)pGFP(綠色熒光蛋白)轉染的評測，轉染效率約為45％。圖24B圖解了鼠生存蛋白的表達。用空載體或鼠生存蛋白轉染293T細胞24小時，收獲，裂解，用蛋白質印跡進行分析。蛋白質印跡分析表明，鼠生存蛋白在轉染細胞中可檢出，但在天然細胞中不能檢出。
B.得自轉化的AroA-、dam-雙減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)的疫苗實施例14.編碼鼠生存蛋白和muCCL21的DNA疫苗的制備使用1μg分別提取自D121小鼠Lewis肺癌細胞和活化小鼠脾細胞的總RNA，通過反轉錄-聚合酶鏈反應擴增鼠生存蛋白和鼠CCL21(muCCL21)的全長編碼區(qū)。總RNA用RNEASY Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA)提取，用鉑定量RT-PCR Thermoscript One-Step系統(tǒng)(Gibco/BRL)按照生產商的說明進行RT-PCR。使用設計用于使單個質粒的兩種基因獨立在哺乳動物表達載體中表達的PCR產物，基于pBudCEA.1載體(Invitrogen)制備幾種構建物。第一種構建物是包含全長鼠生存蛋白和鼠CCL21的鼠生存蛋白/muCCL21，將其插入到限制位點HindIII和BamHI之間的多克隆位點A中。通過將基因分別插入到限制位點XhoI和NotI之間的多克隆位點B中，產生趨化因子muCCL21。其它用于DNA接種的載體是基于第一種構建物，而不是基于muCCL21或鼠生存蛋白的缺失。制備空載體作為對照。
將質粒轉染入COS-7細胞中，之后分別使用抗生存蛋白和抗CCL21抗體對細胞裂解物進行蛋白質印跡，來證實鼠生存蛋白和muCCL21的蛋白質表達。經口給予108個用pEGFP轉化的鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)(AroA-、dam-菌株RE88)后，在C57BL/6J小鼠的淋巴集結中檢測到EGFP活性的表達。在8、16和36小時的時間點處死小鼠，取出新鮮的小腸樣本，用PBS徹底清洗后進行分析。用共聚焦顯微鏡檢測EGFP的熒光表達。
通過對比雙減毒AroA-、dam-菌株RE88和單減毒AroA-菌株SL2707，評價減毒細菌可能在宿主中產生的毒性。使用RE88菌株使全部16只小鼠都存活，無任何明顯的毒副作用，而SL2707菌株免疫的16只小鼠中有2只死于毒性和感染。因此，RE88菌株的dam-突變可控制細菌毒力，明顯使該菌株成為特別有用的DNA疫苗載體。
實施例15.用實施例14的疫苗口服接種小鼠和腫瘤攻擊小鼠將C57BL/6J小鼠分為5個小組，用含約1×108個雙減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(S.typhimurium)(RE88)的約100μl PBS連同PBS治療組，以2周間隔經口管飼對這些小鼠進行免疫接種三次，其中所述RE88具有以下載體空載體pBUd；pBUd-鼠生存蛋白/muCCL21、pBUd-鼠生存蛋白或pBUd-muCCL21的單獨表達載體。在最后一次免疫后約1周，通過i.v.注射約1×105個D121鼠Lewis肺癌細胞攻擊預防治療的所有小鼠。在治療模式中，首先給小鼠i.v.注射約1×105個D121鼠Lewis肺癌細胞，1周后用轉化的鼠傷寒沙門氏桿菌(S.typhimurium)進行3次接種。每天檢查小鼠，在預防模式中腫瘤細胞攻擊后約28天或在治療模式中于初次腫瘤細胞接種后63天，處死小鼠并檢查肺轉移瘤。
表3顯示了分別用PBS、空載體、CCL21、生存蛋白或CCL21/生存蛋白疫苗免疫接種以進行疫苗預防治療后的轉移瘤分數(shù)。表3中結果顯示為腫瘤轉移記分，表示融合轉移瘤灶覆蓋肺表面積的百分比0＝沒有；1＝小于5％；2＝5-50％；3＝大于50％。CCL21/生存蛋白疫苗治療的小鼠組和所有對照組之間的轉移瘤記分差異是統(tǒng)計學顯著的(P＝＜0.001)。在此治療模式中還觀測到腫瘤生長受到抑制。
表3.接種后用D121 Lewis肺癌細胞攻擊的BalB/C小鼠的轉移瘤
在此預防模式中，我們觀察到，在以2周間隔接種3次接著1周后i.v.注射腫瘤細胞攻擊的小鼠中，D121鼠Lewis肺癌的彌散性肺轉移瘤受到明確抑制。實際上，8只小鼠中有6只完全排斥了所有的肺轉移瘤，而其余小鼠表現(xiàn)出對轉移瘤的抑制顯著增強(參見表3)。相反，基于生存蛋白而沒有muCCL21的DNA疫苗僅在8只小鼠的1只中誘導出對轉移瘤的完全抑制，2只小鼠轉移瘤生長低于5％，而其余所有小鼠都表現(xiàn)出大范圍的轉移瘤生長。僅用PBS或空載體對照接種治療的其它小鼠根本沒有表現(xiàn)出腫瘤防護，在腫瘤細胞攻擊后的4周內由于大范圍的轉移瘤而死亡。盡管用僅攜帶分泌性muCCL21質粒的雙減毒沙門氏桿菌(Salmonella)免疫接種沒有明顯抑制腫瘤轉移，但與對照相比仍使轉移統(tǒng)計學顯著地延遲。
重要之處在于，在治療模式中，在所有實驗動物中，基于鼠生存蛋白/muCCL21的DNA疫苗也能明顯有效地抑制已經完全確立的肺轉移瘤生長。相反，所有僅接受基于自身鼠生存蛋白或muCCL21的疫苗或空載體和PBS對照的小鼠，在該實驗模式中表現(xiàn)為D121非小細胞肺癌大范圍彌散性肺轉移瘤。治療模式的各個實驗組的肺重量列于表4。正常肺重量約為0.3g。
表4.D121 Lewis肺癌細胞預攻擊的Balb/C小鼠的轉移瘤-肺重量
實施例16.測定實施例15的疫苗接種小鼠的抗血管生成反應最后一次免疫后兩周，將含約400ng/ml鼠FGF-2(Pepro Tech，Rocky Hill，NJ)和以1000Gy照射過的D121腫瘤細胞(1×104/ml)的約500ml減少生長因子的Matrigel(BD Biosciences)皮下(s.c.)注射到小鼠的胸骨區(qū)。6天后，通過將200ml 0.1mg/ml熒光西非單葉豆(Bandeiraea simplicifolia)凝集素I-同工凝集素B4(Vector Laboratories，Burlingame，CA.)注射到側尾靜脈中，染色除2只對照動物之外的所有小鼠的內皮組織；約30分鐘后，處死小鼠，取出Matrigel栓(plug)，目視評價。然后將凝集素-FITC由100ml各栓提取到500ml RIPA裂解液中，用熒光測定法于490nm定量。每個測定都要扣除2只未注射對照小鼠中產生的本底熒光。
基于鼠生存蛋白/muCCL21的疫苗明確抑制腫瘤脈管系統(tǒng)的血管生成。據(jù)Matrigel實驗和用FITC綴合凝集素體內染色小鼠內皮后檢測的相對熒光定量所示，觀測到腫瘤新血管生成顯著下降。在檢測皮下注射FITC綴合凝集素后6天取出的代表性Matrigel凝固物時，肉眼觀察到鼠生存蛋白/muCCL21疫苗處理組和對照組之間在腫瘤血管生成方面存在明顯差異。本發(fā)明疫苗接種小鼠表現(xiàn)出明顯少于對照組的腫瘤血管生成。
實施例17.細胞毒性實驗由成功接種的小鼠在腫瘤細胞攻擊后5天分離脾細胞。用標準51Cr-釋放實驗評測對靶細胞(D121腫瘤細胞或過表達生存蛋白的鼠內皮細胞)的細胞毒性。為測定特異性MHC I類限制性細胞毒性，用10μg/ml抗小鼠MHC I類H-2Kb/Db抗體(PharMingen，San Diego，CA)進行抑制評價。
51Cr-釋放實驗表明，由接種并隨后用D121 Lewis肺癌細胞攻擊的小鼠獲得的特異性CD8+T細胞誘導顯著的細胞毒性。分離自用自身鼠生存蛋白/muCCL21或鼠生存蛋白疫苗免疫小鼠脾細胞的CD8+T細胞分別有效裂解50％和30％的D121腫瘤細胞。相反，分離自對照小鼠的CD8+T細胞沒有引起任何明顯的腫瘤細胞殺傷作用，因為它們僅顯示出本底細胞毒性活性。所觀測到的CD8+T細胞介導的細胞毒性表征為MHC I類抗原限制性，因為加入抗-H2Kb/H2Db抗體可完全消除細胞毒性。
實施例18.流式細胞儀分析和細胞因子釋放實驗用BD Biosciences FACScan，通過2或3色流式細胞儀分析測定T細胞活化標記物以及CD11c和MHCII類抗原陽性DC上共刺激分子的表達。通過用FITC標記的抗CD-3e抗體聯(lián)合PE-偶聯(lián)的抗CD-25、CD28或CD69抗體染色剛分離自成功接種小鼠的脾細胞，測定T細胞活化。用FITC標記的抗CD11c抗體和生物素化抗IAb抗體、接著用鏈霉抗生物素蛋白-別藻藍蛋白，聯(lián)合PE-偶聯(lián)的抗-ICAM-1、CD80或DEC205抗體，檢測APC上共刺激分子的活化。所有的流式細胞儀實驗都在0.1μg/ml碘化丙錠存在下進行，以排除死細胞。用于這些實驗的所有試劑都得自BD Pharmingen(La Jolla，CA)。
使用流式細胞儀檢測胞內細胞因子。為此，在D121腫瘤細胞攻擊后約2周收集B57BL/6J小鼠的脾細胞，在完全T細胞培養(yǎng)基中與如前所述照射過的D121細胞一起培養(yǎng)約24小時。將預溫育的細胞與約1mg純化2.4G2抗體(BD Pharmingen)混合，以封閉非特異性染色。漂洗細胞，然后用0.5mg FITC綴合的抗CD3+抗體染色。漂洗兩次后，固定細胞，用1mg/ml PE綴合的抗IL-2抗體或抗IFN-g抗體染色，以進行流式細胞儀分析。所有抗體都得自BD Pharmingen(LaJolla，CA)。
僅有自身的鼠生存蛋白/muCCL21疫苗最有效地明顯上調CD25、CD28和CD69T細胞活化標記物的表達。CD28上調特別重要，因為已知其與DC上B7共刺激分子的相互作用是原初T細胞和抗原提呈DC之間實現(xiàn)關鍵復雜的相互作用所必需的。相反，僅編碼自身鼠生存蛋白或muCCL21的DNA疫苗只將T細胞活化標記物的表達增加了1倍。鼠生存蛋白/muCCL21疫苗同時活化CD4+和CD8+T細胞還表現(xiàn)于胞內促炎細胞因子IFN-g和IL-2的明顯增加。相比之下，發(fā)現(xiàn)PBS和空載體對照以及僅編碼鼠生存蛋白或muCCL21的DNA疫苗對誘導這些細胞因子明顯效果較小。
基于鼠生存蛋白/muCCL21的DNA疫苗實現(xiàn)了DC上ICAM-1、CD80和DEC205的表達上調，這是非常重要的，因為眾所周知T細胞活化關鍵取決于與DC上表達的這些共刺激分子的細胞-細胞強相互作用，以達到和T細胞受體的最佳連接。再者，用攜帶編碼鼠生存蛋白/muCCL21的真核質粒的雙減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)免疫接種最有效地誘導這些活化標記物上調，比對照高2-3倍。
實施例19.腫瘤細胞凋亡分析分別在接種后約3小時和約24小時檢測由接種誘導的D121腫瘤細胞凋亡。對照和實驗小鼠都在3次免疫的最后一次之后1周用約1×105個D121細胞i.v.攻擊。腫瘤細胞攻擊后1周收集各個小鼠的脾細胞，此后將約2.5×107個脾細胞與約5×105個D121細胞在6孔培養(yǎng)板中共培養(yǎng)4小時。使用ANNEXINV-FITC凋亡檢測試劑盒II(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)確認凋亡的早期階段。為檢驗后期腫瘤細胞凋亡，將約5×105個D121細胞和約2.5×107個脾細胞共培養(yǎng)約24小時，然后用APO-DIRECTTM試劑盒(BDBiosciences Phramingen，San Diego，CA)，按照生產商的說明，以TUNEL實驗通過FACS分析凋亡。
早在3小時就觀察到凋亡，24小時后，如Annexin V或TUNEL實驗所獲的流式細胞儀分析數(shù)據(jù)所示，凋亡明顯地進一步增加。因此，在由這些小鼠收集的脾細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)后，鼠生存蛋白/muCCL21疫苗免疫小鼠組的早期凋亡比對照高3-4倍。僅編碼鼠生存蛋白的疫苗稍微引發(fā)凋亡，但僅比對照高1倍。但是，在24小時時，只在鼠生存蛋白/muCCL21疫苗免疫小鼠中觀測到凋亡急劇增加85％，這提示CTL誘導的強烈腫瘤細胞免疫觸發(fā)本事件。
實施例20.制備編碼鼠生存蛋白和H60的DNA疫苗含全長鼠NKG2D配體-H60的質粒由Drs.A.Diefenbach和D.H.Raulet(University of California，Berkeley，CA)惠贈。如上所述在pBudCE4.1(Invitrogen)上構建表達載體。
如前文所述，通過電穿孔用DNA疫苗質粒轉化雙減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(S.typhimurium)(AroA-、dam-)。簡而言之，在冰上于0.1cm小杯中混合新鮮制備的處于對數(shù)生長中期的細菌(約1×108個)和質粒DNA(1-2μg)，以約2.0KV、25μF和100Ω電穿孔。培養(yǎng)具有DNA疫苗載體的抗性菌落，在驗證編碼序列后將其儲存于-80℃。
實施例21.用實施例20的疫苗口服接種小鼠和腫瘤攻擊小鼠以2周的間隔，用含具有表達載體的約5×108個雙減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(S.typhimurium)的100μl PBS溶液經口管飼2次免疫BALB/c A2Kb小鼠組(n＝4-12)。預防模式在最后一次接種后2周，治療模式在首次接種前5天，用約1×105個CT-26細胞i.v.攻擊BALB/c小鼠。腫瘤攻擊后25天或28天處死小鼠，分別檢測肺轉移瘤或肺重量，并將其與對照相比。以Student的t檢驗法確定實驗組和對照之間結果差異的統(tǒng)計學顯著性。如果雙尾P值＜0.05，則認為結果是顯著的。
通過轉染293T細胞并用流式細胞儀或蛋白質印跡分析檢驗，證實H60和鼠生存蛋白的表達。H60的表達通過NKG2D四聚體陽性染色證實。根據(jù)預測分子量約16.5KDa處的單一條帶所示，生存蛋白轉染的細胞測試為陽性。CT-26表達的NKG2D配體水平比陽性對照Yac-1細胞低。先前報道了NKG2D配體表達水平低的腫瘤細胞不能誘導腫瘤排斥。在預防模式中，在腫瘤攻擊后25天處死小鼠后評價肺重量和轉移瘤記分(如上文所述)。結果示于表5和表6。數(shù)據(jù)顯示，單獨的H60和鼠生存蛋白疫苗在一定程度上保護小鼠，而H60和鼠生存蛋白組合(鼠生存蛋白/H60疫苗)顯著增強抗腫瘤攻擊的保護，證據(jù)是肺轉移瘤記分明顯降低，腫瘤負擔縮小。這些結果與PBS、pBud、pH60和p鼠生存蛋白對照組相比具有統(tǒng)計學顯著性(分別為p＜0.0001、0.002、0.01和0.005)。
在治療模式(即抗已經建立的結腸癌轉移瘤)中，在第28天處死小鼠后評價肺部腫瘤負荷。值得注意的是，H60/鼠生存蛋白疫苗處理的12只小鼠中有8只存活，更重要的是，這些存活小鼠有2只完全沒有轉移瘤，而另外2只融合轉移瘤覆蓋的肺表面積少于5％。相比之下，空pBud載體處理的對照組僅有2只小鼠存活，融合轉移瘤覆蓋了所有存活小鼠超過50％的肺表面積。在治療模式中，僅用鼠生存蛋白疫苗接種沒有產生任何顯著的保護作用，僅用H60疫苗接種只具有最低限度的治療作用。后者的依據(jù)是存活率稍微提升，其中一只存活小鼠融合轉移瘤覆蓋肺的表面積僅僅小于5％。
表5.免疫接種后用CT-26細胞攻擊的BalB/C小鼠的轉移腫
表6.免疫接種前用CT-26細胞攻擊的BalB/C小鼠的轉移瘤
實施例22.細胞毒性實驗如前文所述，用標準51Cr-釋放實驗檢測細胞毒性。簡而言之，在最后一次免疫后2周收集脾細胞，在補加10％FBS、L-谷氨酰胺、15mM HEPES、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、2-ME和20U/ml重組IL-2(PeproTech，Rocky Hill，NJ)的RPMI 1640中，用照射(1,000Gy)過的CT-26細胞于37℃體外刺激5天。收集脾細胞，用Lympholyte-M細胞分離培養(yǎng)基(Cedarlane Laboratories Limited，Hornby，Ontario，Canada)分離。用51Cr于室溫標記靶細胞約1.5小時，于37℃將靶細胞與各種E/T比率的效應細胞溫育約4小時。以式[(E-S)/(T-S)]×100計算特異性靶細胞裂解的百分率，其中E是平均實驗釋放，S是平均自發(fā)釋放，而T是平均總釋放。
發(fā)現(xiàn)H60疫苗免疫小鼠的NK活性顯著增強，甚至高于在鼠生存蛋白/H60疫苗免疫小鼠中觀測到的NK殺傷活性。鼠生存蛋白/H60疫苗免疫小鼠的脾細胞顯示最高的抗CT-26靶細胞的細胞毒性，相反，分離自pBud免疫對照的這種脾細胞顯示出最小的細胞毒性殺傷作用，而H60疫苗或鼠生存蛋白接種小鼠自身的脾細胞顯示出稍微高的細胞毒性殺傷作用。細胞培養(yǎng)5天后，NK細胞似乎在此細胞毒性實驗中沒有起主要作用，因為在使用Yac-1NK靶細胞時沒有觀測到顯著的差異，提示檢測到的細胞毒性作用主要由CTL介導。
在不偏離本發(fā)明新特征的精神和范圍的情況下，可對上述實施方案進行各種變化和改變。本文描述的具體實施方案沒有也不應推測其有限制作用。
序列表<110>Xiaug，RongZhou，HeReisfeld，Ralph A.
The Scripps Research Institute<120>抗腫瘤生長的DNA疫苗及其使用方法<130>TSRI-874.1<150>60/457,009<151>2003-03-24<160>29<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1643<212>DNA<213>智人<400>1agatttgaat cgcgggaccc gttggcagag gtggcggcgg cggcatgggt gccccgacgt 60tgccccctgc ctggcagccc tttctcaagg accaccgcat ctctacattc aagaactggc 120ccttcttgga gggctgcgcc tgcaccccgg agcggatggc cgaggctggc ttcatccact 180gccccactga gaacgagcca gacttggccc agtgtttctt ctgcttcaag gagctggaag 240gctgggagcc agatgacgac cccatagagg aacataaaaa gcattcgtcc ggttgcgctt 300tcctttctgt caagaagcag tttgaagaat taacccttgg tgaatttttg aaactggaca 360gagaaagagc caagaacaaa attgcaaagg aaaccaacaa taagaagaaa gaatttgagg 420aaactgcgaa gaaagtgcgc cgtgccatcg agcagctggc tgccatggat tgaggcctct 480ggccggagct gcctggtccc agagtggctg caccacttcc agggtttatt ccctggtgcc 540accagccttc ctgtgggccc cttagcaatg tcttaggaaa ggagatcaac attttcaaat 600tagatgtttc aactgtgctc ttgttttgtc ttgaaagtgg caccagaggt gcttctgcct 660gtgcagcggg tgctgctggt aacagtggct gcttctctct ctctctctct tttttggggg 720ctcatttttg ctgttttgat tcccgggctt accaggtgag aagtgaggga ggaagaaggc 780agtgtccctt ttgctagagc tgacagcttt gttcgcgtgg gcagagcctt ccacagtgaa 840tgtgtctgga cctcatgttg ttgaggctgt cacagtcctg agtgtggact tggcaggtgc 900ctgttgaatc tgagctgcag gttccttatc tgtcacacct gtgcctcctc agaggacagt 960ttttttgttg tgtttttttt tttttttttt ggtagatgca tgacttgtgt gtgatgagag 1020aatggagaca gagtccccgg ctcctctact gtttaacaac atggctttct tattttgttt 1080
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權利要求
1.一種適于激發(fā)抗腫瘤細胞的免疫應答的DNA疫苗，所述疫苗在藥物可接受載體中含有有效編碼至少一種癌癥相關凋亡抑制家族蛋白(IAP-家族蛋白)和至少一種免疫活性基因產物的DNA構建物。
2.權利要求1的DNA疫苗，其中所述癌癥相關IAP-家族蛋白選自生存蛋白和livin蛋白。
3.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA有效編碼選自以下的生存蛋白(a)具有SEQ ID NO2氨基酸殘基序列的野生型人生存蛋白；(b)其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO2至少80％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物；(c)具有SEQ ID NO23氨基酸殘基序列的人生存蛋白剪接變體；(d)具有SEQ ID NO24氨基酸殘基序列的人生存蛋白剪接變體；和(e)結合MHC I類分子并由細胞毒性T細胞識別的生存蛋白片段。
4.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼具有SEQ ID NO2氨基酸殘基序列的野生型人生存蛋白。
5.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼具有SEQ ID NO23氨基酸殘基序列的人生存蛋白剪接變體。
6.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼具有SEQ ID NO24氨基酸殘基序列的人生存蛋白剪接變體。
7.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO2至少80％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物。
8.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO2至少90％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物。
9.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO2至少95％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物。
10.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼選自以下的livin蛋白(a)具有SEQ ID NO27氨基酸殘基序列的全長野生型人livinα剪接變體；(b)具有SEQ ID NO29氨基酸殘基序列的人livinβ剪接變體；(c)其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO27至少80％相同的全長野生型人livin的免疫原性同源物；(d)其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO29至少80％相同的野生型人livinβ剪接變體的免疫原性同源物；和(e)結合MHCI類分子并由細胞毒性T細胞識別的livin蛋白片段。
11.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼具有SEQ ID NO27氨基酸殘基序列的人livin剪接變體。
12.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼具有SEQ ID NO29氨基酸殘基序列的人livin剪接變體。
13.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO27或SEQ ID NO29至少80％相同的野生型人生存蛋白的免疫原性同源物。
14.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO27或SEQ ID NO29至少90％相同的野生型人livin的免疫原性同源物。
15.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效編碼其氨基酸殘基序列與SEQ ID NO27或SEQ ID NO29至少95％相同的野生型人livin的免疫原性同源物。
16.權利要求l的DNA疫苗，其中所述由DNA構建物有效編碼的免疫活性基因產物是細胞因子或天然殺傷細胞表面受體的配體。
17.權利要求16的DNA疫苗，其中所述細胞因子選自趨化因子、血細胞生成素、干擾素、天然殺傷細胞刺激因子和誘導細胞因子產生的因子。
18.權利要求17的DNA疫苗，其中所述細胞因子是人CCL21。
19.權利要求16的DNA疫苗，其中所述由DNA構建物有效編碼的天然殺傷細胞表面受體的配體是應激誘導性蛋白，所述應激誘導性蛋白選自人MICA、人MICB、人ULBP1、人ULBP2和人ULBP3。
20.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效整合入質粒載體中。
21.權利要求1的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效整合入減毒細菌載體中。
22.權利要求21的DNA疫苗，其中所述減毒細菌載體選自減毒的鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhi)、志賀氏菌(Shigella)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬、乳桿菌(lactobacillus)屬、卡介苗(BCG)、大腸桿菌(Escherichia coli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、彎曲桿菌(Campylobacter)屬和李斯特氏菌(Listeria)屬。
23.權利要求21的DNA疫苗，其中所述減毒細菌載體是減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)。
24.權利要求23的DNA疫苗，其中所述減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)是AroA-鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
25.權利要求23的DNA疫苗，其中所述減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)是AroA-、dam-鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
26.權利要求1的DNA疫苗，其中所述有效編碼癌癥相關IAP-家族蛋白的DNA構建物包含選自以下的多核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO26和SEQ ID NO28。
27.權利要求26的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效整合入減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)載體中。
28.權利要求1的DNA疫苗，其中所述有效編碼免疫活性基因產物的DNA構建物包含選自以下的多核苷酸序列SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQID NO17、SEQ ID NO19和SEQ ID NO21。
29.權利要求28的DNA疫苗，其中所述DNA構建物有效整合入減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)載體中。
30.一種在哺乳動物中抑制腫瘤生長的方法，所述方法包括以下步驟給予哺乳動物有效免疫應答激發(fā)量的DNA疫苗，所述DNA疫苗在藥物可接受載體中含有有效編碼癌癥相關IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物的DNA構建物，所述哺乳動物籍此表現(xiàn)出由疫苗激發(fā)的腫瘤細胞特異性免疫應答。
31.權利要求30的方法，其中所述由DNA構建物編碼的癌癥相關IAP-家族蛋白選自生存蛋白和livin蛋白。
32.權利要求30的方法，其中所述由DNA構建物編碼的免疫活性基因產物是細胞因子或天然殺傷細胞表面受體的配體。
33.權利要求30的方法，其中所述哺乳動物是人。
34.權利要求30的方法，其中所述DNA構建物有效整合入減毒細菌載體中。
35.權利要求34的方法，其中所述減毒細菌載體選自減毒的鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphi)、志賀氏菌(Shigella)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬、乳桿菌(Lactobacillus)屬、卡介苗(BCG)、大腸桿菌(Escherichia coli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、彎曲桿菌(Campylobacter)屬和李斯特氏菌(Listeria)屬。
36.權利要求34的方法，其中所述減毒細菌載體是減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)。
37.權利要求36的方法，其中所述減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)是AroA-鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
38.權利要求36的方法，其中所述減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)是AroA-、dam-鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
39.一種包括權利要求1的疫苗的制品，所述疫苗包裝在密封無菌容器中，所述容器上粘貼有標簽，標簽上印有疫苗標識資料，并提供對將所述疫苗給予患者的個人來說有用的信息。
40.一種分離的質粒載體，所述質粒載體包含有效編碼癌癥相關IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物的DNA構建物。
41.一種用載體轉染的轉化宿主細胞，所述載體包含有效編碼癌癥相關IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物的DNA構建物。
42.一種免疫接種哺乳動物抗癌癥的方法，所述方法包括以下步驟給予哺乳動物有效免疫應答激發(fā)量的DNA疫苗，該DNA疫苗在藥物可接受載體中含有有效編碼癌癥相關IAP-家族蛋白和免疫活性基因產物的DNA構建物，所述哺乳動物籍此表現(xiàn)出由疫苗激發(fā)的腫瘤細胞特異性免疫應答。
43.權利要求42的方法，其中所述由DNA構建物編碼的癌癥相關IAP-家族蛋白選自生存蛋白和livin蛋白。
44.權利要求42的方法，其中所述由DNA構建物編碼的免疫活性基因產物是細胞因子和天然殺傷細胞表面受體的配體。
45.權利要求42的方法，其中所述哺乳動物是人。
46.權利要求42的方法，其中所述DNA構建物有效整合入減毒細菌載體中。
47.權利要求46的方法，其中所述減毒細菌載體選自減毒的鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphi)、志賀氏菌(shigella)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬、乳桿菌(Lactobacillus)屬、卡介苗(BCG)、大腸桿菌(Escherichia coli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、彎曲桿菌(Campylobacter)屬和李斯特氏菌(Listeria)屬。
48.權利要求46的方法，其中所述減毒細菌載體是減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)。
49.權利要求48的方法，其中所述減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)是AroA-鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
50.權利要求49的方法，其中所述減毒鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)是AroA-、dam-鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)菌株。
全文摘要
適于激發(fā)抗癌癥細胞的免疫應答的DNA疫苗在藥物可接受載體中含有有效編碼癌癥相關凋亡抑制家族蛋白(IAP－家族蛋白)和免疫活性基因產物的DNA構建物，其中所述免疫活性基因產物例如為細胞因子或天然殺傷細胞表面受體的配體。優(yōu)選的細胞因子是CCL21。優(yōu)選的天然殺傷細胞表面受體的配體包括人MICA、人MICB、人ULBP1、人ULBP2和人ULBP3。癌癥相關凋亡抑制物(IAP)－家族蛋白優(yōu)選為生存蛋白或livin蛋白。本發(fā)明還描述了通過給予哺乳動物本發(fā)明疫苗來抑制腫瘤生長的方法。
文檔編號C07H21/00GK1791433SQ200480013556
公開日2006年6月21日 申請日期2004年3月24日 優(yōu)先權日2003年3月24日
發(fā)明者R·香, H·周, R·A·賴斯菲爾德 申請人:斯克里普斯研究學院