專利名稱：一種用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法。
背景技術(shù)：
豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)是一種危害嚴(yán)重的動物病毒，它引起的豬瘟每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前世界上主要采用弱毒活疫苗免疫來防治豬瘟，以控制豬瘟的流行。在異源原代細(xì)胞中增殖的豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株)是目前我國主要的弱毒疫苗。C株是我國五十年代經(jīng)兔體傳代選育出的一株具有良好免疫保護(hù)力的疫苗株。由于該疫苗株性能穩(wěn)定、安全、保護(hù)性好，是國際上公認(rèn)最好也是應(yīng)用最為廣泛的疫苗株。由于應(yīng)用的需要，我國豬瘟病毒的疫苗生產(chǎn)也由兔脾淋疫苗、全乳兔疫苗逐步過渡到用組織培養(yǎng)生產(chǎn)的細(xì)胞疫苗。為避免豬體可能帶有的病原體(包括病毒)對疫苗質(zhì)量的影響，目前生產(chǎn)上使用牛睪丸或羊腎細(xì)胞增殖豬瘟兔化弱毒疫苗。由于我國牛群中病毒性腹瀉病毒(BVDV)的感染率很高，幾乎是100%，因此用牛睪丸細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟疫苗，易造成細(xì)胞外源病毒污染，且病毒滴度不高，生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定，疫苗批次之間的差異大，嚴(yán)重影響了疫苗的質(zhì)量；同樣，使用羊腎細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟疫苗，由于羊群中可能存在邊界病毒(BDV)，也存在同樣的隱患。牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、羊邊界病毒 (BDV)與豬瘟病毒(HCV)同屬于黃病毒科瘟病毒屬，三種病毒之間有較密切的抗原性與血清學(xué)關(guān)系，能互相誘導(dǎo)一定程度的同源病毒抗體，使用污染了 BVDV或BDV的豬瘟細(xì)胞疫苗給豬只免疫接種后，BVDV或BDV會對豬瘟疫苗的免疫產(chǎn)生干擾作用，能抑制豬瘟抗體的產(chǎn)生，引起嚴(yán)重的后果。國內(nèi)一些研究單位和動物疫苗生產(chǎn)廠家嘗試使用細(xì)胞系生產(chǎn)豬瘟疫苗，從一定程序上可以避免外源病毒污染，提高免疫效果，但是傳代細(xì)胞存在致瘤的可能性，用于豬瘟疫苗的生產(chǎn)有潛在的食品安全上的危險。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，提供一種用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法。該方法生產(chǎn)工藝簡單、易操作，病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控，可顯著提高疫苗質(zhì)量。利用本發(fā)明生產(chǎn)的豬瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，對豬瘟強(qiáng)毒攻擊能產(chǎn)生完全的免疫保護(hù)作用。本發(fā)明的用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其步驟包括制苗用細(xì)胞的選擇、制苗用細(xì)胞的制備、細(xì)胞毒種的繁殖、制苗毒液的繁殖、配苗，分裝及凍干，其具體步驟如下1、制苗用細(xì)胞的選擇為健康乳兔或成年兔的腎臟或睪丸；2、制苗用細(xì)胞的制備(1)兔腎(或兔睪丸)的采集和處理先以常水泡濕兔毛，取出后浙干，再放入新潔爾滅液中浸泡30秒鐘，經(jīng)體表消毒后，移入無菌室，以無菌手術(shù)采取兔腎(或兔睪丸)，
4迅速放入含400IU/ml青霉素和400 μ g/ml鏈霉素的漢克氏液中，浸泡30分鐘，再用無菌操作除去被膜、腎盂、腎盞、附睪，組織稱重后，將其剪成1 2mm小塊，用漢克氏液反復(fù)沖洗， 至上清液清亮為止；(2)消化將組織塊移入消化瓶中，兔腎加入5 6倍(兔睪丸加入6 8倍)組織質(zhì)量體積比的0. 25%胰酶溶液，塞緊瓶口，置37°C水浴消化60分鐘。消化過程中，每隔 10分鐘輕搖消化瓶一次，直到組織塊周圍出現(xiàn)棉絮狀時，輕取消化瓶，棄上清，再沿瓶壁緩緩注入漢克氏液(含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素)，輕洗2次，以除去殘存胰酶；(3)細(xì)胞分散加入生長液，以玻璃珠振搖法分散細(xì)胞。輕搖消化瓶十五次，靜止， 待組織沉淀后，將上清細(xì)胞懸液經(jīng)過管道流入已加生長液的內(nèi)裝有四層紗布袋的收集瓶中。如此反復(fù)分散3 4次。(4)細(xì)胞分裝和培養(yǎng)將收集瓶中的細(xì)胞懸液充分搖勻后，分裝于培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加生長液至瓶容積的1/10，塞緊瓶口，繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于接種病毒(兔腎細(xì)胞) 或繼續(xù)傳代(兔睪丸細(xì)胞)。(5)細(xì)胞傳代兔睪丸原代細(xì)胞長成單層后，用EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化，以 (1 3) (1 5)制成次代細(xì)胞懸液，以細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于接種病毒。(6)細(xì)胞檢驗(yàn)細(xì)胞用于接毒前，按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版) 附錄40 44、49頁進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體、外源病毒生長。3、細(xì)胞毒種的繁殖用細(xì)胞維持液，將新鮮脾毒制成病毒懸液接種生長良好的上述細(xì)胞單層，繼續(xù)培養(yǎng)；每隔4 5日收獲換液一次，取二收、三收細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種；細(xì)胞毒種的鑒定細(xì)胞毒種鑒定須完全符合《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)豬瘟兔化弱毒株毒種標(biāo)準(zhǔn)，對豬完全無副作用，每Iml細(xì)胞毒種含病毒 ^ 500, 000個家兔感染量；4、制苗毒液的繁殖取已形成良好單層細(xì)胞的上述細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去細(xì)胞生長液， 接種含豬瘟兔化弱毒的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)；接毒后第5日作第一次收獲換液，以后每隔4日收獲換液1次，收獲的毒液置_15°C以下保存；制苗毒液的檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)附錄42 44,49頁進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體生長。細(xì)胞毒液對豬完全無副作用，各收次病毒培養(yǎng)液分別用家兔測定，每Iml含病毒> 500，000個家兔感染量；5、配苗、分裝及凍干將檢驗(yàn)合格的病毒培養(yǎng)液，混合于同一容器中，加入穩(wěn)定劑， 同時加入抗生素，充分搖勻，定量分裝，每頭份含細(xì)胞毒液不少于0. 015ml，分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥后即得成品。成品檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合 “豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)”的規(guī)定，對豬完全無副作用，每頭份疫苗含病毒> 7500個家兔感染量。本發(fā)明是用豬瘟兔化弱毒株接種兔源細(xì)胞，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成的豬瘟活疫苗。上述技術(shù)方案中，步驟2、3、4中所述的細(xì)胞培養(yǎng)溫度是36 37. 5°C。
上述技術(shù)方案中，步驟2中所用生長液的配方是90% 92%乳漢液、8% 10% 犢牛血清、加適宜抗生素，pH值調(diào)整為7. 0 7. 2。上述技術(shù)方案中，步驟3、4中所用維持液的配方是90% 98%乳漢液、2% 4% 犢牛血清或8 10%馬血清、加適宜抗生素，pH值調(diào)整為7. 2 7. 4。上述技術(shù)方案中，步驟3中所述的接種量為含0. 3% 0. 5%脾毒種的維持液。上述技術(shù)方案中，4中所述的接種量為含3% 5%生產(chǎn)用細(xì)胞毒種或0. 2% 0.3%脾毒種的維持液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)用兔源易感細(xì)胞替代牛睪丸細(xì)胞或羊腎細(xì)胞制造豬瘟活疫苗，可解決牛、羊源外源病毒污染的問題，通過原材料和培養(yǎng)條件的嚴(yán)格控制，保證生產(chǎn)出來的疫苗純粹，確保疫苗的安全性；(2)用兔源易感細(xì)胞替代傳代細(xì)胞系制造豬瘟活疫苗，可避免傳代細(xì)胞系可能致瘤的隱患，疫苗的安全性更高；(3)采用本發(fā)明培養(yǎng)的豬瘟細(xì)胞毒液病毒含量高，可比現(xiàn)有疫苗的抗原滴度高出 10倍以上。用高滴度的抗原制造的豬瘟活疫苗可以大大提高疫苗的免疫效力，經(jīng)免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，對豬瘟強(qiáng)毒攻擊可產(chǎn)生100%保護(hù)。


圖1是本發(fā)明的制備流程圖。 具體實(shí)施例以下結(jié)合說明書附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例11、制苗用細(xì)胞的選擇為健康乳兔或成年兔的腎臟；2、制苗用細(xì)胞的制備(1)兔腎的采集和處理先以常水泡濕兔毛，取出后浙干，再放入新潔爾滅液中浸泡30秒鐘，經(jīng)體表消毒后，移入無菌室，以無菌手術(shù)采取兔腎，迅速放入含400IU/ml青霉素和400 μ g/ml鏈霉素的漢克氏液中，浸泡30分鐘，再用無菌操作除去被膜、腎盂、腎蓋， 組織稱重后，將其剪成1 2mm小塊，用漢克氏液反復(fù)沖洗，至上清液清亮為止；(2)消化將組織塊移入消化瓶中，加入5 6倍兔腎質(zhì)量體積比的0. 25%胰酶溶液，塞緊瓶口，置37°C水浴消化60分鐘。消化過程中，每隔10分鐘輕搖消化瓶一次，直到組織塊周圍出現(xiàn)棉絮狀時，輕取消化瓶，棄上清，再沿瓶壁緩緩注入漢克氏液(含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素)，輕洗2次，以除去殘存胰酶；(3)細(xì)胞分散加入生長液，以玻璃珠振搖法分散細(xì)胞。輕搖消化瓶十五次，靜止， 待組織沉淀后，將上清細(xì)胞懸液經(jīng)過管道流入已加生長液的內(nèi)裝有四層紗布袋的收集瓶中。如此反復(fù)分散3 4次。(4)細(xì)胞分裝和培養(yǎng)將收集瓶中的細(xì)胞懸液充分搖勻后，分裝于培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加生長液至瓶容積的1/10，塞緊瓶口，置37. 5°C繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于接種病毒。 一般情況下，每5 7克兔腎組織可制備IOOOml原代細(xì)胞懸液。
(5)細(xì)胞檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)附錄40 44、 49頁進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體、外源病毒生長。3、細(xì)胞毒種的繁殖用細(xì)胞維持液，將新鮮脾毒制成0.3%的病毒懸液，接種生長良好的兔腎細(xì)胞單層，置37. 5°C繼續(xù)培養(yǎng)；每隔4 5日收獲換液一次，取二收、三收細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種；細(xì)胞毒種的鑒定細(xì)胞毒種鑒定須完全符合《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)豬瘟兔化弱毒株毒種標(biāo)準(zhǔn)，對豬完全無副作用，每Iml細(xì)胞毒種含病毒 ^ 500, 000個家兔感染量；4、制苗毒液的繁殖取已形成良好單層細(xì)胞的上述細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去生長液，接種含3%生產(chǎn)用細(xì)胞毒種或0. 2%脾毒種的維持液，置37. 5°C繼續(xù)培養(yǎng)；接毒后第5日作第一次收獲換液，以后每隔4日收獲換液1次，收獲的毒液置_15°C以下保存；制苗毒液的檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)附錄42 44,49頁進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體生長。細(xì)胞毒液對豬完全無副作用，各收次病毒培養(yǎng)液分別用家兔測定，每Iml含病毒> 500，000個家兔感染量；5、配苗、分裝及凍干將檢驗(yàn)合格的病毒培養(yǎng)液，混合于同一容器中，加入穩(wěn)定劑， 同時加入抗生素，充分搖勻，定量分裝，每頭份含細(xì)胞毒液不少于0. 015ml，分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥后即得成品。成品檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合 “豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)”的規(guī)定，對豬完全無副作用，每頭份疫苗含病毒> 7500個家兔感染量。上述所用生長液的配方是92%乳漢液、8%犢牛血清、加適宜抗生素，pH值調(diào)整為 7. 2。上述所用維持液的配方是98%乳漢液、2%犢牛血清、加適宜抗生素，pH值調(diào)整為 7.4。實(shí)施例21、制苗用細(xì)胞的選擇為健康乳兔或成年兔的睪丸；2、制苗用細(xì)胞的制備(1)兔睪丸的采集和處理先以常水泡濕兔毛，取出后浙干，再放入新潔爾滅液中浸泡30秒鐘，經(jīng)體表消毒后，移入無菌室，以無菌手術(shù)采取兔睪丸，迅速放入含400IU/ ml青霉素和400μ g/ml鏈霉素的漢克氏液中，浸泡30分鐘，再用無菌操作除去被膜、附睪， 組織稱重后，將其剪成1 2mm小塊，用漢克氏液反復(fù)沖洗，至上清液清亮為止；(2)消化將組織塊移入消化瓶中，加入6 8倍兔睪丸組織質(zhì)量體積比的0. 25% 胰酶溶液，塞緊瓶口，置37°C水浴消化60分鐘。消化過程中，每隔10分鐘輕搖消化瓶一次，直到組織塊周圍出現(xiàn)棉絮狀時，輕取消化瓶，棄上清，再沿瓶壁緩緩注入漢克氏液(含 200IU/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素)，輕洗2次，以除去殘存胰酶；(3)細(xì)胞分散加入生長液，以玻璃珠振搖法分散細(xì)胞。輕搖消化瓶十五次，靜止， 待組織沉淀后，將上清細(xì)胞懸液經(jīng)過管道流入已加生長液的內(nèi)裝有四層紗布袋的收集瓶中。如此反復(fù)分散3 4次。(4)細(xì)胞分裝和培養(yǎng)將收集瓶中的細(xì)胞懸液充分搖勻后，分裝于培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加生長液至瓶容積的1/10，塞緊瓶口，36 °C繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時用于傳代。一般情況下， 每2克組織可制備IOOOml原代細(xì)胞懸液。(5)細(xì)胞傳代兔睪丸原代細(xì)胞長成單層后，用EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化，以 (1 3) (1 5)制成次代細(xì)胞懸液，以細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于接種病毒。(6)細(xì)胞檢驗(yàn)細(xì)胞用于接毒前，按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版) 附錄40 44、49頁進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體、外源病毒生長。3、細(xì)胞毒種的繁殖用細(xì)胞維持液，將新鮮脾毒制成0. 4%的病毒懸液，接種生長良好的上述細(xì)胞單層，置36°C繼續(xù)培養(yǎng)；每隔4 5日收獲換液一次，取二收、三收細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種；細(xì)胞毒種的鑒定細(xì)胞毒種鑒定須完全符合《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)豬瘟兔化弱毒株毒種標(biāo)準(zhǔn)，對豬完全無副作用，每Iml細(xì)胞毒種含病毒 ^ 500, 000個家兔感染量；4、制苗毒液的繁殖取已形成良好單層細(xì)胞的上述細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去細(xì)胞生長液， 接種含4%生產(chǎn)用細(xì)胞毒或0.3%脾毒種的維持液，置36°C繼續(xù)培養(yǎng)；接毒后第5日作第一次收獲換液，以后每隔4日收獲換液1次，收獲的毒液置_15°C以下保存；制苗毒液的檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)附錄42 44,49頁進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體生長。細(xì)胞毒液對豬完全無副作用，各收次病毒培養(yǎng)液分別用家兔測定，每Iml含病毒> 500，000個家兔感染量；5、配苗、分裝及凍干將檢驗(yàn)合格的病毒培養(yǎng)液，混合于同一容器中，加入穩(wěn)定劑， 同時加入抗生素，充分搖勻，定量分裝，每頭份含細(xì)胞毒液不少于0. 015ml，分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥后即得成品。成品檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合 “豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)”的規(guī)定，對豬完全無副作用，每頭份疫苗含病毒> 7500個家兔感染量。上述所用生長液的配方是90%乳漢液、10%犢牛血清、加適宜抗生素，pH值調(diào)整為 7. 0。上述所用維持液的配方是92%乳漢液、8%馬血清、加適宜抗生素，pH值調(diào)整為 7. 2。為了驗(yàn)證本發(fā)明制備得到的豬瘟活疫苗病毒含量高，可以大大提高疫苗的免疫效力，特進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。一、豬瘟活疫苗(兔腎或兔睪丸細(xì)胞源)與豬瘟活疫苗(牛睪丸細(xì)胞源)的比較研究報告1、材料1.1試驗(yàn)疫苗本發(fā)明的豬瘟活疫苗(兔腎或兔睪丸細(xì)胞源)，批號試 201001 (兔腎細(xì)胞源)、試201002 (兔腎細(xì)胞源)、試201003 (兔睪丸細(xì)胞源)。1.2對照疫苗豬瘟活疫苗(牛睪丸細(xì)胞源)，購于市場，批號201001、201003、 201004。1. 3試驗(yàn)用兔體重1. 5 3. OKg的健康家兔，購于江蘇南京某兔場。
8
1. 4試驗(yàn)用豬經(jīng)中和試驗(yàn)方法檢測無豬瘟抗體的健康易感斷奶豬，購于江蘇省某豬場。注苗前觀察5 7日，每日上下午各測溫一次，挑選體溫、精神、食欲正常者使用。1. 5效檢強(qiáng)毒豬瘟病毒石門系強(qiáng)毒。2、方法和結(jié)果2.1物理性狀檢驗(yàn)肉眼觀察疫苗物理性狀。兩組疫苗(各3批)均為乳白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。2. 2無菌檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)附錄42 44 頁進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組疫苗(各3批)均無菌生長。2. 3支原體檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)附錄49進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組疫苗(各3批)均無支原體生長。2.4鑒別檢驗(yàn)將疫苗分別用滅菌生理鹽水稀釋成每Iml毫升含100個兔的最小感染量的病毒懸液，與等量的抗豬瘟病毒特異性血清充分混合，置10 15°C中和1小時， 其間振搖2 3次。同時設(shè)立陽性對照組(病毒對照)和陰性對照組(生理鹽水)。中和結(jié)束后，分別接種家兔2只，每兔耳靜脈注射1ml，測溫方法及體溫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)同效力檢驗(yàn)項(xiàng)。 結(jié)果，除陽性對照組出現(xiàn)熱反應(yīng)外，兩組疫苗(各3批)在接種后120小時內(nèi)均未出現(xiàn)熱反應(yīng)。2. 5外源病毒檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)附錄40 42頁進(jìn)行，兩組疫苗(各3批)均無外源病毒污染。2. 6安全檢驗(yàn)用滅菌生理鹽水將疫苗稀釋成每Iml含6頭份疫苗，每批疫苗分別肌肉注射健康易感豬4頭，每頭5ml (含30個使用劑量)。接種后，每日上下午各測體溫觀察一次，觀察21日。按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)“豬瘟活疫苗(兔源)”中“安全檢驗(yàn)”(2)項(xiàng)進(jìn)行判定，結(jié)果見表1。2.7效力檢驗(yàn)2. 7. 1用家兔效檢用滅菌生理鹽水將每頭份疫苗稀釋750倍、1500倍、3000倍、 7500倍、10000倍，每個稀釋度分別耳靜脈注射家兔2只，每只1ml。接種后，上下午各測體溫一次，48小時后，每隔6小時測體溫一次，根據(jù)體溫反應(yīng)和攻毒結(jié)果進(jìn)行綜合判定。按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)“豬瘟活疫苗(兔源)”中“效力檢驗(yàn)”⑴項(xiàng)進(jìn)行判定，結(jié)果見表2。2. 7. 3用豬效檢將每頭份豬瘟活疫苗(兔腎或兔睪丸細(xì)胞源)稀釋3000倍，每頭份豬瘟活疫苗(牛睪丸細(xì)胞源)稀釋300倍，分別肌肉注射無豬瘟中和抗體的健康易感豬4頭，每頭1ml。14日后，連同條件相同的對照豬3頭，注射豬瘟石門系血毒Iml (IO5最小致死量)，觀察16日。結(jié)果見表3。2. 8剩余水分檢測按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)附錄38頁進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組疫苗(各3批)均符合規(guī)定。2. 9真空度測定按《中華人民共和國獸藥典(三部)》(2010年版)附錄48頁進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組疫苗(各3批)均符合規(guī)定。表1安全檢驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于包括以下技術(shù)步驟(1)制苗用細(xì)胞的選擇為健康乳兔或成年兔的腎臟或睪丸；(2)制苗用細(xì)胞的制備A)兔腎(或兔睪丸)的采集和處理先以常水泡濕兔毛，取出后浙干，再放入新潔爾滅液中浸泡30秒鐘，經(jīng)體表消毒后，移入無菌室，以無菌手術(shù)采取兔腎(或兔睪丸)，迅速放入含400IU/ml青霉素和400 μ g/ml鏈霉素的漢克氏液中，浸泡30分鐘，再用無菌操作除去被膜、腎盂、腎盞、附睪，組織稱重后，將其剪成1 2mm小塊，用漢克氏液反復(fù)沖洗，至上清液清亮為止；B)消化將組織塊移入消化瓶中，兔腎加入5 6倍(兔睪丸加入6 8倍)組織質(zhì)量體積比的0. 25%胰酶溶液，塞緊瓶口，置37°C水浴消化60分鐘。消化過程中，每隔10分鐘輕搖消化瓶一次，直到組織塊周圍出現(xiàn)棉絮狀時，輕取消化瓶，棄上清，再沿瓶壁緩緩注入漢克氏液(含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素)，輕洗2次，以除去殘存胰酶；C)細(xì)胞分散加入生長液，以玻璃珠振搖法分散細(xì)胞。輕搖消化瓶十五次，靜止，待組織沉淀后，將上清細(xì)胞懸液經(jīng)過管道流入已加生長液的內(nèi)裝有四層紗布袋的收集瓶中。如此反復(fù)分散3 4次。D)細(xì)胞分裝和培養(yǎng)將收集瓶中的細(xì)胞懸液充分搖勻后，分裝于培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加生長液至瓶容積的1/10，塞緊瓶口，繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于接種病毒(兔腎細(xì)胞)或繼續(xù)傳代(兔睪丸細(xì)胞)E)細(xì)胞傳代兔睪丸原代細(xì)胞長成單層后，用EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化，以 (1 3) (1 5)制成次代細(xì)胞懸液，以細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于接種病毒。(3)細(xì)胞毒種的繁殖用細(xì)胞維持液，將新鮮脾毒制成病毒懸液接種生長良好的上述細(xì)胞單層，繼續(xù)培養(yǎng)；每隔4 5日收獲換液一次，取二收、三收細(xì)胞培養(yǎng)毒液作為生產(chǎn)用毒種；(4)制苗毒液的繁殖取已形成良好單層細(xì)胞的上述細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去細(xì)胞生長液，接種含豬瘟兔化弱毒的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)；接毒后第5日作第一次收獲換液，以后每隔4日收獲換液1次，收獲的毒液置_15°C以下保存；(5)配苗、分裝及凍干將檢驗(yàn)合格的病毒培養(yǎng)液，混合于同一容器中，加入穩(wěn)定劑，同時加入抗生素，充分搖勻，定量分裝，每頭份含細(xì)胞毒液不少于0. 015ml，分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥后即得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于步驟(2)、(3)、(4)中所述的細(xì)胞培養(yǎng)溫度是36 37.5°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于步驟(2) 中所用生長液的配方是90% 92%乳漢液、8% 10%犢牛血清、加適宜抗生素，pH值調(diào)整為7. 0 7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于步驟(3)、(4)中所用維持液的配方是90% 98 %乳漢液、2 % 4 %犢牛血清或8 10 %馬血清、加適宜抗生素，PH值調(diào)整為7. 2 7. 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于步驟(3)中所述的接種量為含0. 3% 0. 5%脾毒種的維持液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其特征在于步驟(4) 中所述的接種量為含3% 5%生產(chǎn)用細(xì)胞毒種或0. 2% 0. 3%脾毒種的維持液。
全文摘要
本發(fā)明的用兔源細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，其步驟包括制苗用細(xì)胞的選擇、制苗用細(xì)胞的制備、細(xì)胞毒種的繁殖、制苗毒液的繁殖、配苗，分裝及凍干，其特征在于用兔源易感細(xì)胞替代牛睪丸或羊腎細(xì)胞制造豬瘟活疫苗，可解決牛源和羊源外源病毒污染的問題，通過原材料和培養(yǎng)條件的嚴(yán)格控制，保證生產(chǎn)出來的疫苗純粹，確保疫苗的安全性和有效性；還在于用兔源易感細(xì)胞替代傳代細(xì)胞系制造豬瘟活疫苗，可避免傳代細(xì)胞系可能致瘤的隱患，疫苗的安全性更高。由于采用本發(fā)明培養(yǎng)的豬瘟細(xì)胞毒液病毒含量高，可比現(xiàn)有疫苗的抗原滴度高出10倍及以上，可以大大提高疫苗的免疫效力，克服了現(xiàn)行疫苗臨床使用中的缺點(diǎn)。
文檔編號A61K39/187GK102327610SQ201110288660
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月27日
發(fā)明者吳旋, 柯浩 申請人:南京創(chuàng)啟生物科技有限公司