專利名稱：輔助放射線治療的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于輔助放射線治療的藥物組合物。
背景技術(shù)：
癌癥是目前我國十大死因之首，是國內(nèi)醫(yī)療上的重大問題，醫(yī)界都在積極地發(fā)展治療方式或發(fā)現(xiàn)新藥來克制癌癥。其中，放射治療成為最佳的非侵入性癌癥治療方法，對器官組織不會造成外科手術(shù)的破壞，且本身具有一定的治療效果，不用考慮測試藥物產(chǎn)生不可預(yù)知的作用；因此，放射治療可以成功地應(yīng)用在治療不同種類的癌癥，放射治療可單獨使用，或配合手術(shù)、化學(xué)治療使用，減少癌癥的局復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。然而在放射治療進(jìn)行時，不單只有癌細(xì)胞受損傷及死亡，照射范圍內(nèi)的正常細(xì)胞亦會受影響而出現(xiàn)副作用；結(jié)合化學(xué)治療時，所引起的副作用可能會更大。放射治療最常見的副作用就是惡心、嘔吐、疲倦、皮膚反應(yīng)、白血球或血小板數(shù)目下降、食欲不振，這些癥狀在治療身體任何部位都會發(fā)生。另外，局部反應(yīng)可能的副作用包括頭頸部放療后引起口干、口腔黏膜發(fā)炎、急性中耳炎；胸腔放射治療后引起肺纖維化、肺炎；腹部和骨盆腔放射治療后引起的腹瀉、大小腸的放射性腸炎和膀胱炎，上述這些反應(yīng)甚至可能造成功能喪失的慢性副作用。放療的副作用常導(dǎo)致病人生理上的極度不適，大大的降低生活質(zhì)量，致使有些換紙無法完成療程而選擇放棄治療。因此尋求各種可能增加療效與減輕副作用的輔助性療法為目前放射醫(yī)學(xué)的當(dāng)務(wù)之急；其中，健康食品應(yīng)用在癌癥放射治療過程中，藉以減緩病人的不適，并提高治愈機會，成為醫(yī)學(xué)發(fā)展的一種新趨勢。樟芝，學(xué)名為Antrodia camphorate (Zang & Su) S. -H ffu, Ryvarden & T. T. Chang,又稱為Antrodia cinnamomea,屬于臺灣國寶級的珍貴藥用真菌,經(jīng)常被應(yīng)用于養(yǎng)生保健的用途，一般民間對于樟芝的稱呼有樟燕、牛樟燕、牛樟芝或紅樟芝，民間尚有樟燕、樟郝、樟內(nèi)菇、牛樟芝、紅樟、紅樟芝等稱呼，是臺灣特有的菇菌類，全世界只生長在臺灣山區(qū)海拔450-1500米之間的牛樟樹干腐朽的心材內(nèi)壁或枯死倒伏的牛樟木材陰暗潮濕的表面，非常的珍貴稀少，因此又被稱為臺灣森林中的寶石。樟芝為臺灣特有藥用菇，傳統(tǒng)民俗療法為保肝治癌的高效藥方。傳統(tǒng)上通過經(jīng)驗得知有關(guān)樟芝成份中含有的多糖體可活化細(xì)胞、改善體質(zhì)，增強人體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)，其中另一主要有效成份——三萜類化合物，應(yīng)用于抗癌或抗發(fā)炎及具有保肝功能的鏟平，亦已在市場行銷中廣為認(rèn)可，因而樟芝有藥用真菌之王的美
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于輔助放射線治療的藥物組合物，所述藥物組合物包含有效劑量的樟芝或樟芝萃取物，所述藥物組合物具有抑制放射線引起的正常細(xì)胞死亡以及加速放射線治療后的腫瘤細(xì)胞死亡的效果。本發(fā)明所述放射線包含業(yè)界熟知的慣用光射線光源，例如鈷60 ;所述放射線照射強度優(yōu)選5Gy/分鐘，照射劑量為10-40Gy，優(yōu)選20Gy。
本發(fā)明所述的正常細(xì)胞為排出腫瘤細(xì)胞的一切體細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞包括但不局限于大腸癌細(xì)胞或乳癌細(xì)胞。更進(jìn)一步地，本發(fā)明所述樟芝或其萃取物具有抑制免疫細(xì)胞的IL-12 a、IL_4或TREM-I基因表現(xiàn)，以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的IL-I β、iNOS或TNF基因表現(xiàn)的作用。本發(fā)明所述樟芝萃取物，包括但不限于樟芝菌絲體萃取物、樟芝子實體萃取物、以及樟芝發(fā)酵液。本發(fā)明所述藥物組合物，進(jìn)一步包含藥物上可接受的佐劑、載體或賦形劑。適當(dāng)?shù)乃幬镙d體可包含惰性成分，所述惰性成分不會與本發(fā)明的化合物發(fā)生實質(zhì)反應(yīng)。用于口服施藥的適當(dāng)藥物載體包含例如無菌水、生理食鹽水、抑菌食鹽水(包含約O. 9% mg/ml苯基醇的食鹽水)、磷酸緩沖液食鹽水、漢克溶液、林格式乳糖液及其它相似載體。用于口服藥物，可依照現(xiàn)有技術(shù)，將其制作成粉末狀、顆粒狀、錠狀、液狀、膠狀或膏狀。本發(fā)明的藥物 組合物可以食品、飲品、藥品、試劑或營養(yǎng)補充品的形式提供，或是藉由靜脈、肌肉、上皮、腹腔、吸入、口含、口服、經(jīng)皮等途徑施用。本發(fā)明所述的有效劑量，指該化合物劑量在提供給一對象后能獲得有益的效果；或者，該化合物的劑量能在體內(nèi)或體外獲得預(yù)期的活性。以本發(fā)明為例，抑制正常細(xì)胞死亡的有效樟芝或樟芝萃取物的濃度為50 μ g/ml至200 μ g/ml,較佳地為100 μ g/ml至150 μ g/ml ;加速腫瘤細(xì)胞死亡的有效樟芝或樟芝萃取物的濃度為50 μ g/ml至200 μ g/ml。本發(fā)明的輔助放射線治療的藥物組合物，在其對于免疫細(xì)胞的放射線保護(hù)力試驗中，以100 μ g/ml及150 μ g/ml樟芝粉末共同培養(yǎng)24與48小時后，均有減緩放射線對細(xì)胞傷害的效果，抑制幅度約為37-56%。而樟芝粉末作用時間的長短對保護(hù)效應(yīng)的影響，則可由樟芝粉末作用48小時后的50 μ g/ml組才出現(xiàn)免疫細(xì)胞放射線抗性得到證實。至于在腫瘤細(xì)胞抑制效果方面，結(jié)果顯示樟芝粉末并不影響放射線對HT-29大腸癌細(xì)胞的毒殺作用，甚至對放射線敏感性較強的BT-474細(xì)胞有增強放射線毒殺效應(yīng)的協(xié)同效果。


圖I為本發(fā)明試驗所用樟芝粉末的制作過程示意圖。圖2為有效放射線劑量的示意圖。圖3為樟芝粉末處理24小時后,樟芝作用有效濃度的不意圖。圖4為樟芝粉末處理24小時后經(jīng)放射線作用，樟芝作用有效濃度的示意圖。圖5為樟芝粉末共同培養(yǎng)24與48小時后的免疫細(xì)胞的不意圖。圖6為樟芝粉末共同培養(yǎng)24與48小時后的免疫細(xì)胞抑制率的不意圖。圖7為樟芝粉末共同培養(yǎng)24與48小時后的HT-29細(xì)胞數(shù)的示意圖。圖8為樟芝粉末共同培養(yǎng)24與48小時后的HT-29細(xì)胞抑制率的示意圖。圖9為樟芝粉末共同培養(yǎng)24與48小時后的BT-474細(xì)胞的示意圖。圖10為樟芝粉末共同培養(yǎng)24與48小時后的BT-474細(xì)胞抑制率的示意圖。圖11為樟芝粉末共同培養(yǎng)24小時后的免疫細(xì)胞，IL-12 a、IL-4和TREM-I基因表現(xiàn)倍率的關(guān)系示意圖。圖12為樟芝粉末共同培養(yǎng)48小時后的免疫細(xì)胞，IL-12 a、IL-4和TREM-I基因表現(xiàn)倍率的關(guān)系示意圖。
圖13為樟芝粉末共同培養(yǎng)24小時后的免疫細(xì)胞，CCL2、ILlO和IL_6基因表現(xiàn)倍率的關(guān)系不意圖。 圖14為樟芝粉末共同培養(yǎng)48小時后的免疫細(xì)胞，CCL2、ILlO和IL_6基因表現(xiàn)倍率的關(guān)系不意圖。圖15為樟芝粉末共同培養(yǎng)24小時后的免疫細(xì)胞，IL-I β、iNOS和TNF基因表現(xiàn)倍率的關(guān)系示意圖。圖16為樟芝粉末共同培養(yǎng)48小時后的免疫細(xì)胞，IL-I β、iNOS和TNF基因表現(xiàn)
倍率意圖。圖17為樟芝粉末共同培養(yǎng)24小時后的HT-29細(xì)胞，IL-I β、iNOS和TNF基因表現(xiàn)倍率不意圖。圖18為樟芝粉末共同培養(yǎng)48小時后的HT-29細(xì)胞，IL-I β、iNOS和TNF基因表現(xiàn)倍率不意圖。圖19為樟芝粉末共同培養(yǎng)24小時后的BT-474細(xì)胞，IL-HiNOS和TNF基因表現(xiàn)倍率不意圖。圖20為樟芝粉末共同培養(yǎng)48小時后的BT-474細(xì)胞，IL-I β、iN0S和TNF基因表現(xiàn)倍率不意圖。圖21為樟芝粉末共同培養(yǎng)48小時后，不同細(xì)胞對輻射照射作用誘發(fā)粒線體膜電位變化(內(nèi)質(zhì)性細(xì)胞凋亡路徑)的示意圖。其中，圖2、3 和 4 中，* ;# = P < O. 05 ;** ；## = p < O. 01 ;*** ；### = p < O. 001 ；
圖 5 和 6 中，* = P < O. 05 ;** = P < O. 01 ;圖 9 和 10 中，* = P < O. 05 ;圖 21 顯示流式細(xì)胞儀試驗的結(jié)果，右下框中的數(shù)字為顯著變化表現(xiàn)的細(xì)胞比例(% )。
具體實施例方式一、樟芝的制備樟芝經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生樟芝發(fā)酵濃縮液，樟芝生產(chǎn)過程如附圖I所不。本發(fā)明米用樟芝濃縮酶凍干粉以及樟芝菌絲體所混合制成的樟芝粉末。其中有效產(chǎn)品所包含的活性成分包括多糖體、胺基丁酸(GABA)、類超氧化物歧化酶(SOD like)、腺苷、植物固醇等。二、小鼠的脾臟免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的制備將小鼠處死后取脾臟，以Iml針筒及23G針頭用含初生小牛血清(fetalcalfserum, FCS, Sigma)的 RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI+5% FCS, Sigma)沖出脾臟細(xì)胞。之后吸取細(xì)胞懸浮液至15ml離心管，于4°C、1800rpm離心3分鐘，倒去上清液后加入紅血球溶解緩沖液(RBC lysis buffer，O. 15M氯化銨+LOmM碳酸氫鉀+0. ImM乙二胺四乙酸二鈉)以溶解紅血球，經(jīng)離心后以RPMI懸浮細(xì)胞液備用。三、試驗設(shè)計及分組I X IO6個脾臟免疫細(xì)胞與不同濃度樟芝共同培養(yǎng)24或48小時后，給予60Co —次照射20Gy放射線劑量，之后即收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)套組(cell countingkit-8 ；CCK8 ；Dojindo Molecular Technologies, Inc. , Rockville,MD)存活率染色試驗。另組經(jīng)同樣處理的細(xì)胞則在收集后分成兩部分，分別加入TrizolRNA核酸抽取劑(TRlzol Reagent,Invitrogen)冷凍保存,并用流式細(xì)胞儀檢測，以供后續(xù)RNA核酸及蛋白質(zhì)的表現(xiàn)測定用。上述兩組體外試驗均分別以未處理細(xì)胞作為正常對照組，以僅用鈷60照射的細(xì)胞作為陽性對照 組。另分別以大腸癌(HT-29)及乳癌(BT-474)細(xì)胞株，兩種具有不同放射線敏感性的腫瘤細(xì)胞經(jīng)上述相同過程處理，作為樟芝對放射線毒殺腫瘤細(xì)胞反應(yīng)的參考。四、細(xì)胞存活率試驗經(jīng)放射線處理后的細(xì)胞于4°C、1800rpm離心5分鐘，倒去上清液后，移至96孔微量分析盤(Orange Scientific, Belgium)中與分別的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)(5X104cells/100 μ 1/well)，再加入細(xì)胞計數(shù)套組(Cell Counting Kit-8, CCK8, Dojindo,Rockville,Maryland)試劑,靜置于37°C下作用4小時,在405nm波長下以酶免疫微盤分析儀(ELISA reader, Anthos Zenyth 3100, ffals, Aus)檢測存活率。五、純化細(xì)胞的mRNA 與逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription)將IO6細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后于4 °C、3000rpm離心5分鐘，加入Trizol (GIBC0 BRL) Iml后均勻混合，靜置5-10分鐘，加入三氯甲烷0. 2ml后搖晃，于4°C、12000rpm離心15分鐘，取上清液加入異丙醇0. 5ml后混勻，再于4°C、12000rpm離心10分鐘，倒去上清液之后以75%酒精清洗RNA沉淀，完全移去上清液，以焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA沉淀，以分光光度計測RNA濃度及260/280比率。取定量的樣本RNA于70°C下作用5分鐘，以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，再加入MuMLV RT buffer, 2. 5mM dNTP (BRL)，0. IMDTT(BRL),Rnasin(Promaga),MuMLV RTase,六聚物(hexamers)與焦碳酸二乙酯水配成總體積25 μ I混合液，于37 V反應(yīng)60分鐘后于90°C作用5分鐘使酶去活化，加入175 μ I滅菌水溶解cDNA。六、實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(Real-Time Quantitativereversetranscriptase polymerase cain reaction, Q-PCR)依照實驗基因表現(xiàn)量進(jìn)行校正，將樣本cDNA進(jìn)行不同比例稀釋。取4μ I稀釋的cDNA作為模板，加入1μ I IOOnM Trem-I引子(primer)及5μ I實時熒光定量PCR試劑(SYBR Green PCR Master Mix, Bio-Rad),總反應(yīng)體積為 10 μ I。反應(yīng)條件50°C,2min ；95°C, IOmin ;95°C，15sec ;60°C，lmin，進(jìn)行45個循環(huán)，PCR產(chǎn)物以iQ5及時聚合酶連鎖反應(yīng)檢測系統(tǒng)(iQ5 Real-Time PCRDetection System, Bio-Rad)檢測，并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算其分子數(shù)。七、流式細(xì)胞儀分析所需抗體細(xì)胞凋亡Annexin V-FITC (BD Pharmingen , San Jose, CA), PE RabbitAnti-ActiveCaspase-3 (CPP32, BD Pharmingen , San Jose, CA) JC-I 粒腺體膜電位檢測套組(Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit,BD Pharmingen ,San Jose,CA)。八、流式細(xì)胞儀偵測細(xì)胞表面與細(xì)胞內(nèi)蛋白試驗將IO6細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液清洗后于4°C、3000rpm離心5分鐘，倒去上清液，加入2. 4G2阻斷性(Blocking)單株抗體100 μ 1，靜置冰上作用20分鐘；加入磷酸鹽緩沖液清洗后離心，倒去上清液，以特殊熒光染色的單株抗體50 μ I靜置冰上作用60分鐘，以磷酸鹽緩沖液清洗后離心，最后加入Iml磷酸鹽緩沖液懸浮細(xì)胞液，再利用FACSort (流速細(xì)胞儀)測定樣本中不同類型細(xì)胞的熒光強度，并以分析軟件(Cell Quest TM)進(jìn)行分析。胞內(nèi)染色則加入 0. 5ml 細(xì)胞固定及通透液(BD Cytofix/Cytoperm , BD Pharmingen)后，于 4°C下作用30min,之后離心丟棄上清液,加入IX的細(xì)胞通透清洗液(BD Perm/Wash Buffer,BDPharmingen)清洗，之后步驟則與細(xì)胞表面染色相同。實施例I確定放射線傷害劑量與條件最優(yōu)化首先將免疫細(xì)胞分別以平均劑量5Gy/min的6tlCo照射共10、20及40Gy的放射線劑量，并在之后5分鐘及I小時測試其存活率。結(jié)果如圖2所顯示，在IOGy照射后的I小時，細(xì)胞數(shù)量有較明顯的下降(P < O. 01);而20及40Gy照射后5分鐘及I小時的細(xì)胞存活率則均呈現(xiàn)顯著下降(P < O. 001)，因此在之后實驗均選擇20Gy為有效作用劑量。另外進(jìn)行樟芝粉末作用最優(yōu)化劑量篩選試驗，將10、100及1000 μ g/ml樟芝作用24小時后，經(jīng)放射 線照射及未照射的組別分別進(jìn)行存活率觀察。圖3顯示較高劑量100及1000 μ g/ml樟芝粉末作用即影響免疫細(xì)胞存活率(P < O. 01);然而經(jīng)樟芝粉末作用再以放射線照射的免疫細(xì)胞則顯示，僅100 μ g/ml樟芝粉末作用后能有效提升細(xì)胞對放射線的保護(hù)力(P < O. 01)(圖4)。因此后續(xù)實驗以100 μ g/ml左右為有效劑量范圍。實施例2樟芝粉末減緩放射線細(xì)胞毒性的評估本發(fā)明中分別評估50、100、150及200 μ g/ml樟芝粉末作用24及48小時后，對放射線引發(fā)細(xì)胞傷害的保護(hù)性；正常細(xì)胞為陰性對照組，經(jīng)放射線照射之細(xì)胞為陽性對照組。結(jié)果如圖5和6所顯示，脾臟免疫細(xì)胞經(jīng)放射線照射后存活率均有下降，而以100及150 μ g/ml樟芝粉末共同培養(yǎng)24與48小時后的免疫細(xì)胞，對放射線的抗性均有明顯增加。樟芝粉末作用24小時后以100 μ g/ml組的減緩放射線傷害效用最高達(dá)44% (p < O. 05);作用48小時后則更以150 μ g/ml組高達(dá)56%的放射線抗性為最佳(p < O. 01)。且作用48小時后50 μ g/ml的樟芝粉末即影響免疫細(xì)胞對放射線的抗性增加(P < O. 05)，然而200 μ g/ml組的效果反而不明顯；顯示其100-150μ g/ml可能為其減緩放射線傷害效用的有效范圍。圖7、8、9和10則顯示進(jìn)一步以腫瘤細(xì)胞測樟芝粉末對放射線影響的效應(yīng)，圖7和8顯示樟芝粉末并不影響放射線對HT-29大腸癌細(xì)胞的毒殺作用，樟芝粉末作用24小時后僅50 μ g/ml組有些許上升，然并無統(tǒng)計上的差異，其余各組以及作用48小時的組別則均無顯著變化。另外BT-474乳癌細(xì)胞的實驗結(jié)果則顯示，樟芝粉末非但不影響放射線對腫瘤細(xì)胞的毒殺作用，甚至增強放射線作用的效果，在作用48小時后的200μ g/ml組對放射線毒殺效應(yīng)有明顯的加成，加成效應(yīng)高達(dá)92% (P < O. 05)(圖9、10)。實施例3樟芝粉末調(diào)節(jié)放射線照射后細(xì)胞的基因表現(xiàn)評估本發(fā)明進(jìn)一步以實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(real-time PCR)分析細(xì)胞激素表現(xiàn)的結(jié)果，所檢測的基因及其功能如下表I所列表I
Rnl8s ref gene，線粒體功能相關(guān) GAPDH ref gene,基本代謝酶
權(quán)利要求
1.一種輔助放射線治療的藥物組合物，所述藥物組合物具有抑制放射線引起的正常細(xì)胞死亡或加速放射線照射后的腫瘤細(xì)胞死亡的效果，其特征在于包含有效劑量的樟芝或樟芝萃取物。
2.如權(quán)利要求I所述的輔助放射線治療的藥物組合物，其特征在于所述樟芝或樟芝萃取物包含樟芝粉末或樟芝菌絲體。
3.如權(quán)利要求I所述的輔助放射線治療的藥物組合物，其特征在于所述放射線劑量為IOGy 至 40Gy。
4.如權(quán)利要求I所述的輔助放射線治療的藥物組合物，其特征在于所述正常細(xì)胞為免疫細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求I所述的輔助放射線治療的藥物組合物，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為大腸癌細(xì)胞或乳癌細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求I所述的輔助放射線治療的藥物組合物，其特征在于抑制正常細(xì)胞死亡的樟芝或樟芝萃取物的有效劑量為50 μ g/ml至200 μ g/ml。
7.如權(quán)利要求6所述的輔助放射線治療的藥物組合物，其特征在于抑制正常細(xì)胞死亡的樟芝或樟芝萃取物的有效劑量為100 μ g/ml至150 μ g/ml。
8.如權(quán)利要求I所述的輔助放射線治療的藥物組合物，其特征在于加速腫瘤細(xì)胞死亡的樟芝或樟芝萃取物的有效劑量為50 μ g/ml至200 μ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于輔助放射線治療的藥物組合物，所述藥物組合物包含有效劑量的樟芝或其萃取物。所述藥物組合物具有抑制放射線引起的正常細(xì)胞死亡或加速放射線照射后的腫瘤細(xì)胞死亡的效果。
文檔編號A61P35/00GK102813680SQ20111016553
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者鄭柏青, 羅彩月, 黃俊智 申請人:麗豐實業(yè)股份有限公司