專(zhuān)利名稱(chēng)：一種采用振蕩式生物反應(yīng)器制備豬瘟活疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗制備領(lǐng)域，具體地，涉及采用振蕩式生物反應(yīng)器制備豬瘟活疫苗的方法。
背景技術(shù)：
豬痕(classical swine fever, CSF)最早發(fā)生于1833年美國(guó)的俄亥俄州，初稱(chēng)豬霍亂，1903年被證明病原體是一種病毒，歐洲 則稱(chēng)之為古典豬瘟。我國(guó)最早1925年在東南大學(xué)農(nóng)科院有免疫血清方面的研究報(bào)告。豬瘟是世界范圍內(nèi)豬的最嚴(yán)重的疾病之一，因而被OIE (國(guó)際獸醫(yī)局)列為A類(lèi)傳染病，我國(guó)也將其列為一類(lèi)傳染病。其病原為豬瘟病毒(CSFV)，屬黃病毒科瘟病毒屬成員。以出血和發(fā)熱為主要特征，是一種對(duì)豬危害極大的傳染病。當(dāng)前使用的豬瘟疫苗均是用兔化弱毒疫苗(HCLV，即著名的C株，或中國(guó)株)，根據(jù)生產(chǎn)工藝的不同分為豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)，即豬瘟細(xì)胞苗；豬瘟活疫苗(兔源)，即豬瘟組織苗，豬瘟組織苗又根據(jù)生產(chǎn)用成年兔還是乳兔分為豬瘟脾淋苗和豬瘟乳兔苗。世界公認(rèn)的中國(guó)C株兔化弱毒的突出優(yōu)點(diǎn)是，用其接種的豬不產(chǎn)生病毒血癥和腦炎病變，可以安全地免疫接種任何懷孕期的母豬和哺乳仔豬，不影響受精率及存活率，不引起流產(chǎn)、死胎，可安全地用于建立種豬群(Tesmer等，1973)。常用的還有日本GPE株、法國(guó)Thiverval株等都是廣泛應(yīng)用的CSFV疫苗株，一般均可提供終生免疫。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶法制備豬瘟活疫苗的工藝其不足在于存在外源污染的危險(xiǎn)，產(chǎn)毒滴度較低；單位體積內(nèi)有效工作細(xì)胞數(shù)量較低；效率低下，批次間差異大，穩(wěn)定性差。因此開(kāi)發(fā)研制新型制備豬瘟疫苗的方法是提高病毒產(chǎn)量和節(jié)約成本的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供穩(wěn)定高效制備豬瘟活疫苗的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明提供一種采用振蕩式生物反應(yīng)器制備豬瘟活疫苗的方法，包括下列步驟(I)培養(yǎng)制苗用細(xì)胞將制苗用細(xì)胞接種到含有細(xì)胞培養(yǎng)液與微載體的生物反應(yīng)器罐內(nèi)，啟動(dòng)細(xì)胞吸附程序，振蕩式吸附3 4h后或細(xì)胞吸附率達(dá)80%以上時(shí)，轉(zhuǎn)化為細(xì)胞培養(yǎng)程序，進(jìn)行振蕩式細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至I. 5X IO8 3X IO8個(gè)/g微載體時(shí)，停止培養(yǎng)；(2)繁殖制苗毒液將豬瘟病毒懸液接種于步驟(I)培養(yǎng)的細(xì)胞中，倒置吸附0. 5 Ih后，進(jìn)行振蕩式病毒培養(yǎng)，每I 2d收獲病毒液，并及時(shí)更換維持液,收獲次數(shù)為15 20次，匯總收獲的病毒液；(3)將經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒液澄清過(guò)濾，加入凍干保護(hù)劑，充分混勻后定量分裝，凍干，即得到豬瘟活疫苗。
本發(fā)明方法所用的生物反應(yīng)器為BelloCell型振蕩式細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器主要由主體機(jī)臺(tái)、控制器及培養(yǎng)瓶組成。工作過(guò)程如下主體機(jī)臺(tái)由步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)可上下移動(dòng)薄板平臺(tái)。當(dāng)平臺(tái)上升時(shí)，BelloCell-500內(nèi)下方伸縮瓶中之培養(yǎng)基擠壓至上瓶身，而使得載體浸潤(rùn)于培養(yǎng)基中，讓細(xì)胞進(jìn)行所需養(yǎng)分和廢棄物的交換；當(dāng)平臺(tái)下降時(shí)，培養(yǎng)基則再次回流至下方伸縮瓶，使載體暴露于空氣中，讓氧氣快速交換，形成良好的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。本發(fā)明方法步驟(I)中生物反應(yīng)器罐內(nèi)BioNoc II微載體密度為llg/L，接入細(xì)胞量為I X 107/g IX 108/g微載體。使用的微載體為多孔性不織布，微載體數(shù)量為865±5%個(gè)，約為5. 5g，約占IOml的空間，可提供細(xì)胞生長(zhǎng)面積約達(dá)2400cm2/g。所述微載體為網(wǎng)狀和/或片狀。所述步驟(I)振蕩式細(xì)胞吸附程序參數(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)微載體的上升速度為I. Omm/s，頂端停留25s，下降速度為I. Omm/s，底端停留Os ;振蕩式細(xì)胞培養(yǎng)程序參數(shù)為細(xì) 胞培養(yǎng)液通過(guò)微載體的上升速度為1.5mm/s,頂端停留Os,下降速度為1.5mm/s,底端停留60s。本發(fā)明步驟⑵中接種10% 20%豬瘟兔化弱毒株細(xì)胞毒種或I % 2%豬瘟兔化弱毒株脾毒種，所述百分比為毒種與病毒培養(yǎng)液的體積比。所述豬瘟兔化弱毒株細(xì)胞毒種病毒滴度為每Iml含病毒> 100000個(gè)家兔感染量。所述豬瘟兔化弱毒株脾毒種病毒滴度為每Iml含病毒> 100000個(gè)家兔感染量。其中步驟(2)振蕩式病毒培養(yǎng)參數(shù)為病毒培養(yǎng)液通過(guò)微載體的上升速度為I. Omm/s,頂端停留IOs ;病毒培養(yǎng)液通過(guò)微載體的下降速度I. Omm/s,底端停留30s。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況進(jìn)行反應(yīng)器控制參數(shù)的調(diào)整。本發(fā)明步驟(2)病毒培養(yǎng)后獲得的病毒液每Iml含病毒> 1000000個(gè)家兔感染量。本發(fā)明制苗用細(xì)胞為PK15細(xì)胞系。本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)液為含5% 8%胎牛血清的DMEM，病毒培養(yǎng)液、維持液為含I 2%胎牛血清的MEM，pH值為7. 0 7. 4。本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的條件為溫度為36. 5 37°C，CO2濃度1% 5%。本發(fā)明方法步驟(3)中所述的凍干保護(hù)劑為5%蔗糖脫脂牛奶。本發(fā)明提供了上述方法在制備豬瘟活疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述方法制備得到的豬瘟活疫苗。本發(fā)明提供了一種采用振蕩式生物反應(yīng)器制備豬瘟活疫苗的方法，其有益效果在于I)本發(fā)明方法生產(chǎn)的豬瘟病毒毒價(jià)高，兔體熱反應(yīng)含量比用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)的豬瘟病毒高約10倍，按照《中華人民共和國(guó)獸藥典(2010版)》方法對(duì)制得的疫苗進(jìn)行無(wú)菌、支原體、鑒別、外源病毒、安全、效力等各項(xiàng)檢驗(yàn)，均符合中規(guī)定；2)應(yīng)用振蕩式微載體反應(yīng)器培養(yǎng)PK15細(xì)胞的豬瘟病毒工藝，微載體提供了更大的細(xì)胞貼壁表面積，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高，可以隨時(shí)觀察細(xì)胞在載體表面的生長(zhǎng)情況，高培養(yǎng)密度PK15細(xì)胞能提高病毒滴度，本方法隨時(shí)監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)或病毒繁殖時(shí)的最佳生化條件，且每批反應(yīng)器生產(chǎn)上清的病毒滴度均一，培養(yǎng)基利用率高，病毒收獲過(guò)程不復(fù)雜，疫苗批次間差異小、質(zhì)量穩(wěn)定；3)采用本發(fā)明振蕩式細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，與傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)相比，細(xì)胞培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，培養(yǎng)時(shí)不產(chǎn)生剪切力與氣泡，細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境良好；4)本發(fā)明方法的培養(yǎng)系統(tǒng)占用空間小，且操作勞動(dòng)強(qiáng)度小，減小污染環(huán)節(jié)，使其具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。


圖I為細(xì)胞接種2天時(shí)微載體上細(xì)胞的顯微照片，箭頭所指為微載體上的細(xì)胞；圖2為病毒接種5天時(shí)微載體上細(xì)胞的顯微照片，箭頭所指為微載體上的細(xì)胞；圖3為振蕩式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的生物反應(yīng)器為美國(guó)賽宇公司的BelloCell型生物反應(yīng)器(主機(jī)臺(tái)BelloStage-3000,控制器，罐體BelloCell-500)，所使用的載體為BioNoc II多孔性不織布，載體數(shù)量為865±5%個(gè)載體，約為5. 5g，約占IOml的空間，可提供細(xì)胞生長(zhǎng)面積約達(dá)2400cm2/g。實(shí)施例中所使用的生物反應(yīng)器主要由主體機(jī)臺(tái)、控制器及培養(yǎng)瓶組成。工作過(guò)程如下主體機(jī)臺(tái)由步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)可上下移動(dòng)薄板平臺(tái)。當(dāng)平臺(tái)上升時(shí)，BelloCell-500內(nèi)下方伸縮瓶中之培養(yǎng)基擠壓至上瓶身，而使得載體浸潤(rùn)于培養(yǎng)基中，讓細(xì)胞進(jìn)行所需養(yǎng)分和廢棄物的交換；當(dāng)平臺(tái)下降時(shí)，培養(yǎng)基則再次回流至下方伸縮瓶，使載體暴露于空氣中，讓氧氣快速交換，形成良好的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I用振蕩式微載體懸浮生物反應(yīng)器規(guī)模生產(chǎn)豬痕病毒(I)I、病毒與細(xì)胞株用于制作豬瘟活疫苗的病毒是豬瘟兔化弱毒株(C株)，來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，經(jīng)過(guò)致病性測(cè)試，本弱毒株病毒不具有致病性(該毒株按照細(xì)胞毒種鑒定完全符合豬瘟兔化弱毒株毒種標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)豬安全無(wú)副作用)。以對(duì)豬瘟兔化弱毒株(C株)具有良好敏感性的豬腎細(xì)胞系(PK15)，作為制苗用細(xì)胞系。2、制備方法2. I制苗用細(xì)胞的培養(yǎng)將制苗用細(xì)胞系PK15細(xì)胞接種到含500mLDMEM液體培養(yǎng)基(包括 8%胎牛血清(FBS)、100UI/mL青霉素、IOOii g/mL鏈霉素 pH7. 2)和 5. 5g BioNoc II載體的罐體內(nèi)；細(xì)胞初始接種量為1.25父107個(gè)細(xì)胞/^微載體。于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，細(xì)胞吸附4h，使其最大量地吸附載體之上。細(xì)胞吸附程序參數(shù)為培養(yǎng)液通過(guò)微載體的上升速度為I. Omm/s，頂端停留25s，下降速度為I. Omm/s，底端停留Os ; ;4h后，細(xì)胞吸附率達(dá)80%以上，切換為細(xì)胞培養(yǎng)程序，使接種細(xì)胞最高效的生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)程序參數(shù)為培養(yǎng)液通過(guò)微載體的上升速度為I. 5mm/s,頂端停留Os,下降速度為I. 5mm/s,底端停留60s。細(xì)胞接種2天時(shí)微載體上細(xì)胞的顯微照片見(jiàn)圖I。2. 2制苗毒液的繁殖于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下，細(xì)胞在載體上生長(zhǎng)4天，細(xì)胞數(shù)達(dá)3 X IO8個(gè)細(xì)胞/g微載體，將兔化弱毒株細(xì)胞毒種或豬瘟兔化弱毒株脾毒種(每Iml含病毒> 100000個(gè)家兔感染量)分別各自按病毒培養(yǎng)液體積的接種于上述細(xì)胞。以MEM為液體培養(yǎng)基(包括I % FBS、100UI/mL青霉素、100 u g/mL鏈霉素，pH7. 2)，倒置吸附Ih后,啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序,即培養(yǎng)液通過(guò)微載體的上升速度為I. Omm/s,持續(xù)IOs ;培養(yǎng)液通過(guò)微載體的下降速度為I. Omm/s，持續(xù)30s。于37°C、5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液，從接毒后的第4天開(kāi)始每天收獲病毒液一次，連續(xù)收獲20次，并置-20°C保存。病毒接種5天時(shí)微載體上細(xì)胞的顯微照片見(jiàn)圖2。本實(shí)施例所使用的振蕩式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖3。收獲病毒液(半成品)的檢驗(yàn)按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010年版)附錄42,49頁(yè)進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體生長(zhǎng)。細(xì)胞毒液對(duì)豬安全無(wú)副作用，各次收獲的病毒液分別用家兔測(cè)定，每Iml含病毒> 1000000個(gè)家兔感染量。 2. 3配苗、分裝及凍干經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒液，混合于同一容器內(nèi)，澄清過(guò)濾后，按I I的比例加入5%蔗糖脫脂乳穩(wěn)定劑，充分搖勻，定量分裝，每頭份含細(xì)胞毒液不少于
0.015mL，分裝凍干后制得成品。成品檢驗(yàn)按照《中華人們共和國(guó)獸藥典》(2010年版)進(jìn)行檢驗(yàn)。以豬瘟細(xì)胞毒、豬瘟脾毒為制苗毒種使用上述方法分別制成3批疫苗，共6批疫苗，豬瘟細(xì)胞毒源的疫苗編號(hào)分別為PK15-1-01、PK15-1-02、PK15-1-03和豬瘟脾毒源的疫苗編號(hào)為 PK15-1-11、PK15-1-12、PK15-1-13。3、結(jié)果3. I半成品檢驗(yàn)制備6批半成品，按照《中華人們共和國(guó)獸藥典》(2010年版)要求進(jìn)行了無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)，6批半成品均未檢出細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒，6批半成品病毒含量達(dá)到100萬(wàn)家兔感染量/mL，是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝生產(chǎn)豬瘟兔化弱疫苗(細(xì)胞源)半成品標(biāo)準(zhǔn)(5萬(wàn)家兔感染量/mL)的20倍。3. 2成品檢驗(yàn)3. 2. I物理性狀檢驗(yàn)制備的6批疫苗，其均為乳白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加入稀釋液后溶解迅速，無(wú)異味。3. 2. 2無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中華人們共和國(guó)獸藥典》(2010年版)附錄42頁(yè)進(jìn)行檢驗(yàn)，所制疫苗均為無(wú)菌生長(zhǎng)。3. 2. 3支原體檢驗(yàn)按照《中華人們共和國(guó)獸藥典》(2010年版)附錄49頁(yè)進(jìn)行檢驗(yàn)，所制疫苗均為無(wú)支原體生長(zhǎng)。3. 2. 4鑒別檢驗(yàn)將疫苗用生理鹽水稀釋成每ml含100個(gè)兔子的最小感染量的病毒懸液，與等量的抗豬瘟病毒特異性血清充分混合，置15°C作用60分鐘，期間振搖2 3次。同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和生理鹽水對(duì)照。中和結(jié)束后，分別接種兔子2只，每只兔子耳靜脈注射I. 0ml，測(cè)溫方法及體溫反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)同效力檢驗(yàn)項(xiàng)。6批疫苗樣品的結(jié)果，除陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)熱反應(yīng)外，其余組在接種后120h內(nèi)均不出現(xiàn)熱反應(yīng)。3. 2. 5外源病毒檢驗(yàn)按照《中華人們共和國(guó)獸藥典》(2010年版)附錄40頁(yè)進(jìn)行檢驗(yàn)，所制疫苗均為無(wú)外源病毒污染。3. 2. 6安全檢驗(yàn)用生理鹽水將疫苗稀釋成6頭份/ml，每批疫苗分別肌注健康易感豬4頭，每頭5ml (含30頭份)。接種后測(cè)溫觀察，按《中華人們共和國(guó)獸藥典》(2010年版)72頁(yè)進(jìn)行。結(jié)果表明各批次試驗(yàn)豬體溫正常，其他體征正常，判斷疫苗合格。
3. 2. 7效力檢驗(yàn)選擇用兔檢驗(yàn)的方法，將疫苗用滅菌生理鹽水稀釋成不同濃度，耳緣靜脈注射體重I. 5 3. Okg的兔子2只，每只I. 0ml，按照《中華人們共和國(guó)獸藥典》(2010年版)72頁(yè)進(jìn)行。疫苗效力檢驗(yàn)合格，每頭份含有15000個(gè)家兔感染量，是傳統(tǒng)豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)疫苗效力標(biāo)準(zhǔn)的20倍，結(jié)果見(jiàn)表I。表I家兔效力檢驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種采用振蕩式生物反應(yīng)器制備豬瘟活疫苗的方法，其特征在于包括下列步驟 1)培養(yǎng)制苗用細(xì)胞 將制苗用細(xì)胞接種到含有細(xì)胞培養(yǎng)液與微載體的生物反應(yīng)器罐內(nèi)，啟動(dòng)細(xì)胞吸附程序，振蕩式吸附3 4h后或細(xì)胞吸附率達(dá)80%以上時(shí)，轉(zhuǎn)化為細(xì)胞培養(yǎng)程序，進(jìn)行振蕩式細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至I. 5X IO8 3X IO8個(gè)/g微載體時(shí)，停止培養(yǎng)； 2)繁殖制苗毒液 將豬瘟病毒懸液接種于步驟I)培養(yǎng)的細(xì)胞中，倒置吸附0. 5 Ih后，進(jìn)行振蕩式病毒培養(yǎng)，每I 2d收獲病毒液,并及時(shí)更換維持液,收獲次數(shù)為15 20次,匯總收獲的病毒液； 3)將經(jīng)檢驗(yàn)合格的病毒液澄清過(guò)濾，加入凍干保護(hù)劑，充分混勻后定量分裝，凍干，即得到豬痕活疫苗。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器為BelloCell型振蕩式細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)生物反應(yīng)器罐內(nèi)BioNocII微載體密度為llg/L，接入細(xì)胞量為IXioVg IXioVg微載體。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)振蕩式細(xì)胞吸附程序參數(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)微載體的上升速度為1.0mm/s,頂端停留25s,下降速度為1.0mm/s,底端停留Os ;振蕩式細(xì)胞培養(yǎng)程序參數(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)微載體的上升速度為I. 5mm/s，頂端停留Os,下降速度為1.5mm/s,底端停留60s。
5.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，步驟2)中接種10% 20%豬瘟兔化弱毒株細(xì)胞毒種或1% 2%豬瘟兔化弱毒株脾毒種，所述百分比為毒種與病毒培養(yǎng)液的體積比。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)振蕩式病毒培養(yǎng)參數(shù)為病毒培養(yǎng)液通過(guò)微載體的上升速度為1.0mm/s,頂端停留IOs ;病毒培養(yǎng)液通過(guò)微載體的下降速度1.0mm/s,底端停留30s。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)病毒培養(yǎng)后獲得的病毒液每Iml含病毒> 1000000個(gè)家兔感染量。
8.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述制苗用細(xì)胞為PK15細(xì)胞系；細(xì)胞培養(yǎng)液為含5% 8%胎牛血清的DMEM，病毒培養(yǎng)液為含I 2%胎牛血清的MEM，pH值為7. 0 7. 4 ;培養(yǎng)溫度為36. 5 37°C, CO2濃度1% 5%。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟3)中所述的凍干保護(hù)劑為5%蔗糖脫脂牛奶。
10.權(quán)利要求1-9任一所述的方法制備的豬瘟活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬瘟活疫苗的制備方法，該方法將制苗用細(xì)胞接種到含有培養(yǎng)液與微載體的振蕩式生物反應(yīng)器中，使細(xì)胞貼附在微載體上。待細(xì)胞密度達(dá)到約108/g微載體時(shí)，接種豬瘟兔化弱毒株，繁殖病毒。收獲病毒液，澄清過(guò)濾后加入凍干保護(hù)劑，充分混勻后定量分裝，凍干，得到豬瘟活疫苗。使用本發(fā)明的制備方法，細(xì)胞生長(zhǎng)快、密度高、可連續(xù)培養(yǎng)和收獲，病毒產(chǎn)量高，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單。優(yōu)于目前使用的傳統(tǒng)制備豬瘟疫苗的方法，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102743748SQ201210181238
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者周建民, 潘春剛, 田宇婧, 馬良 申請(qǐng)人:中牧實(shí)業(yè)股份有限公司